拟南芥原生质体的制备及转化

拟南芥原生质体制备转化操作流程

主要试剂

1. 纤维素酶解液： 试剂

15ml酶液体系

1． 1-1.5﹪ Cellulase R10 (YaKult Honsha) 0.225g干粉

2． 0.2-0.4﹪ Mecerozyme R10 (YaKult Honsha) 0.045g干粉 3． 0.4M mannitol 1.09g干粉 4． 20mM KCl 1 ml 0.3 M KCl母液

5． 20mM MES,pH5.7，1 ml 0.3 M MES,pH5.7母液 6． 加入10ml 水

7． 55℃水浴加热10分钟（钝化酶，提高酶的可溶性），冷却至室温后加入以下试剂 8． 10mM CaCl，1 ml 0.15M CaCl2

9． 5 mM β-Mercaptoethanol（可选用） 1ml 75mM β-Mercaptoethanol 母液(Sigma A-6793) 10．0.1﹪ BSA， 1 ml 1.5﹪BSA（4℃保存）

11．用0.45μm滤膜过滤后使用，酶液是淡棕色的澄清溶液。

2. PEG溶液（40%, v/v）（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100ul PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量） PEG4000 ( Fluka, #81240)…………… 1g………………………………….4g 水…………………………………………………0.75ml…………………………..3g 0.8 M Mannitol………………………….. 0.625ml…………………………2.5ml 1 M CaCl2或Ca(NO3)2………………..0.25ml………………………….1ml 约1.2ml

3. W5 溶液（1000ml） 154mM NaCl, NaCl 9g

125mM CaCl2, CaCl2.H2O 18.4g 5mM KCl, KCl 0.37g

2mM MES（PH 5.7）， MES 0.39g

pH to 5.8 with KOH，高温高压灭菌20分钟，室温保存。

4. MMG溶液

MaMg溶液（500ml） 15mM MgCl2，MgCl 0.71g 4 mM MES(PH5.7) MES 0.39g 0.4 M mannitol，Mannitol 36.5g

用KOH调pH 5.7，高温高压灭菌20分钟，室温保存。

5. WI溶液 WI(200ml)

0.5M mannitol，mannitol 18.217g 4mM MES,pH5.7，MES 0.156g

20mM KCl，KCl 0.12g

高温高压灭菌，室温保存。

实验步骤

1. 土培室播种种植拟南芥。

2. 生长良好情况下在未开花前用于取材叶片制备原生质体。

3. 剪取中部生长良好的叶片用新的剃须刀片切成0.5 -1 mm宽的叶条。 4. 将切好叶条掷入预先配置好的酶解液（10ml的酶液用125ml 的三角瓶装）中（每5-10 ml酶解液大约需10-20片叶子（小量））(100 -150 叶片需要40-60ml酶解液（大量）)。并用镊子帮助使叶子完全浸入酶解液。 5. 用真空泵于黑暗中抽5-30分钟。

6. 或者将叶条至于培养皿中加入酶液放入真空干燥箱里，在黑暗中消化3个小时，此步需要根据你自己的实验经验，通常会延长孵育16-18h。（此时可配制PEG4000溶液，200和1000 ul枪头去尖使操作时吸打缓和。）（此时预冷一定量W5溶液）

7. 显微镜下检查溶液中的原生质体，拟南芥叶肉原生质体大小大约30-50 um。 8. 在过滤除去未溶解的叶片前用等量的W5溶液稀释含有原生质体的酶液。 9. 先用W5溶液润湿35-75 um的尼龙膜或60-100目筛子，然后用它过滤含有原生质体的酶解液。

10. 用30毫升的圆底离心管100g，1-2分钟离心沉淀原生质体，如果回收率低可以提高转速或是加入CaCl2（50mM）。尽量去除上清然后用10ml 冰上预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体(电转化用预冷的W1)终浓度为1-2 x 105/ml。

11. 在冰上静至原生质体30分钟。(在有些实验中原生质体在使用前可以在室温终保存) 以下操作在室温23℃下进行

12. 100g离心1-3分钟使原生质体沉淀在管底。在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除W5溶液。然后用适量MMG溶液（1m）重悬原生质体，使之最终浓度在2X105个/ml。 13. 加入10 ul DNA（10-20微克约5kb的质粒DNA）至2ml离心管中。 14. 加入100 ul原生质体（2x104个），轻柔混合。

15. 加入110 ul PEG/Ca溶液，轻柔拍打离心管完全混合（每次大约可以转化6-10个样品）。 16. 诱导转化混合物5-15分钟（转化时间视实验情况而定，要表达量更高也许需要更高转化时间）。

17. 室温下用440 ul W5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好以终止转化反应。

18. 室温下用台式离心机100g离心1-3分钟然后去除上清，将原生质体轻轻吹打稀释至100ul。再加入1ml W5溶液悬浮清洗一次，100g离心两分钟去上清。

19. 用1ml WI或者W5溶液轻柔重悬原生质体于六孔组织培养皿中。 20. 室温下（20-25℃）诱导原生质体18小时以上。 21. 激光共聚焦显微镜下观察GFP标签表达。（以上实验可以根据自己实验情况适当调整）

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