粘贴下的基因多态性

青光眼

1.1.人类载脂蛋白E(apolipoproteinE，apoE)及其编码基因一一 A尸口百基因

类载脂蛋白E(即olipoproteinE，aPoE)是一条由299个氨基酸残基组成的大约34.2kDa的 多肤单链[l]。它属于可转换性载脂蛋白(apoliP叩roteins，aPo)的E组.APoE通过和胞浆中的 酶类和细胞表面的受体相互作用将脂质运入和运出细胞。可转换性载脂蛋白有着一样的可 能是来自同一原始基因的基因组结构[2]。这个基因的最后一个外显子编码一个由n个和22 个氨基酸组成重复片断的以及结构，这些重复片断组成了apoE的62一299氨基酸序列汇2.3]。

每个这种重复片断都周期性有一个兼性a一螺旋而这些螺旋之间常常有一个脯氨酸将它们 隔开[3，4]。a一螺旋有几个种类，其中A类螺旋是可转换性载脂蛋白主要的脂质结合部位。 它的特征是在亲水/疏水界面处有碱性氨基酸而在极性部位的中心有酸性氨基酸积聚。G类 螺旋的特点是在极性部位有随即排列呈放射状的带正电荷和负电荷的氨基酸l5]。APoE序列 在不同物种间有着高度的保守性，除了它的N一端和c一端。保守序列从人类apoE序列的第

26个氨基酸开始一直到大约第288个氨基酸的地方[6]。人类apoE有三种亚型，其中最常见 的是E3亚型，它在第112个和第158个多肤位点分别含有半肤氨酸和精氨酸，EZ亚型的 这两个位点都是半肌氨酸而E4亚型则都是精氨酸[6]。APoE分子有两个独立的折叠域，一 个大约22一kDa位于N一端，包含1一191位点的氨基酸，另一个IOkDa在C一端包含216一299

位点的氨基酸[8，9〕。位于N一端的结构域包含低密度脂蛋白受体(lowdensitylip记reeePtor， LDLR)的结合部位而c一端的结构域由于和脂质有高亲和力，所以和脂蛋白结合有关网。这 两个结构域都有发达的螺旋结构，N一端的以G类螺旋为主，而C一端则以A类螺旋为主[3]。

所有三种亚型的apoE的N一端片断均有一个由四个伸长了的螺旋组成的球形功能域。构成 功能域的螺旋按反向平行的方式排列，他们的疏水端都朝向域的内部，而支链构象和盐桥 排列的细微差别使每种亚型都有其各自的功能和特性【，。一1z]。APoE亚型的N一端片断稳定性各

有不同(apoE4

特征性。目前认为由于结构域之间的相互作用，使得N一端结构域第112位点的多态性可以

影响C一端结构域结合脂质的特性[I3l。在ap0E4中，第112位点的精氨酸使N一端结构域第

汕头大学医学院硕士学位论文

位点的精氨酸侧链进行重排，从而使其可以和C一端结构域第255位点的谷氨酸相互作 〔，2.14]。这种结构域的相互作用使apoE4C一端的结构更不具特征性，并使apoE4优先和非

常低密度脂蛋白(ve仃lowdensitylipid，VLDL)而不是高密度脂蛋白(highdensitylipid，HDL) 结合。在apoE3，这种生物特性刚好相反【6，。有研究还表明，apoE4中这种结构域之间的相

互作用可能导致加快该亚型的代谢而使含有该基因型的个体血浆中胆固醇和低密度脂蛋

白浓度升高〔，5，。APoE有许多不同的功能，包括调节脂类代谢〔，6，，抗血管源性〔，”，抗炎[l‘，，

和抗氧化【，9，以及参与受损的神经元的修复、细胞信号传递和细胞增殖等作用。APOE通过

和LDLR以及这个受体家族的其他成员如非常低密度脂蛋白受体(verylowdensitylipid reeePtor，VLDLR)的相互作用，在血浆脂质代谢中扮演着重要的角色[20]。APoE是LDLR一

个高亲和力的配体。当它和该受体结合后，接着发生的胞吞作用和肝脏的清除作用使得血 浆中的胆固醇、甘油三酷和其他一些脂类的水平均有所下降。位于第136一158位点的精氨 酸和赖氨酸簇介导了这个碱性部位和LDLR的酸性部位的相互作用te1。除了调节循环的脂 质水平，正如在周围和中枢神经系统所见的一样，apoE还参与胆固醇的局部转运[2l一。有 实验表明周围或中枢神经系统的神经损伤后，胶质细胞合成apoE的速度增加了150倍 [2l，22，24]。目前认为，通过和受损的神经元表面的脂蛋白受体相结合并被其吸收，胶质细胞

