豌豆早期结瘤素基因克隆与凝集素基因psl转化烟草研究

- 1 - 单位代码 10635

学 号

S2005073

硕士学位论文

豌豆早期结瘤素基因克隆与凝集素基因psl

转化烟草研究

论文作者：周小全

指导教师：张兴国 研究员

学科专业：细胞生物学

研究方向：细胞工程

提交论文日期：2008年05月25日

论文答辩日期：2008年05月31日

学位授予单位：西南大学

中 国 重 庆

2008年5月

- 2 -

2008 Master Thesis of Southwest University

Isolation of Early nodulin Genes from Pisum sativum and Introduction of Lectin Gene psl into Nicotiana tobacum

Candidate：Xiaoquan Zhou

Supervisor：Xingguo Zhang

Major：Cell biology

Field：Cell engrneering

College of Horticulture and Landscape Architecture,Southwest University，Beibei，Chongqing，400715，P.R.China

May 2008

- 3 -

- 4 -

独创性声明

学位论文题目：豌豆早期结瘤素基因克隆与凝集素基因psl转化烟草研究

本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。

学位论文作者：签字日期：年月日

学位论文版权使用授权书

本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院（筹）可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。

（保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：□不保密，□保密期限至年月止）。

学位论文作者签名：导师签名：

签字日期：年月日签字日期：年月日

- 5 -

- 6 -

摘要

豌豆早期结瘤素基因克隆与凝集素基因psl

转化烟草研究

细胞生物学专业硕士研究生周小全

指导教师张兴国研究员

摘要

结瘤固氮是豆科植物与根瘤菌专一性作用的结果。在根瘤菌的第一步入侵至根瘤形成的每一个过程中，都伴随着宿主植物及根瘤菌特异性基因的表达。前人的研究已经证明，植物凝集素在豆科植物识别根瘤菌的过程中起着不可缺少的重要作用，通过豆科植物间凝集素基因的转化，可使一些豆科植物识别原本不能识别的根瘤菌。但是，人们在利用人工启动子将豆科植物凝集素基因转化到非豆科植物时，并未能使非豆科转基因植株识别相应的根瘤菌。鉴于此，有必要在非豆科植物上模拟豆科植物凝集素的原始表达机制，研究非豆科植物与根瘤菌的相互作用。

结瘤素基因（Nodulin Gene）是指特异地存在于根瘤菌感染产生的根瘤细胞中并参与共生固氮作用的植物基因，它们对于根瘤结构的形成及维持、固氮活性的保护以及固氮产物的代谢等都有重要作用。根据表达时间的先后，它可分为早期结瘤素基因和晚期结瘤素基因。早期结瘤素基因在根瘤发育早期表达，参与“根瘤菌——根毛”相互作用及根瘤形态发生过程，对植物与根瘤菌之间的信息传递、根瘤菌的侵染及根瘤的形成有着重要作用。目前已经发现了多个关键的早期结瘤素基因，并在一定程度上阐述了它们的功能，不过它们的工作机理仍有待进一步阐明。这些关键早期结瘤素基因在转化到非豆科植物中后，是否能发挥相应的功能，也需要进一步的探索。

本实验通过PCR技术从豌豆基因组DNA中克隆出豌豆凝集素基因（psl）及早期结瘤素基因PsENOD12A、PsSYM10、PsENOD40，构建了psl基因的植物表达载体pVCT-PsL，并利用农杆菌介导法将psl基因导入烟草。主要实验结果如下：

1．psl基因的克隆、表达载体构建及转化烟草

以豌豆（Pisum sativum L.）基因组DNA为模板，通过设计特异引物，利用PCR技术扩增获得psl基因。序列分析表明，该基因全长1948 bp，包括编码275个氨基酸的828 bp的开放阅读框、854 bp的5’端控制区和266 bp的3’端非翻译区。与已报道的序列（GenBank登录号X66368）相比较，核苷酸序列及推导的氨基酸序列同源性分别为99.4%和100%。将psl 基因插入到pVCT2020，构建了该基因的植物表达载体pVCT-PsL。利用农杆菌介导法将psl 基因导入烟草（Nicotiana tobacum L.cv.Wisconsin38）中，共获得10个独立的卡那霉素抗性烟

- I -

西南大学硕士学位论文

草株系，移栽后全部成活并开花结果。PCR检测初步确定psl基因已转入烟草基因组中。

2．豌豆PsENOD12A基因的克隆

以豌豆基因组DNA为模板，通过设计一对特异引物，利用PCR技术扩增获得PsENOD12A 基因。序列分析表明，该基因全长1282 bp，含有编码110个氨基酸的333 bp的开放阅读框和936 bp的5‘端控制区。与GenBank公布的已知序列（X81366）相比，其核苷酸序列及推测的氨基酸序列的同源率分别为99.9%(仅有1个碱基不同)和100%。

