生化实验指导

生物化学实验指导

海洋学院生物化学课程组编

2008年7月22日

目 录

实验室守则 ???????????????????????????????? 2 实验一 糖类的定量测定 ???????????????????????? 4 实验二 薄层层析法分析氨基酸 ????????????????????? 7 实验三 氨基酸含量的测定 ??????????????????????? 9 实验四 酪蛋白的制备 ????????????????????????? 11 实验五 考马斯亮蓝G-250 法测定蛋白质含量 ????????????? 13 实验六 垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳法 ????????????????? 17 实验七 DNA的提取制备 ???????????????????????? 29 实验八 酶活性的测定 ????????????????????????? 33 实验九 过氧化物酶同工酶分析 ????????????????????? 37 海洋学院实验记录的基本要求 ???????????????????????42 实验报告撰写要求 ?????????????????????????????44

实验室守则（试行）

一、安全卫生

1. 所有进入实验室的人员都有监督实验室安全、卫生、仪器操作和维护的义务。 2. 在测定完成后，使用者须做好实验室的清洁工作，将公用物品归还原位， 立即

将所使用过的试验台、实验用品等清洗干净，清除垃圾，并及时归还所借物品。 3. 实验室安全卫生实行值日生制，值日生在每天使用完实验室后进行检查，必须

保持实验室内环境整洁，走道畅通，设备器材摆放整齐。 4. 禁止在实验室吸烟、吃东西、乱抛纸屑杂物。

5. 最后一个离开实验室的人一定要关好水、电、门和窗。

二、仪器使用

1. 严禁在实验台的插孔上使用功率大的电器。

2. 对于功率大的电器，如烘箱、马福炉等，请严格按照要求操作，每天应在晚上

十点前关闭。

3. 烘箱是不锈钢体的，不能将未洗干净的物品放进烘箱。不能用不干净的抹布擦

烘箱。

4. 使用离心机，离心管一定要称重平衡后，对称放置。

5. 天平，特别是万分之一的天平不得任意搬动。使用完毕后应立即清扫天平，以

免化学试剂腐蚀天平。

6. 不能用实验室的分样器、加样枪加强酸或强碱，以免腐蚀。 7. 气瓶内气体不能用尽，必须留有剩余压力(如氧气不少于2 Kg/m2)。 8. 有毒或有腐蚀性气体的实验必须在通风橱内进行。

9. 实验后的废渣、废液，要倒在废渣箱和废液缸中，不准随便倾倒或倒入水池中。

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10. 超净台使用注意事项：保持干净，紫外灯的使用时需遮盖前面板。 11. 冰箱：不得放危险品，或相邻能起化学反应的药品。

三、实验数据及其处理

1. 所有实验室存储的样品、试剂必须如实写好标签，如样品应有样品名称、存放

时间、存放人。配制的试剂应有试剂名称、浓度、配制时间和配制人等。 2. 必须进行至少三次平行实验，以求得标准偏差。数据图须标有误差棒。 3. 实验中，必须如实地记录各种实验数据。实验后，二星期内完成实验结果整理，

正确处理实验数据，不得更改原始数据。

实验一 糖类的定量测定

一、实验目的

香菇，又称香蕈、冬菇，是一种生长在木材上的真菌类，它含有大量的氨基酸等对人体有益的营养物质，还含有很多的多糖。香菇多糖具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫 功能和刺激干扰素形成等功能。本实验学习香菇水溶性糖类的提取及定量测定方法。 二、实验原理

香菇的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。蒽酮比色定糖法是一个快速而方便的定糖方法，在强酸性条件下，游离的或多糖中存在的己糖、戊糖及己糖醛酸（还原性和非还原性）经强酸脱水生成糠醛或羟甲基糠醛，糠醛或羟甲基糠醛与蒽酮反应生成蓝绿色的糠醛衍生物，其颜色的深浅与糖的含量在一定范围内成正比。蒽酮也可以和其他一些糖类发生反应，但显现的颜色不同。当存在含有较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈现红色。上述特定的糖类物质，反应较稳定。

反应式：

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该法特点：灵敏度高，测定量少，快速方便。 三、实验仪器及试剂

1．仪器：分光光度计、电炉、铝锅、20mL刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量。 2．试剂：

（1）2g/L蒽酮试剂：称取2g蒽酮（AR）溶于1000ml的浓硫酸中，当日配置使用。

（2）1％葡萄糖标准液：将分析纯葡萄糖在80℃下烘至恒重，精确称取1.000g。加少量水溶解，移入100mL容量瓶中，加入0.5mL浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。 （3）100ug/ml糖标准液：精确吸取1％葡萄糖标准液1mL加入100mL容量瓶中，加水定容。 四、实验步骤 1．标准曲线的制作：

取20mL刻度试管11支，从0－10分别编号，按表1－1加入溶液和水，加标准糖液0.0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.20、1.60，用水补足至2ml，然后向试管内加入8.00mL 蒽酮试剂，摇匀后迅速浸入冰水浴中冷却，各管加完后一起浸入沸水浴中，管口加盖以防蒸发。自沸水浴重新煮沸起，准确煮沸10分钟取出，用

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自来水冷却，室温放置10分钟左右，于620nm比色。以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。 2．可溶性糖的提取：

取干或新鲜香菇子实体，擦净表面污物，粉碎，称取1.0g，用80-90℃热水30ml，在80-90℃恒温水浴锅中提取30分钟，4000 rpm离心10分钟。收集上清液，沉淀重复提取一次，合并两次上清液，用循环水真空泵抽滤除去漂浮物。吸取滤液1.0ml稀释至100 ml，得待测样液。 3．测定：

吸取2.0mL样品液于试管中（重复2次），向试管内加入8.00mL 蒽酮试剂，摇匀后迅速浸入冰水浴中冷却，各管加完后一起浸入沸水浴中，管口加盖以防蒸发。自沸水浴重新煮沸起，准确煮沸10分钟取出，用自来水冷却，室温放置10分钟左右，于620nm比色。由标准线性方程求出糖的量，按下式计算测试样品中糖含量。 糖的含量＝（C×n×V）/（α×W） 式中：C一标准方程求得糖量（ug）；

n一稀释倍数； V－提取液量（mL）； α一吸取样品液体积（mL）； W一（g）

五、思考题

1、简述苯酚法与蒽酮法测定可溶性糖的基本原理。 2、干扰可溶性糖测定的主要因素有哪些？怎样避免？

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/kg8d.html