分泌的含apoE的脂蛋白向这些神经元转运生长和损伤修复所需的胆固醇〔，6，25，。在视网膜，

apoE主要由数量最多的胶质细胞—Muller细胞合成，并被分泌到玻璃体和其他的胞外 间隙里，同时还被视网膜节细胞(retinalganglioneells，RGCs)转运到视神经中〔，‘，。Anderson DH通过实验显示Muller细胞和视网膜色素上皮(retinalpi脚entepithelium，即E)细胞分别 是神经视网膜和RPE/脉络膜中apoE主要的生物合成来源[27]。IshidaBY也通过原代细胞培 养显示人类RPE细胞的顶部和基底部分泌apoE[zsl。

编码apoE的基因，ApOE基因(OMIM107741)位于19ql3.2染色体上。ApOE基因有四个 外显子，第四外显子的448和586位置的多态性决定了APOE基因三种常见的变异，￡2，￡3，

和￡4。E3在这两个位置分别是T和C等位基因，而￡2的这两个位置都是T等位基因， ￡4的都是c等位基因。这三种变异分别编码apoE的三个亚型，EZ，E3，和E4[z9，30]。这个多

态性导致出现了三个纯合子基因型(82/￡3，￡3/￡3，￡4/￡4)和三个杂合子基因型 (。2/03，C2/04，E3/04)。ApOE基因多态性已经被发现和一系列疾病有关联。有报道

指出，ApoE基因的。4等位基因和阿尔茨海默病(AD)的发病危险性密切相关[3‘一35]。这个等

位基因还被发现和各种类型的头部外伤后的不良预后有关[36一38]。此外，它和多发性硬化严

重的疾病进展[39，4O]以及肌萎缩性侧索硬化病人较短的存活时间〔4，，也有关联。 汕头大学医学院硕士学位论文

A尸oE基因第四外显子的多态性由荧光定量PcR基因分型分析 2.2.4.DNA的提取

我们使用QIAampBlood丸t(Qiagen，Valencia，CA)试剂盒对所有研究对象的样本DNA进行 提取。每个样本DNA来自200川的静脉血。具体提取方法如下: l)将样本静脉血置于室温。

2）将水浴箱的温度跳至56“C。

3）确保己经准备好AW1缓冲液、AW2缓冲液以及QIAGEN蛋白酶。 将20川QIAGEN蛋白酶打入1.5ml微离心管的底部。

5)将200川的样本静脉血加到微离心管中(用1ml枪头)。尽量用完200川静脉血。

6)在样本中加入200贝AL缓冲液，振荡巧秒混匀。

7)置于56OC中孵育10分钟(最多)。

8)简单离心，将附着在管壁的液体离心下来。

9)在样本中加入200贝乙醇(96一100%)，再次振荡巧秒混匀。混匀后把样本简单离心。 10)小心将步骤9的混合物放到QIAamp离心柱中(在一个2ml的收集管里)，注意不要弄 湿柱的周边，关上盖，在6000、g(so0Orpm)转速下离心1分钟。.将QIAamp离心柱 置于一个新的2ml收集管中(试剂盒中有)，将装有滤过液的收集管丢弃。

11)小心打开QIAamp离心柱并加入500川AWI缓冲液，注意不要弄湿柱的周边。关上盖， 在6000、g(SO00rpm)转速下离心1分钟。将QIAamp离心柱置于一个新的2ml收集管 中(试剂盒中有》将原来的收集管丢弃。

12)小心打开QIAamp离心柱并加入500川AWZ缓冲液，注意不要弄湿柱的周边。关上盖， 在全速(Z000oxg:14000印m)下离心3分钟。

13)把QIAamp离心柱放到一个干净的1.5ml微离心管中(试剂盒中没有)，将装有滤过液 的收集管丢弃。小心打开打开QIAamp离心柱并加入200川(也可以用120川)AE缓冲 液。在室温下孵育1分钟。然后在6000xg(sooorpm)转速下离心l分钟。 14)将样本DNA置于一20oC保存。

2.2.5.聚合酶链反应印olymeraseehainreaction，PeR)