3．豌豆PsSYM10基因的克隆

以豌豆基因组DNA为模板，通过设计特异引物，利用PCR技术扩增获得PsSYM10基因。序列分析表明，该基因全长3310 bp，包括编码594个氨基酸的1785 bp的开放阅读框、1000 bp 的5‘端控制区和525 bp的3‘端非翻译区。与GenBank公布的已知序列（AJ575250）相比，其核苷酸序列及推测的氨基酸序列的同源率分别为98.8%和100%。

4．豌豆PsENOD40基因的克隆

以豌豆基因组DNA为模板，通过设计特异引物，利用PCR技术扩增获得PsENOD40基因。序列分析表明，该基因全长459 bp，包括编码75个氨基酸的228 bp的开放阅读框、117 bp 的5‘端控制区和114 bp的3‘端非翻译区，其翻译启始密码子不是常见的ATG，而是稀有翻译启始密码子TTA。与GenBank公布的已知序列（X81064）完全一致。

关键词：豌豆；凝集素基因；早期结瘤素基因；PsENOD12A；PsSYM10；PsENOD40 - II -

ABSTRACT

Isolation of Early nodulin Genes from Pisum sativum and Introduction of psl Gene into Nicotiana tobacum

Master digree candidate Xiaoquan Zhou

Advisor Xingguo Zhang

（College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest

University, Chongqing 400715, China）

ABSTRACT

Legume root nodule formation and symbiotic nitrogen fixtion are induced by rhizobia, which inoculate legumes specifically. The successive steps in root nodule development involve a lot of host genes and rhizobium genes that express in this process. Former studies have showed that the leguminous lectins play an important role in the recognition of rhizobia. Some legumes could recognise the rhizobium that hadn‘t been recognized after the relevant lectin gene being introduced. However, when lectin genes were introduced into non-legumes using manual promoter the anticipant result was not obtained. So, it is necessary to simulate the original mechanism of lectin genes‘expression, research on the interaction of transgenic non-legumes and rhizobia.

The successive steps in root nodule development involve the induction of host genes that are not expressed in uninoculated roots. Of these genes, the genes that are not expressed in any other plant organ are named nodulin genes. Nodulin genes are very important for the formation legume root nodule , maintaining the function of nitrogen fixtion and the metabolism of products. According to the expression time, nodulin genes were pided as early nodulin genes and late nodulin genes. Early nodulin genes were induced at the early stage of legume root nodule formation. It played an important role in the information communication between plants and rhizobia,the process of infection and the formation of root nodule. So far several key early nodulin genes have been found, and some function of them were explained to some extent. Whether these genes would bring the same function after being introduced into non-legumes need to be made sure.

In this study PsENOD12A, PsSYM10 and PsENOD40 gene, which are nodulin genes, and psl gene were obtained from pea（Pisum sativum L.）by PCR amplification. The expression vector of psl gene was constructed, and then, we introduced psl gene into tobacco（Nicotiana tobacum L.cv.Wisconsin38）via Agrobacterium tumefaciens mediated method. The main results show as follows:

1．Cloning of psl gene , construction of its plant expression vector and Introduction of psl into

- III -

西南大学硕士学位论文

tobacco

The psl gene fragment was amplified by meas of PCR using pea genomic DNA as template and a pair of specific oligonucleotides at 5‘- and 3‘- end as primer. Sequence analysis showed that the fragment consisted of 1948 bps, which contained an open reading frame of 828 bps, and encoded a polypeptide of 275 amino acids. Comparison with previously published sequence（location in GenBank as X66368）showed 99.4% homologies in nucleotide sequence and 100% in amino acid sequence respectively. The plant expression vector pVCT-PsL was constructed, and then, we introduced psl gene into tobacco via Agrobacterium tumefaciens mediated method. Ten kanamycin-resistant tobacco plants were obtained and all of these plants were alive. PCR detection showed that the psl gene has been integrated into their genome.

2．Cloning of PsENOD12A gene

The PsENOD12A gene fragment was amplified by meas of PCR using pea genomic DNA as template and a pair of specific oligonucleotides at 5‘- and 3‘- end as primer. Sequence analysis showed that the fragment consisted of 1282 bps, which contained an open reading frame of 333 bps, and encoded a polypeptide of 110 amino acids. Comparison with previously published sequence （location in GenBank as X81366）showed 99.9% homologies in nucleotide sequence and 100% in amino acid sequence respectively.

3．Cloning of PsSYM10 gene

The PsSYM10gene fragment was amplified by meas of PCR using pea genomic DNA as template and a pair of specific oligonucleotides at 5‘- and 3‘- end as primer. Sequence analysis showed that the fragment consisted of 3310 bps, which contains contained an open reading frame of 1785 bps, and encoded a polypeptide of 594 amino acids. Comparison with previously published sequence（location in GenBank as AJ575250）showed 98.8% homologies in nucleotide sequence and 100% in amino acid sequence respectively.

