植物DNA的提取

综合性实验设计

——植物DNA的提取及纯度检验方案

班级 组别 成员 指导教师 10级生物科学2班 第七组 刘梦雅、王芳、毛阿威、张杰 刘立亚

2011年11月11日

综合性实验设计

——植物DNA的提取及纯度检验方案

一、 实验目的

1. 学习从生物体中分离核酸的原理和方法； 2. 掌握测定核酸的原理和方法；

3. 掌握核酸的琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；

4. 培养学生创新实践能力和团队合作精神，并强化科研反哺教学效果。

二、 实验原理

1、 关于植物DNA制备的基本原理

植物细胞中DNA主要存在于细胞核内，称为核DNA。细胞质中含有少量的DNA，称之为细胞质DNA，主要分布于线粒体或叶绿体中，分别称为线粒体DNA和叶绿体DNA，细胞内各种DNA称为总DNA。植物DNA的制备，必须首先注意植物细胞的特点：①植物组织中含有坚硬的纤维素，采用温和条件难以破碎细胞；②植物细胞一般具有大的液泡，破碎细胞时有机酸随之逸出将使pH显著下降；③通常植物细胞的DNA含量较低；④植物中含有大量多糖、脂质、色素和酚类等物质，这些杂质往往会与提取的DNA混在一起，给核酸的提取与纯化带来诸多不便。鉴于以上特点，提取植物DNA时除了选择合理的提取方法外，还必须选择适合提取DNA的植物组织和发育阶段。

提取植物DNA的主要程序包括：①破碎细胞壁，释放细胞内含物；②破细胞膜及核膜是DNA释放到提取液中；③除去DNA提取液中含有的RNA、蛋白质、多糖、丹宁及色素等杂质。

2、 关于植物DNA提取的基本方法——CTAB法

CTAB法已成为从植物中提取总DNA的简单而有效的方法，主要用于草本植物和不含酚类或含酚类较少的植物DNA提取。

CTAB（十六烷基三乙基溴化铵），分子式C19H42NBr，是一种表面活性剂，也是一种阳离子去污剂。CTAB可以溶解细胞的细胞膜，使核酸释放出来。首先将植物叶片用液氮研磨，细使胞壁破裂后，再加入CTAB，使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿等抽提纯化。

CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）与核酸形成的复合物在高盐溶液（0.7mol/L NaCl）中是可溶的，当溶液盐浓度降低到一定程度（0.3mol/L NaCl）时，它将从溶液中沉淀。因此通过离心便可将CTAB与核酸的复合物（DNA-CTAB）同蛋白质、多糖类物质分开，DNA-CTAB沉淀呈白色纤维状，很容易从溶液中取出。然后将此复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，因CTAB溶解于乙醇，离心后即可得到初级DNA提取物。

3、关于植物DNA纯化的基本方法

（1）多酚类杂质的去除

对植物中次生产物酚类物质的去除，普遍是在提取液中加入适量的抗氧化剂和螯合剂，防止多酚氧化褐变。在用液氮研磨样品时，加入高分子螯合剂PVP( 聚乙烯吡咯烷酮) 或PVPP( 聚乙烯聚吡咯烷酮)等能络合多酚和萜类物质，使其能被离心除去或被氯仿抽提出去，有效的防止多酚物质氧化成醌类，避免溶液变褐而具有抗氧化作用。

在实验中，往CTAB缓冲液中加入?-巯基乙醇之后再提取DNA也能达到同样的效果。

?-巯基乙醇同样能去除细胞质中大多数生化成分, 同时有效地防止多酚类物质被氧化并除去多糖，从而达到排除多酚类杂质干扰的目的。并且，此种方法更加简便易于操作。 （2）蛋白质杂质的去除

由于核酸在细胞内以核蛋白的形式存在，因此抽提的核酸中仍然不同程度地混杂着蛋白质。对于核酸中混杂着的蛋白质通常用单纯氯仿或氯仿、异戊醇的混合溶液连续振荡分离（氯仿：异戊醇=24：1），离心分离，核酸即留在溶液中。 （3）RNA的去除

从DNA中除去RNA的有效方法是利用RNase选择性地降解RNA。但由于RNase中常含有极微量的DNase，因而必须先将RNase试剂于80~100℃加热处理5~10min。

4、关于琼脂糖凝胶电泳检测DNA

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛选效应。

DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。在一定电场强度下，DNA分子的迁移速率取决于分子筛选效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同相对分子质量的DNA片段迁移速率不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比。同时，凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。

琼脂糖是一种线性多糖聚合物，其浓度越高，孔隙越小，分辨能力就越强。

三、 实验仪器、材料及试剂

（一）仪器

台式高速离心机、恒温水浴槽、高压蒸汽灭菌锅、移液器、陶瓷研钵、分析天平、琼脂糖凝胶电泳系统、离心管、药勺。

（二）材料

1、新鲜的小麦叶片 2、EDTA-Na2 3、琼脂糖 4、硼酸固体 5、溴酚蓝

6、Tris（三羟甲基氨基甲烷） 7、蔗糖

8、GoldViewTM 9、液氮

10、氯仿 11、去离子水 12、?-巯基乙醇 13、NaCl 14、浓盐酸 15、CTAB粉末 16、无水乙醇 17、乙酸钠粉末 18、胰RNA酶固体

（三）试剂

1、植物中DNA的提取及纯化所需试剂

①2×CTAB提取缓冲液 ：含2%CTAB、1.4mol/L NaCl、0.02mol/L EDTA、0.1mol/L Tris-HCl（pH8.0）、0.2%(V/V)?-巯基乙醇。在800ml去离子水中加入81.9g氯化钠、7.45gEDTA-Na2、12.11g Tris（三羟甲基氨基甲烷）、20g CTAB，用盐酸调节pH至8.0，加水定容至1L，高压灭菌，临用前加入0.2%(V/V)的?-巯基乙醇。