我们使用特别的引物对以及与其对应的PCR流程对目标DNA序列进行扩增。设计引物的 时候我们在目标序列的两端各额外加上40个不属于目标序列的碱基对，因为DNA序列在 接近前后两端的地方是比较难以准确测出的。 2.2.5.1涯POE基因启动子序列的引物对

Primerfop刃ard:APOE.P~NF:GAGACAGTCTCCCTCTTGCTGAGG

Primerreverse:APO五~Pro一219.NR:Al丫IACTGGGCGAGGTGTCCTC. 2.2.5.2滋尸口百基因第四外显子序列的引物对

Primerfor、vard:APOE一4F:GAACAACTGAGCCCGGTGGCGG 汕头大学医学院硕士学位论文

Primerreverse:APOE.4R:TCGCGGGCCCCGGCCTGGTACA. .2.6.扩增目标序列的PCR流程

.2.6.1.扩增A尸口百基因启动子序列的PCR流程

ApoE、CYP46基因多态性阿尔茨海默病的相关性分析

ApoE基因位于第19号染色体(19q13·2)上,其遗传多态性主要受位于同一基因位点上 的3个等位基因(ε2、ε3、ε4）所控制,分别编码血浆中3种异构体,即ApoE2、ApoE3、 ApoE4,构成6种不同的基因型。在不同人群中,ApoE等位基因的分布频率不同,因而决定 了不同人群中ApoE表现型的频率差异。 1．3主要试剂 1．3．1工具酶

PCR的Taq DNA聚合酶、HhaI、MSPI限制性内切酶均购自上海生工生物工程技术服 务有限公司。

1．3．2核酸分子量标准

PUC19DNA/MspI(HpaII)Marker,23和Generuler TM

50bp DNA Ladder购自上海生工生物 工程技术服务有限公司。 1．3．3引物合成

上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 1．3．4化学试剂

琼脂糖(Agarose)、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、聚丙烯酰胺凝胶试剂购自上海生工 生物工程技术服务有限公司，其他试剂均为国产分析纯。 1．4主要仪器设备

-20℃超低温冰箱（MDF-382-E）日本SANYO 低温高速离心机（6900）日本KUBOTA 照相设备日本SONY

立式自动电热压力蒸汽灭菌器（LDZX-40BI）上海申安医疗器械厂 双重纯水蒸馏器无菌过滤器MiG-Q型 分析天平（JA2003）上海精科天平 电泳仪北京六一仪器厂

PCR扩增仪（PTC-9600）美国PE公司 紫外凝胶图象分析系统DAS7500(UVP)德国 二．方法

2．1基因组DNA提取：

抽静脉血5ml,EDTA抗凝,采用低渗溶血、常规酚-氯仿法提取白细胞基因组DNA（详 见附录）。 2．2 APOE基因型检测：

上游引物为5'-AACAACTGACCCCGGTGGCG-3'和下游引物为 5'-ATGGCGCTGAGGCCGCGCTC-3'。PCR反应体积为25ul,0.5-1ugDNA模板;2.5ul 10xPCR反应缓冲液;1.5ul 25mmol/LMgC12;2.5ul DMSO;1ul 2mmol/LdNTPs;10pmol/L上 下游引物各0.5ul;Taq DNA聚合酶1U。PCR反应程序为:95℃5min,35周期(95℃1min, 60℃1min,70℃1min)，72℃10min。取PCR产物(292 bp)（见图1)10ul，经限制性内切酶 HhaI5U在37℃恒温箱中充分酶切消化4h，12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离酶切产物， 银染并观察、摄影(见图2)。 2.3 CYP46基因型检测

上游引物为5'-TGA AAA CGA GTT TCC CGT CC-3'，下游引物为5'-GTG TGA CCA GGT AAC AGT CA-3'，PCR反应体积为50ul,0.5-1ugDNA模板;5ul 10xPCR反应缓冲 液;3ul 25mmol/LMgC12;1ul 10mmol/L dNTPs;10pmol/L上下游引物各1ul;Taq DNA聚合酶 2U.PCR反应程序为95℃5min,35周期(95℃30s，54℃30s,72℃30s)，72℃10min。取PCR 产物(285bp)(见图3)10ul经限制性内切酶MSPI 10u于37℃恒温箱中充分酶切消化3h，经4 2%琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色，紫外灯下观察并摄影。产生三种不同长度的片段，只 有285bp为纯合基因型T/T，有209bp和76bp两个片段的视为纯合基因型C/C，有 285bp,209bp和76bp3个片段的视为杂合基因型T/C(见图4)。 2．4统计学方法