4．Cloning of PsENOD40 gene

The PsENOD40gene fragment was amplified by meas of PCR using pea genomic DNA as template and a pair of specific oligonucleotides at 5‘- and 3‘- end as primer. Sequence analysis showed that the fragment consisted of 459 bps, which contains contained an open reading frame of 228 bps, and encoded a polypeptide of 75 amino acids. The iniation codon of this gene was not A TG but TTA. Comparison with previously published sequence（location in GenBank as X81064）showed 100% homologies in nucleotide sequence and 100% in amino acid sequence respectively.

Keywords：Pea；Pslectin；Early nodulin gene；PsENOD12A；PsSYM10；PsENOD40 - IV -

目录

目录

摘要.................................................................................................................................................................................I ABSTRACT........................................................................................................................................................................III 第1章文献综述 (1)

1.1 豆科植物——根瘤菌共生固氮体系的概述 (1)

1.2 植物凝集素在共生固氮中的作用 (4)

1.3 ENOD12A基因的概述 (6)

1.4 Ps SYM10基因的概述 (7)

1.5 ENOD40基因的概述 (8)

第2章引言 (11)

第3章豌豆凝集素基因psl的克隆与导入烟草 (13)

3.1 实验材料 (13)

3.2 实验方法 (15)

3.3 结果与分析 (21)

第4章豌豆PsENOD12A、PsSYM10和PsENOD40基因的克隆与序列分析 (29)

4.1 实验材料 (29)

4.2 实验方法 (30)

4.3 结果与分析 (32)

第5章讨论 (41)

5.1 豌豆psl、PsENOD12A、PsSYM10、PsENOD40基因的克隆 (41)

5.2 psl、PsENOD12A、PsSYM10、PsENOD40基因的特点 (41)

5.3 表达载体构建 (41)

5.4 烟草的遗传转化 (42)

5.5 转基因植株的鉴定 (42)

5.6 后续研究 (43)

第6章结论 (45)

参考文献 (47)

缩略词表 (53)

致谢...................................................................................................................................错误！未定义书签。附录 (56)

- V -

西南大学硕士学位论文- VI -

第1章文献综述

第1章文献综述

氮是各类生物生长发育所必需的主要元素之一，氮素营养在农业生产中也一直发挥着重要作用，肩负着提高作物产量、培肥土壤、维持生态系统平衡的使命。随着农业的发展，氮素化肥的生产和施用量急剧增加，20世纪80年代初，世界氮肥施用量约为6100万吨，1995年约8000万吨，我国早在1996年氮肥施用量就达到了2200万吨，随着人口的增长，需求量也将越来越大。全球每年可供利用的还原态氮中约有60％来自生物固氮，工业合成氨只占25％，其余15％则产生于闪电等。由于工业合成氨耗能大、成本高，且容易造成环境污染，而生物固氮将空气中的氮气直接转化为植物可利用的硝酸盐或铵盐，不会引起环境污染。所以，对生物固氮进行深入研究有着深远的意义。

1.1 豆科植物——根瘤菌共生固氮体系的概述

1.1.1 豆科植物共生固氮研究概况

生物固氮在提供植物氮素营养方面占据着非常重要的地位，其中又以豆科植物的共生固氮占据着主导地位。据统计，每年生物固氮提供了约80%的氮素营养，其中豆科植物的共生固氮量是非豆科植物固氮量的4.58倍[1]。扩大共生固氮的范围，使非豆科植物，特别是农作物能自主固氮，从而达到少施化肥、增产粮食和保护环境的目的，是生物固氮研究领域的一个宏伟目标。

自从Hellriegel和Wilfarth于1886年在德国开展共生固氮研究以来，共生固氮研究从经典的生态学、生理学和遗传学研究迈入了分子生物学领域，这些研究对提高豆科植物共生固氮作用和非豆科植物固氮奠定了科学基础。近年来，生物固氮研究发展迅速，已成为一项世界性的战略课题。各国都对其做了大量的研究工作，取得了耀人的成绩。目前，生物固氮已经成为一个多学科的综合性研究项目，分别在分子、细胞、个体和生态等多层次水平上，从微观到宏观不断地展开着探索性研究。

目前，研究的最多的生物固氮体系是豆科植物和根瘤菌的共生固氮体系。豆科植物的根可以被根瘤菌感染，能够诱导根形成根瘤，固定空气中的氮，转化为植物的氮素养料。此即为豆科植物——根瘤菌的生固氮体系。根瘤菌感染对宿主植物具有专一性，不同的根瘤菌只能特异性地被其宿主植物识别。根据根瘤菌在豆科植物上形成根瘤的专一性，构成了―互接种族‖关系（荆玉祥等，1995）[2]。根瘤菌——豆科植物共生固氮体系是自然界固氮效率很高的一个体系，该体系广泛分布于地面各处，并且广泛地为农业生产所利用。