②单纯氯仿。

③10mg/mL RNaseA ：将10mg胰RNA酶溶解于987μL水中，然后加入1mol/L Tris-H

Cl（pH 7.5） 10μL、5mol/L NaCl 3μL，于100℃水浴中保温15min，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于—20℃。

④1mol/L Tris-HCl（pH 7.5 ）：在800mL去离子水中溶解121.1g三羟甲基氨基甲烷 （Tris），加入60mL浓盐酸（36%）,冷却至室温后调节pH至7.5，加水定容至1L，分装后高压灭菌。

⑤5mol/L NaCl 在800mL水中溶解292.2g氯化钠，加水定容至1L,分装后高压灭菌。

⑥无水乙醇。

⑦70%乙醇：70mL无水乙醇加水定容至100mL。

⑧3mol/L乙酸钠溶液： 在800mL水中溶解408.1g三水乙酸钠，用冰醋酸调节pH至5.2，加水定容至1L，高压灭菌。

⑨TE缓冲液： 在800mL水中依次加入1mol/L Tris-HCl（pH 8.0）10mL、0.5mol/L EDTA（pH 8.0）2mL，加水定容至1L，分装后高压灭菌。

⑩0.5mol/L EDTA（pH 8.0）：称取186.1gEDTA-Na2 ·2H2O和20gNaOH，溶于水中，并用水定容至1L。

2、 核酸的琼脂糖凝胶电泳所需试剂

①5×TBE（5倍体积的TBE贮存液）：每1000mL中含有Tris 54g，硼酸27.5g ，0.5mol/L EDTA（pH=8）20mL。

②凝胶加样缓冲液（10×loading-buffer）：溴酚蓝 0.4% ，蔗糖 60%。

四、 实验步骤

（一）植物中DNA的提取及纯化

1、取2mL离心管两支，加入2×CTAB缓冲液600μL。将离心管置于65℃水浴锅预热。 2、取新鲜的小麦叶片2g，用蒸馏水洗涤干净并剪成小片，将叶片加液氮在研钵中研磨成粉末，需充分研磨8min，至粉末呈浅灰绿色即可。用干净的药勺将叶片粉末等量分装入预热的2mL离心管中，混匀，在65℃水浴保温1.5h，保温期间每隔10min混匀一次。注：向离心管内转移粉末时不可让粉末解冻。

3、将离心管从65℃水浴中取出，冷却至室温，向离心管中加入等体积，即600μL氯仿，轻轻颠倒混匀5min 。

4、室温下以10000r/min离心10min，取上清液转入另一支干净的2mL离心管中，加入10μL10mg/mL RNaseA（先将RNaseA试剂于85℃加热处理8min）。（若离心机转速要求过低，可采用5000r/min）

5、加入2倍体积的100%乙醇，室温放置约15min，以沉淀DNA。离心获取沉淀，放入另一支干净的2mL离心管中，加入1mL70%乙醇，轻轻颠倒混匀几次，室温下以5000r/min离心5min，把上清液去掉。

6、将DNA在室温下吹干后，加入500μL TE缓冲液溶解，然后加入2-4μL RNaseA，在

37℃保温30min。

7、在DNA溶液中加入等体积氯仿，混匀后室温下以5000r/min离心10min。

8、取上清液，加入1/10体积3mol/L乙酸钠溶液和2.5倍体积无水乙醇，室温放置15min，然后以5000r/min转速离心5min。

9、去除上清液，用70%乙醇冲洗DNA沉淀两次，干燥后，加100μLTE缓冲液溶解，20℃保存。

（二）核酸的琼脂糖凝胶电泳

1、制备琼脂凝胶

按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：

表1琼脂糖浓度与线型DNA分子的分离范围的关系

琼脂糖浓度(%) 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 线型DNA分子的分离范围(Kb) 5~60 1~20 0.8~10 0.5~7 0.4~6 0. 2~4 0.1~3

本次实验采用1％琼脂糖凝胶。配制方法：称取0.2g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入20mL0.5×TBE缓冲液，置微波炉或水浴中加热至完全溶化，取出摇匀，则为1％琼脂糖凝胶。 2、胶板的制备

①将有机玻璃槽洗净、晾干，放置于一水平制胶器中，并放好样品梳子。

TM

②待胶液冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液时，加入1μL GoldView核酸染料，轻轻摇匀，将有机玻璃槽取出放入电泳槽内。 ③混匀的胶液缓缓倒入有机玻璃槽内，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要有气泡）。

④待胶液凝固后，将有机玻璃内槽取出放入电泳槽内。

⑤加入电泳缓冲溶液至电泳槽中使缓冲液刚好没过胶平面，轻轻取出梳子。 3、 加样

DNA样品中按照10：1的比例加入10×凝胶加样缓冲液（loading-buffer），混合均匀使其与DNA样品充分混合。用移液枪将DNA样品加入加样器（记录点样顺序及点样量）。 4、 电泳

①接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。DNA的迁移速率与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。

②当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处，停止电泳。 5、 观察结果

用Dark Reader或凝胶成像仪观察结果，通过带形分析来比较DNA的完整性等质量特点。

参考文献

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﹝3﹞李冠一，等﹒核酸生物化学﹝M﹞﹒北京：科学出版社，2007，381-391，403-404 ﹝4﹞黄卓烈，等﹒生物化学实验技术（M）﹒北京：中国农业出版社，2010，122-124 ﹝5﹞敬国兴，等·植物基因组DNA提取——本科分子生物学实验方法改进﹝J﹞·中国教

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