基因型频率和等位基因频率以构成比（%）表示，组间比较用χ2检验。并按比值比(OR 值)进行关联分析。全部材料采用SPSS13.0软件进行统计学处理。结果

一、AD组与对照组ApoE基因型及等位基因频率分布

见表1。从表1的基因型和等位基因频率分布可以看出，在AD组及对照组中，均以

以ε3/3基因型最多，百分比分别为40.00%和66.66%,其次为ε2/3型，ε2/2为罕见的基因

型，本实验在病例组及对照组均未发现该型，两组ApoE基因型分布总体比较其差异在统 计学上有显著意义(χ

2

=13.973，P=0.007),两组等位基因构成分布有显著差别（χ

2

=16.367， P=0.000），AD组ε4基因频率明显高于对照组,ε3基因频率明显低于对照组,ε2基因频率两

组差异无显著性。AD与ε4等位基因呈显著正相关（OR=9.281，P<0.05）。 表1各组ApoE基因型及等位基因频率分布 AD

（n=40） ND (n=36)χ 2P Value

(p=0.05)

Genetypeε2/2 0 0

ε2/3 7(17.50)10(27.78)

ε2/4 3(7.50）0(0.00）13.973 0.007 ε3/3 16(40.00）24(66.66） ε3/4 8(20.00）1(2.78） ε4/4 6(15.00)1(2.78）

Alleleε2 10(12.50)10(13.89） ε3 47(58.75)59(81.94） ε4 23(28.75)3(4.17）1

6.367 0.000

注：括号内数值为频率值(%)χ2检验，与对照组比较，*P<0.05

见表2。ApoEε4等位基因可增加AD的患病风险OR=9.281 95%CI(2.650-32.497)，而ε3 等位基因对于AD具有保护作用OR=0.314 95%CI(0.149-0.663)，ε2等位基因与AD的发病 不相关OR＝0.886 95%CI(0.346-2.269)。

表2 ApoE各等位基因与AD相关性卡方检验 Alleleχ2P OR 95%CI

ε2 0.064 0.800 0.886 0.346-2.269 ε3 9.660 0.002 0.314 0.149-0.663 ε4 16.151 0.000 9.281 2.650-32.497 注：OR:odd ratio;CI:confidence interval

APoE血清水平及基因多态性与冠心病痰癖证候关系的研究 A即E基因多态性与cHD发病的关系人类APoE有3

种主要的异构体(EZ、E3和E4)，他们之间的差别仅在于112 位和158位上的单个氨基酸不同，EZ的112位和158位均为 半胧氨酸(eys)，E3的l一2位是精氨酸(^铭)、155位是eys， 而E4的112位和158位均是Arg。这种单个氨基酸不同造成

的异构体就是由ApoE基因多态性决定的。在人群中3种不同 的A钾E等位基因分布频率不同，因而决定了不同人群中 ApoE表型的颇率差异。ApoE基因中E4等位基因的频率各国 有很大差异，而CHD的发病率也有很大差异。

ApoE基因多态性对低铜蓝蛋白血症相关性运动障碍临床表型影响的研究 ApoE具有3种异构体，即ApoE3、EZ、E4，其差别在于一级结构的不同，即 位于氨基酸序列112位和155位残基的置换:在ApoEZ，这两个位置均为半肤氨 酸(eysteine，Cys);在ApoE4均为精氨酸(arginine，Arg);而在ApoE3的

112位是CyS，158位是Arg。ApoE4t匕ApoE3多一个正电荷，ApoEZt匕ApoE3少 一个正电荷。因ApoE3出现频率最高，故认为是“野生型”，ApoEZ和Ap0E4则 是由它变异而来，变异体受体结合力较“野生型”有所下降，如ApoEZ的受体结 合活性下降为不到ApoE3活性的2%，E2的这种受体结合力下降与遗传性脂质紊 乱有密切关系。

编码ApoE的基因位于第19号染色体长臂13区2带(19q13.2)上，基因全

长为3.7kb，含有4个外显子和3个内含子，从5’端到3’端，外显子长度分

别为44bp、66bp、193bp和86Obp，内含子长度分别为76Obp、IO92bp和582bp。 ApoE基因具有多态性，由￡2、￡3、￡43种等位基因构成，分别编码ApoEZ、 ApoE3、ApoE43种异构蛋白，并由此产生6种基因型，即ApoE￡2/2、￡3/3、 ￡4/43种纯合子型和 ApoECZ/3、￡2/4、￡3/43种杂合子型。三种同型 异构体蛋白存在于生物体的循环系统中，但是血浆浓度各不相同，而且同一种异 构体载脂蛋白在不同人体的血浆中的浓度也不尽一致。￡3、 ApoEC3/3分别是 最常见的等位基因和基因型，但不同人种和地域中ApoE基因频率和表型分布可 能存在有差别。￡3是母体，￡2和￡4是两种少见的突变型，CZ和￡4与脂 蛋白受体的亲和力较￡3明显减弱，引起脂蛋白代谢的改变，从而影响神经损伤 的修复[’8]。