1.1.2 共生结瘤固氮体系的生理反应机制

豆科植物与根瘤菌形成共生关系并结瘤固氮是一个复杂的过程，此过程具体表现是在豆科植物根上形成特异的结构——根瘤，根瘤行使固氮的功能。根瘤的形成是植物宿主和根瘤

- 1 -

西南大学硕士学位论文 - 2 - 菌对抗与协调的统一，这个过程受到豆科宿主和根瘤菌双方一系列基因的共同调节和控制。

首先，植物分泌类黄酮至根际，诱导根瘤菌结瘤基因的表达并合成结瘤因子（Nod factors ，NFs ），进而引起根瘤菌在植物根毛附近富集并发生趋化作用（图1-1a ）。

这些结瘤因子是一些脂质寡聚糖信号分子（LCOs ），它们能被植物特异性地识别，并且促使根瘤菌吸附到植物根毛细胞上（图1-1b ）。

与此同时，植物的根迅速作出一系列反应，如钙峰及离子流（Ca 2+、Cl -、H +）的形成、根毛顶端膨胀和新的顶端生长、根毛分枝和卷曲等现象的发生。在根毛卷曲部位附着的根瘤菌进入细胞壁之间，植物细胞壁局部水解，细胞质膜向内生长，同时新的细胞壁物质沉积在内陷的质膜处，形成一种管状结构，即侵入线（图1-1c ）。

随后，根瘤菌在侵入线内不断繁殖生长，并推动着侵入线不断伸长，直达根皮层细胞[3]（图1-1d ）。

与此同时，某些皮层细胞进行有丝分裂，根瘤原基开始形成。伸长的侵入线随后产生分枝，以类似顶端生长的方式，根毛内向前推进并穿过皮层细胞（图1-2-A ），最后在根瘤原基细胞中释放根瘤菌，后者进一步分化成被膜包围着的可以固氮的类菌体（图1-2-B ）。至此共生体初步形成，根瘤原基逐渐发育为根瘤[4]。

图1-1 早期结瘤反应

（a ）根毛表面分泌的化学信号使根瘤菌向根毛发生趋化作用；（b ）根瘤菌吸附到根毛表面；（c ）根毛发生卷曲，并包裹根瘤菌，同时根毛分泌新的细胞壁物质，形成侵入线；（d ）根瘤菌在侵入线内不断繁殖推动侵入线不断向内伸长，直达皮层细胞。

Fig. 1-1 The early stages of Rhizobium infection

（a ）Chemic signals are localized to and secreted from the emerging root hair facilitating rhizobial aggregation ；（b ）The rhizobia are attached to the root hair ；（c ）The root hair curls around the rhizobia and an infection thread forms at the ?hyaline spot‘；（d ） The Infection thread extends and the root hair longates. Rhizobia multiply within the thread.

第1章文献综述

A B

图1-2 根瘤菌侵入皮层细胞形成根瘤

A，内皮层细胞形成根瘤原基，侵入线产生分枝伸达根瘤原基；B，根瘤菌被释放到皮层

细胞中，随后被隔膜包围分化成类菌体。b，根瘤菌；c，皮层；d，液泡；ep，表皮；ed，

真皮；it，侵入线；n，细胞核；pb，隔膜；r，根毛；rit，侵入线分枝；s，类菌体。

Fig. 1-2 Invasion of cortex by Rhizobium and formation of root nodule

A，A developing infection thread ramifies (rit) near the nodule primordia formed by piding

cortical cells；B，Bacteroids (b) are released from the infection thread (it) and form

symbiosomes (s) in nodule cells. Granules of poly-β-hydroxybutarate (phb) accumulate in

bacteroids surrounded by the peribacteroid membrane (pb).Other abbreviations: c, cortex;d,

digestive vacuole; ep, epidermis; ed, endodermis; r, root hairs. n, nucleus

1.1.3 结瘤素基因

豆科植物在根瘤菌的每一步入侵及根瘤形成的每一个过程中，都伴随着宿主植物及根瘤菌特异性基因的表达[5]。在根瘤菌方面，除有编码固氮酶的基因以及参与表达调节的nif、fix 基因外，还需要有参与结瘤过程的nod基因及参与细胞外多糖合成的exo基因。在植物方面，早期的传统遗传学实验就已经揭示，植物基因参与了从感染到氮代谢的许多共生固氮过程；近年来，更是利用分子生物学技术发现了上百种植物基因参与了共生固氮。人们将特异地存在于根瘤菌感染产生的根瘤细胞中并参与共生固氮作用的植物基因产物统称为结瘤素（Nodulin），编码它们的基因则称为结瘤素基因（Nodulin Gene）。它们对于根瘤结构的形成及维持，固氮活性的保护以及固氮产物的代谢都有重要作用。

结瘤素可根据它们在根瘤中产生的时间先后分为早期结瘤素和晚期结瘤素。早期结瘤素是根瘤发育早期产生的，参与根瘤菌——根毛相互作用及根瘤形态发生过程，对植物与根瘤菌之间的信息传递、根瘤菌的侵染及根瘤的形成有着重要作用。这类结瘤素包括豌豆（Pisum sativum）中的PsENOD12、PsENOD40、PsSYM2、PsSYM7、PsSYM10、PsSYM35、百脉根（Lotus japonicus）中的LjNFR1、LjNFR5、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中的MtNFP等[6]。晚期结瘤素则是根瘤菌释放到感染细胞后，固氮酶活性产生前后的产物。这类结瘤素中被研究得最多的是豆血红蛋白（Lb）。一般认为晚期结瘤素参与了固氮酶活性的维护及固氮产物的代谢。

