大鼠SLC7a8基因的克隆及真核表达载体的构建

目的：克隆大鼠左旋氨基酸转运体(SLC7a8)基因cDNA的读码框(CDS),构建携带SLC7a8基因的重组真核表达载体,为进一步研究其在自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)中的功能作准备。方法：从非高血压大鼠(wistar-kyoto,WKY)肾脏组织提取总RNA,通过RT-PCR得到总cDNA,PCR法扩增,产物连接pGEM-T Easy载体测序分析正确后,再以PCR方法扩增,将其连接入真核表达质

第 41卷第 6期 2 01 1年 1 1月

温

州

医

学

院

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Vo1 . . No 6 41No 2 v. 011

J u na f W e z o e i a le e o r l o n h u M d c lCo l g

■大鼠 S C a基因的克隆及真核表达载体的构建 L T8王本极，黄晓燕，林素，周希，戴晓春，方俊旭，杨德业( . JJ 1温，医学院附属第一医院心内科，温州医学院心血管生物和基因研究所，浙江温Jl 3 5 0 i、 i 200、2温州医学院 .眼视光学院，浙江温州 3 5 0 ) 2 0 0

■

[摘

要]目的：克隆大鼠左旋氨基酸转运体 (L 78 SCa )基因eN的读码框 (D ) DA CS,构建携带SCa基 L78

因的重组真核表达载体，为进一步研究其在自发性高血压大鼠 ( p n a e u l y e t n i e r t, H ) so t n o s y h p r e sv a s S R中的功能作准备。方法：从非高血压大鼠 ( i t rk o o K w sa—y t,W Y)肾脏组织提取总 RA N,通过 R .C得到总 TP R c N,P R法扩增，产物连接 p E— a y DA C G MT E s载体测序分析正确后，再以 P R方法扩增，将其连接入真核表 C达质粒 pD A . ( )以 P R e N 3 1+。 C、双酶切和测序鉴定正确后，将重组载体 p D A .( )S C a cN 3 1+一L 7 8用脂质体包裹转染大鼠肾小管上皮细胞 (R 2 ) TP R法及 W s e n b o t n N K5 E,R—C e tr l t i g法分别检测转染后 S C a R A及 L78mN

蛋白表达水平。结果：成功克隆了大鼠 S C a因c N,重组真核表达载体 p D A .+ S C a构建 L T 8基 DA c N 3 1( )一L T 8成功，且证实转染后肾小管上皮细胞的 S C a R A及蛋白表达均明显高于空白对照组 (< .5 L7 8mN P 0 0 )及空质粒组 ( 00 ) P< .5。结论：成功克隆了S C a L 7 8基因，并构建了真核表达载体 p D A .+ S C a,能够 cN 3 1( ).L 7 8在 N K5 E细胞中获得有效过表达，这为进一步探讨 S C a R一2 L T 8基因的生物学功能奠定了基础。

[词]真核表达载体； L7 8关键 SC a;肾小管上皮细胞；基因；大鼠；克隆 [

中图分类号] R4 .; 7[ 54 1 Q 8文献标识码] A[文章编号] 10- 18(0 1 60 1— 5 00 23 21 )0—5 50C oni g f r S T g ne n l n o at LC a8 e a d co t ns ruc io o e kar ti e r t n f u yo c xp ess on e o W i v ct r ANG Be nji, HU ANG Xiao yan。 LI N Su。 ZHOU Xi。 DAI Xi aochu n, FANG Ju nxu Y ANG Deye. * part nt f De me o

C ard lo io gy, t rst Af l he Fi fi iat ed Hos plt l f W nz a o e hou MeS c co e, I al ll ge nst ut fo C it e r ard - io v asc ar ul Bio gy nd ne f W nz lo a Ge o e hou Me c C le al ol ge. W enz hou. 3 2500 0

O jc v b e ti e: T c o r t L 7 8 e e D A n c n t u t t e k r o i o 1 ne a S C a g n c N a d o s r c i s u a y t ce ress on xp i vec r or ts unc on t to f i f ti s udy n S i HR. Me tho ds:Tot R wa ex act f m al NA s tr ed ro ratkld ney iS e. S t SH LC7 c NA a8 D was pre red pa by RT PC - R, a i nd nse ed nt p M— rt i o GE T Easy ec r v to an d

co nfi med y e r b s que e nal nc a ysi s. The th pG - n e EM T E y as ve cto whi h r c co ai nt ned LC 8 S Ta cD was NA

a s m l f e b P R,a d l n d n o c N 3. ( )p a mi l oa p iid y C n c o e i t p D A 1+ l s d.T e e o b n n p a mi as h r c m i a t l s d wc nfi med y o r b PC R, d ubl e y di st n nal is o e nz me ge io

a ys an DN d A s qu ci e en ng. T n he he t rec mbi an o n t

p a m d c N 3. (一L 7 8 w s r n i n l t a s e t d i t R 2 e l u i g L p f c a l l s i p D A 1+)S C a a t a s e t y r n f c e n o N K 5 E c l s s n i o e t m nTM 00. The 2 0 le vel of xpr e essi n o of LC7 mRN S a8 A a p nd rot n ei was de i nti ed y fi b RT— R PC an dWestern blotti a ng fter t ransfecti on. Results:The c DNA of SLC7 was a8 clone d. and i ts rec omb ant in eu ryot ex ka ic preS on si vec r to was co nst ruct su ed cces full Ov— s y. er exp res on f si o

S Ta m A nd LC 8 RN a pr ei ot n was bs rve i K- 2 ce s tr o e d n NR 5 E ll ans ec d wi C7 8 ne f te th SL a ge as om re c pa d

t h l n o t o e 1 n h e 1 r n f c e i h a m t e t r( o h P< . 5 . o t e b a k c n r l c l s a d t e c l s t a s e t d w t n e p y v c o b t 0 0 )C n l s o T e p D A 1+一L 7 8 e p e s o v c o w s u c s f l y c n t u t d n v r o c u i n: h c N 3. ( )S C a x r s i n e t r a s c e s u l o s r c e a d o e—e ress n xp io of LC7 8 g e n RK一 2E S a en i N 5 ce lls was bt ned. Th rec bi nt o ai e om na eu ry ka oti e c xpr . es

si ve or on ct wi1 be 1 us to nve ed i sti ate he g t bi olo gic rol o SL e f C7a i h

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原发性高血压 ( s e t a y e t n i n E ) e s n i l h p r e s o, H

是一种由遗传因素和环境因素共同作用而引起的多收稿日期：2 l— 5 3 0 0— 0 1基金项目：温州市科技发展计划基金资助项目 ( 2 2 1 2 S 0 A )。 0 3

基因遗传性疾病，是导致脑血管意外和冠状动脉疾

作者简介：王本极 ( 一) 1 86,男，浙江苍南人，硕士生。 9 通讯作者：杨德业，教授，主任医师，博士生导师，E il: m ade Yey ang 1 6 . om。@ 2 c

病的重要危险因素。 2年来的研究发现多巴胺及近 0其受体和影响其信号转导均和高血压密切相关 l】】, _ 2肾脏组织的肉分泌和旁分泌多巴胺对保持血压的动

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