非野生型ApoE等位基因可能增加了PD的发病风险，并使发病年龄提前【’”]。 有结果显示，ApoE￡4和ApoE￡4/3基因型都和PD有关[20];在早发PD患者中， ApoE￡4的频率(20.0%)比晚发患者(7.4%)高，而 ApoEE3/3与晚发PD有关 12’]，ApoE￡4可能是散发尸。发生的高危因素[22]。

此外，在延缓WD纯合子的神经症状发生这方面，ApoE基因型被视为一个重 要因素123]。故推测，ApoE基因型和PD、wD相关的运动障碍疾病的发病时间也可 能存在联系，ApoE￡3/3表型的抗氧化作用及稳定细胞膜的性质增加了对铜等 金属离子毒性的防御作用。

的异构体就是由ApoE基因多态性决定的。在人群中3种不同 的A钾E等位基因分布频率不同，因而决定了不同人群中 ApoE表型的颇率差异。ApoE基因中E4等位基因的频率各国 有很大差异，而CHD的发病率也有很大差异。

ApoE基因多态性对低铜蓝蛋白血症相关性运动障碍临床表型影响的研究 ApoE具有3种异构体，即ApoE3、EZ、E4，其差别在于一级结构的不同，即 位于氨基酸序列112位和155位残基的置换:在ApoEZ，这两个位置均为半肤氨 酸(eysteine，Cys);在ApoE4均为精氨酸(arginine，Arg);而在ApoE3的

112位是CyS，158位是Arg。ApoE4t匕ApoE3多一个正电荷，ApoEZt匕ApoE3少 一个正电荷。因ApoE3出现频率最高，故认为是“野生型”，ApoEZ和Ap0E4则 是由它变异而来，变异体受体结合力较“野生型”有所下降，如ApoEZ的受体结 合活性下降为不到ApoE3活性的2%，E2的这种受体结合力下降与遗传性脂质紊 乱有密切关系。

编码ApoE的基因位于第19号染色体长臂13区2带(19q13.2)上，基因全

长为3.7kb，含有4个外显子和3个内含子，从5’端到3’端，外显子长度分

别为44bp、66bp、193bp和86Obp，内含子长度分别为76Obp、IO92bp和582bp。 ApoE基因具有多态性，由￡2、￡3、￡43种等位基因构成，分别编码ApoEZ、 ApoE3、ApoE43种异构蛋白，并由此产生6种基因型，即ApoE￡2/2、￡3/3、 ￡4/43种纯合子型和 ApoECZ/3、￡2/4、￡3/43种杂合子型。三种同型 异构体蛋白存在于生物体的循环系统中，但是血浆浓度各不相同，而且同一种异 构体载脂蛋白在不同人体的血浆中的浓度也不尽一致。￡3、 ApoEC3/3分别是 最常见的等位基因和基因型，但不同人种和地域中ApoE基因频率和表型分布可 能存在有差别。￡3是母体，￡2和￡4是两种少见的突变型，CZ和￡4与脂 蛋白受体的亲和力较￡3明显减弱，引起脂蛋白代谢的改变，从而影响神经损伤 的修复[’8]。

非野生型ApoE等位基因可能增加了PD的发病风险，并使发病年龄提前【’”]。 有结果显示，ApoE￡4和ApoE￡4/3基因型都和PD有关[20];在早发PD患者中， ApoE￡4的频率(20.0%)比晚发患者(7.4%)高，而 ApoEE3/3与晚发PD有关 12’]，ApoE￡4可能是散发尸。发生的高危因素[22]。

此外，在延缓WD纯合子的神经症状发生这方面，ApoE基因型被视为一个重 要因素123]。故推测，ApoE基因型和PD、wD相关的运动障碍疾病的发病时间也可 能存在联系，ApoE￡3/3表型的抗氧化作用及稳定细胞膜的性质增加了对铜等 金属离子毒性的防御作用。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/kdp6.html