- 3 -

西南大学硕士学位论文

1.2 植物凝集素在共生固氮中的作用

1.2.1 植物凝集素的概述

凝集素（1ectin）是一类广泛存在于自然界中的一大类非免疫来源的蛋白质或糖蛋白，它能与糖专一性地、非共价地可逆结合，并且有凝集血细胞的作用，故称为凝集素。凝集素在动、植物体内广泛存在，迄今为止，已发现了1000多种植物凝集素，其中豆科植物的凝集素有600多种[7]。1888年Stillmark首次在蓖麻萃取物中发现了凝集素，并观察到它具有凝集红细胞的作用。1936年，Summer和Howell从刀豆种子中分离纯化得到伴刀豆凝集素（ConA），并且发现了它专一性地结合糖的性质[8]。ConA能凝集溶液中的糖元和淀粉，ConA的血凝作用可被蔗糖抑制，因而推测COnA的血凝作用是与细胞表面糖作用的结果。1960年，Nowell 报道了植物血细胞凝集素（PHA）有促进细胞有丝分裂的作用[9]。1975年，Becker等研究了刀豆凝集素分子的三级结构，揭开了研究豆科植物凝集素分子空间结构的序幕[10]。近数十年来，人们对凝集素的性质、生理功能、基因结构与表达等方面进行了深入的研究，并取得了进展。

1.2.2 豆科植物凝集素的结构

随着对凝集索研究的不断深入，许多豆科植物凝集素已经被分离纯化出来，Sharon等1990年对其中大约40多种凝集素的基因进行了序列分析，结果表明：豆科凝集素的氨基酸序列具有高度的同源性[7]。这些凝集素在结构上非常相似，仅在形成多聚体的方式和程度上有差异。它们由2个或4个单体组成，每个单体的分子量为25-30 kD，有一个结合糖位点[7,11,12]。凝集素结合二价金属离子Ca2+ 和Mn2+ ，它们对于凝集素结合糖的活性是必需的，而且按一定的顺序结合，先结合Mn2+ 离子，然后其它结合位点结合Ca2+ ，这两种结合必须是结合位点处于最优化的构象状态[13]。由于豆科植物凝集素一级结构的高度同源，因此其三级结构也非常相似。

通过豆科植物凝集素晶体结构的分析，发现凝集素与糖形成的复合体，每个单体结合着Ca2+ 和Mn2+ ，与其中四个高度保守的氨基酸残基直接相互作用。豌豆种子凝集素（PSL）专一性地结合葡萄糖和甘露糖。与Ca2+ 结合时，作用的氨基酸残基是Asp—121、Asn—125、Phe—123、Asp—129。与Mn2+结合，其作用的氨基酸残基是Glu—119、Asp—121、Asp—129、His—136。凝集素单体与糖结合时，氨基酸残基与糖分子中的氧原子相互作用。在psl中，Asn—125的侧链与甘露糖分子的O-4作用，并直接与Ca2+ 结合。Asp—81的侧链与甘露糖分子OH—4和OH—6作用，并通过水分子间接与Ca2+ 相结合。Gly—99、Gly—216分别与甘露糖分子O—4、O—6通过范德华力相互作用。Ala—217和Glu—218与甘露糖以配位键结合，Gly—216与Glu—218之间在空间结构上环的位置发生了改变，移向甘露糖分子。这种改变的最终结果使糖与凝集素之间的氢键作用达到最大。这个环对凝集素专一性地结合糖起决定性的作用[14]。

- 4 -

第1章文献综述

1.2.3 豌豆凝集素的基因结构及其表达

Kaminski等和Gatehouse等1987年首先发表了豌豆凝集素基因序列，体外mRNA翻译结果与体内脉冲标记都清楚地表明该基因的初始产物是一个长275个氨基酸的前体蛋白，在随后的裂解中蛋白前体形成了成熟的α- 和β- 亚基[15,16]。de Pater等1993年发表了豌豆凝集素基因的全序列（GeneBank登录号X66368），该基因单拷贝，不含内含子，长3360 bp，具有828 bp开放阅读框ORF（open reading frame，ORF），共编码275个氨基酸[17]。

豌豆凝集素基因编码的蛋白质是α2β2，分子量为49 kD。β- 亚基为17 kD，α- 亚基为5.8 kD。在阅读框中位于位置1和245氨基酸之间缺少终止密码子，从而确定α- 和β- 亚基是由翻译后裂解产生的。由β—α方向，PSL以前体蛋白形式在内质网中合成。前体蛋白为28 kD。它们在内质网中进行翻译、修饰，包括去掉30个氨基酸的导肽之后，被运送到蛋白体中，进行慢慢加工，产生α- 和β- 亚基。加工中进行第一次裂解，产生α- 亚基前体和β- 亚基前体；第二次裂解是从β- 亚基前体的COOH端去掉小的肽段，产生β- 亚基；从α- 亚基前体COOH端去掉小的肽段（Ala-Ala-Asp-Ala），产生α- 亚基。豌豆种子的PSL 亚基结构相同，但它们是电荷分布不均匀的两种同源异型凝集素（PSL1和PSL2）的混合物[18]。α- 亚基迁移所产生的差异，以及在酸性同源异型凝集素中赖氨酸含量的轻微减少，使PSL 产生了有差异的同源异型凝集素。而且，在加工过程中包括去掉在α- 亚基的COOH端附近的第240位置赖氨酸残基的小的肽产生了PSL2。

1.2.4 凝集素在识别根瘤菌识别中的作用

植物凝集素在豆科植物专一性识别相应根瘤菌的过程中起着重要作用。凝集素特异性地识别根瘤菌表面的酸性荚膜多糖、脂多糖，形成交联桥，从而形成分子界面结构，保证根瘤菌特异地吸附到豆科植物根表面。

Hamblin和Kent在1973年首次报道了根瘤菌与凝集素相互作用[19]。他们把菜豆根瘤菌的悬浮液加入到菜豆凝集素中，发现二者发生了凝集作用，便提出假说：与菜豆凝集素结合的根瘤菌到达菜豆的根，在适当的位点感染植物。Bohlool和Schmidt于1974年提出凝集素起到宿主植物专一性决定因子的特殊作用[20]。他们发现使大豆结瘤的根瘤菌结合着大豆种子凝集素（SBL），其它根瘤菌并不结合SBL，于是他们提出豆科植物的凝集素在豆科植物根表面与适当的根瘤菌表面的特异性多糖产生特异性的相互作用。Dazzo和Hubbell于1975年发现了三叶草根表面凝集素能够凝集具有感染能力的根瘤菌，并提出了交联桥假说：三叶草凝集素特异性地识别根瘤菌表面的抗原，形成交联桥，从而形成正确的分子界面结构，保证根瘤菌特异性地吸附到三叶草根表面[21,22]。三叶草根瘤菌吸附到三叶草根时，以其凝集素作为中介，使三叶草根瘤菌选择性地在三叶草根毛上积累，而凝集素在根瘤菌吸附于三叶草根毛尖端的过程中起到了非常重要的作用[23]。根瘤菌的酸性夹膜多糖（EPS/CPS）、脂多糖（LPS）与凝集素产生相互作用[24]。Diaz等在1995年也提出，位于根毛顶端的PSL2可以结合适当的配位

- 5 -

西南大学硕士学位论文

体[25]。豌豆根瘤菌能够产生几种PSL的配位体，如EPS、LPS、CPS。CPS、LPS与凝集素的结合和根瘤菌的培养时期有关，在根瘤菌与根毛相互识别中，它们是重要的调控因子[25,26]。Planqué与Kijne在豌豆凝集素试验中，也发现具有感染能力的豌豆根瘤菌具有CPS和LPS[27,28]。在这些多糖中究竟哪个起关键作用尚无定论。

Lerouge等于1990年提出，凝集素可以特异性地与根瘤菌Nod因子相互作用。豆科植物凝集素有结合糖的位点和疏水性囊，它与根瘤菌的Nod因子的寡聚几丁质部分或脂肪酸链产生相互作用[29]。Díaz报道：在豆科植物和根瘤菌共生作用中，宿主植物的凝集素起决定作用。通过发根农杆菌将豌豆凝集素基因转移到白三叶草中，然后接种豌豆根瘤菌，结果白三叶草发生根毛卷曲；对转基因的三叶草根进行免疫细胞学定位试验，表明PSL存在于正在发育的根毛顶端[25,26,30]。Díaz等又进一步研究了在转豌豆凝集素基因的白三叶草和红三叶草中PSL2的作用，指出豌豆凝集素是根瘤菌的识别受体，因凝集素基因的转化而扩大了豌豆根瘤菌的宿主范围[31]。转凝集素基因植株的根对于外源根瘤菌的几丁质脂寡糖信号分子的反应增强从而产生瘤状物或结瘤。[25,26,31,32]

1.2.5 通过凝集素基因转化扩大根瘤菌宿主范围的可能性

豆科植物与根瘤菌之间的识别具有物种专一性。已证实，植物凝集素在豆科植物识别相应根瘤菌的过程中起着不可缺少的重要作用。转豌豆凝集素基因（psl）的三叶草能够识别原不能识别的豌豆根瘤菌（R. leguminosarum v. viciae），并获得结瘤固氮功能，甚至固氮作用还有提高[25,26]。转大豆凝集素基因的百脉根被大豆根瘤菌侵染后也有结瘤反应，包括根毛卷曲、皮层细胞分裂等[33]。这些都说明：凝集素基因在豆科植物之间的转化可以去除根瘤菌对宿主专一性的屏障。

为验证在非豆科植物中是否也能获得类似结果，Edwards等[34]和H?fte等[35]分别将由CaMV 35S启动子控制的psl基因转入马铃薯和烟草基因组中，并且研究了转化植株的定位和表达。张静娴、荆玉祥等曾经利用CaMV 35S和Ubi启动子将psl基因的阅读框区域分别转化到烟草与水稻中，并成功获得了表达[36,37]。不过，他们都未能取得进一步的进展，在非豆科植物识别根瘤菌这一关键技术上，依然未取得突破性进展。

1.3 ENOD12A基因的概述

在根瘤菌侵染豆科植物根毛细胞的同时，植物根的皮层细胞也被激活并开始细胞分裂。至于哪些皮层细胞分裂，以及形成什么样的根瘤是由宿主植物决定的，而不是由根瘤菌决定的。例如在豌豆和野豌豆（Vicia sativa L.）中，结瘤因子能够诱导根内皮层，特别是对着原生术质部的部分，分裂形成根瘤原基；根外皮层细胞则被激活形成前侵染线结构，侵染线通过前侵染线向根瘤原基生长并分叉。在根皮层细胞分裂形成根瘤原基时，早期结瘤素基因ENOD12得到特异性表达[38]，其表达机制与根瘤原基的形成是一样的，都是受结瘤因子诱导后表达。ENOD12蛋白很可能是侵染线壁或膜的组成部分[39]。

- 6 -

第1章文献综述

豌豆PsENOD12基因家族由两个成员组成，分别是PsENOD12A和PsENOD12B。二者的编码区十分相似，它们所编码的多肽都有一段信号肽序列，都有一个富含脯氨酸的五肽区域。不过ENOD12A含有的是一段十分保守的重复五肽序列，而ENOD12B的五肽重复次数要少于ENOD12A，也不如ENOD12A保守[40]。在紫苜蓿中也发现有类似的ENOD12基因家族结构[41]；苜蓿PsENOD12B基因的表达与结瘤因子的活动有关，而PsENOD12A基因的表达与侵入线的形成紧密相联[42]。Vijn等1994年发表了豌豆PsENOD12A基因序列，该基因不含内含子，长2779 bp，具有一333 bp的编码区，共编码110个氨基酸，在起始密码子上游-46bp处有TATA 盒[43]。RNA原位杂交研究表明，豌豆PsENOD12基因特异地在根瘤菌接种后的根毛细胞和含侵染线的根皮层细胞中表达[38]。

ENOD12基因编码的多肽含有较高的脯氨酸，这一点和构成大豆细胞壁的一些蛋白非常相像[40]。该多肽的大部分是由重复的Pro—Pro—Gln—Lys—Glu和Pro—Pro—His—Lys—Lys两种五肽单位组成，在该蛋白的N-端有一个可能的信号肽[38]。这些特征表明，ENOD12多肽很可能是富含（羟）脯氨酸的细胞壁蛋白。因此，ENOD12蛋白很可能是侵染线和为侵染线形成作准备的细胞壁组成部分[40]。

PsENOD12基因不仅在含侵染线的细胞中表达，而且也在根瘤原基细胞中表达；但它不在分生组织中表达，只在固氮前区的上部表达，于第一层细胞即达到最高表达水平[44]。野豌豆VsENOD12基因的表达模式大体上与豌豆一致，不过VsENOD12的表达范围更广，它在整个固氮前区都有表达[45]。

Gyula Csanádi等发现，在缺乏ENOD12基因的紫苜蓿变种中，依然能够表现出结瘤固氮的功能。所以他们认为ENOD12并不是紫苜蓿共生结瘤固氮所必需的基因，这些变种紫苜蓿植物体内可能存在着ENOD12的变异等位基因[46]。

1.4 Ps SYM10基因的概述

研究发现许多豆科植物的结瘤突变体植株丧失了与根瘤菌形成共生关系的能力，同时也失去了与菌根真菌建立共生作用的能力。这些突变植株与具有完整结瘤固氮功能的植株相比，缺失了一些关键位点基因。这样的关键位点基因在百脉根（Lotus japonicus）中发现了两个，分别是LjNFR1和LjNFR5基因；在苜蓿中发现了一个，MtNFP基因；在豌豆中发现了一个，即PsSYM10基因[47,48,49,50]。而扰乱了结瘤因子信号（Nod factors signaling）但是没有缺失上述关键位点基因的变异植株，在与根瘤菌作用后至少能表现出根毛变形的反应[51,52]。正因为如此，突变位点LjNFR1、LjNFR5、MtNFP和PsSym10基因很可能位于结瘤因子信号分子的信号传导途径的上游，所编码的蛋白很可能直接参了结瘤因子的感受[47,48]。

PsSYM10、LjNFR1、LjNFR5（可能还包括MtNFP）属于同源基因，它们编码LysM（lysin moti f）受体激酶（LysM receptor kinases，LysM-RKs）。根据LysM-RKs的序列，推测LysM-RKs 可能定位于隔膜（membrane）上[47,48]。从结构上看，LysM-RKs非常适合与结瘤因子相结合，

- 7 -

西南大学硕士学位论文

不过这还需要进一步证明[53]。

Stougaard等2003年根据百脉根NFR5基因和苜蓿（Medicago truncatula）根表达序列标签（Expressed Sequence Tag，EST）BE204912的保守区域设计特异引物，从豌豆（Pisum sativum cv. Alaska）中克隆得到一个551 bp的片段，进而从豌豆基因组中分离出PsSYM10基因（GeneBank登录号AJ575250）[50]。该基因全长2779 bp，不含内含子，具有一1785 bp的ORF，共编码594个氨基酸。

豌豆PsSYM10基因编码一个丝氨酸/苏氨酸受体激酶蛋白SYM10，蛋白分子量约为66 kDa。将SYM10与NFR5进行对比分析，二者的氨基酸序列同源性达到了74%，这其中包括了LysM激酶区域的全部保守序列[50]。

1.5 ENOD40基因的概述

ENOD40基因是根瘤器官形成过程中表达的植物早期结瘤素基因之一，通过调节细胞生长素和细胞激动素的平衡诱使根瘤形成。

Kouchi和Hata[54]及Y ang等[55]1993年从大豆根瘤cDNA文库中克隆到GmENOD40基因。它是根瘤形成过程中最早表达的结瘤素基因之一，首先表达的部位是根木质部中柱鞘细胞（pericycle cell），其后在开始细胞分离时，皮层细胞中才表达[55,56]。大豆GmENOD40基因的大小为700 bp，在转录区域内没有明显单一的可读框（open reading frame，ORF）结构，仅编码一个小分子量的多肽，其翻译产物GmENOD40由12个氨基酸组成[57]。在碗豆、紫苜蓿、蚕豆、大豆中也发现ENOD40的同源基因，这些基因编码的多肽为10～13个氨基酸（图1-3）。有趣的是在非固氮植物烟草中也存在此基因。

植物氨基酸序列

大豆ENOD40 M ELCWLTTIHGS

碗豆ENOD40 MKFLCWQKSIHGS

苜蓿ENOD40 MKLLCWQKSIHGS

烟草ENOD40 M WWDEAIHGS

图1-3 部分植物ENOD40的氨基酸序列

Fig. 1-3 The amino acid sequences of some plants’ ENO40

V an de Sande等1996年将大豆GmENOD40基因转入烟草中表达，可促进培养物茎的形成，削弱顶端优势，带来生长素代谢或生长素反应的变化[57]。烟草原生质体的分裂通常是随着生长素的升高而增加，当超过一定浓度后会抑制细胞的分裂。但是在转基因烟草上未发现抑制作用。所以，认为GmENOD40编码的蛋白具有调节作用。将烟草中的同源基因NtENOD40在烟草原生质体上过量表达，其作用具有与大豆GmENOD40过量表达相同的效果。将大豆、烟草产生的ENOD40蛋白添加在非转基因原生质培养基中，发现有与转基因植株相同的生长素

- 8 -

第1章文献综述

变化，来自大豆ENOD40的活性浓度为10-12 mol/L，烟草来源的则仅为10-16 mol/L。

大豆GmENOD40基因过量表达的转基因紫苜蓿，在既无根瘤菌存在、也缺乏形成根瘤必须有氮的条件下，能诱导根皮层细胞的分裂[58]。Scheres等1990年提出，豌豆PsENOD40基因在整个固氮前区具有相同的表达水平[59]。Compaan等也于2001年指出，ENOD40能被根瘤菌迅速诱导并在豆科植物根的中柱鞘或正在分裂形成根瘤原基的皮层细胞中表达[60]。这也说明ENOD40蛋白质与根瘤形成的初期阶段有密切关系。在转基因植株原生质体培养中有ENOD40蛋白质渗出。因此，认为ENOD40可能是一种分泌型蛋白质，并且与皮层、内鞘细胞间的情报传递有关，有可能控制着中柱和根皮层之间的物质运输和信息传递[57,58,61]；ENOD40基因的表达与根瘤原基的形成有着密切的关系[62]。

豌豆PsENOD40基因与大豆GmENOD40基因具有非常相似的功能[61]。原位杂交结果显示二者的表达方式很相似。在豌豆和大豆中，ENOD40都是在根的中柱鞘或正在分裂形成根瘤原基的皮层细胞中被诱导表达的，而且在成熟的根瘤的中柱鞘维管束中也都会得到表达。PsENOD40基因与GmENOD40基因在核酸水平上具有55%以上的同源性，但是，二者在氨基酸水平上却仅有14%的同源性和35%的相似性。之所以会出现这种现象，很可能是因为ENOD40以小的多肽或RNA的形式行使功能[61,63,64,65]。

- 9 -

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/ke0q.html