病例报道：用靶向二代测序对一例多病灶非小细胞肺癌进行分子诊断

病例报道：用靶向二代测序对一例多病灶非小细胞肺癌进行分子诊断

Willemina R. R. Geurts-Giele · Albertina W. Dirkx-van der Velden · Natascha M. M. T. Bartalits ·Leon C. Verhoog · Wessel E. J. J. Hanselaar · Winand N. M. Dinjens

Virchows Arch (2013) 462:249–254 DOI 10.1007/s00428-012-1346-4

摘要 非小细胞肺癌（NSCLC）的组织学和分子亚型对于预测这些病人的存活和对药物的反应是很重要的。高达8%的NSCLC都是多病灶的，这些肿瘤病灶往往是克隆关联的。然而，多重病灶也可以代表不同的原位瘤，与预后和治疗效果。我们描述了一个多病灶的NSCLC病人，从两处单独的病灶获得组织。用常规传统的分子方法来检测两处病灶的克隆关系。此外，用Ion Torrent个体化基因组测序仪（PGM）进行靶向二代测序，来探究这个相对新技术的准确性和额外价值。该病人的两处肿瘤具有不同的激活的表皮生长因子受体（EGFR）突变， EGFR扩增状态、TP53突变状态和杂合性丢失状态。PGM结果证实了传统方法检测到的所有突变，同时在一个肿瘤中检测到了ATM的一个重要性未知的变异体。该病人的NSCLC多病灶代表两个无关的原位瘤。我们的结果表明多病灶的NSCLC应该被看作潜在的多原位瘤。由于活化的EGFR突变的出现有重要的治疗效果，所以应该在出现的所有肿瘤病灶中检测EGFR。在目前的病例中，用PGM进行的靶向二代测序是精确的，

并且和传统的分子检测方法具有可比性。然而，PGM应用于常规的病例分子诊断学中需要用大量病例确认。

关键词 多病灶NSCLC 二代测序 PGM 介绍

非小细胞肺癌（NSCLC）作为肺癌最常见的类型，是癌症死亡率的主要原因。NSCLC的组织和分子亚型对预测生存期和药物效果是很重要的。当NSCLC病人带有激活的表皮生长因子受体（EGFR）突变时用酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）进行治疗比用传统的化疗方法具有更长的无进展生存期。相反地，当NSCLC病人没有EGFR突变时传统化疗方法比TKI治疗效果更好。

高达8%的NSCLC是多病灶的。这些肿瘤是同步发生（同时检测到）或者非同步发生（间隔一段时间后检测到）。多病灶肺部肿瘤可能是克隆相关的，也有可能代表多个不相关

的原位瘤。之前研究表明7—64%的多病灶肺部肿瘤都是不相关的原位癌。范围如此大是因为包括了不同的肺癌亚型和包括或者排除非同步肿瘤。此外，结合不同的分子技术检测失去异质性的肿瘤之间的克隆关系，EGFR、KRAS和TP53的突变情况。从多个原位瘤中区分克隆相关的肿瘤对于个体病人的恰当治疗是最重要的。已报道带有多病灶不同克隆的肿瘤病人可能比多病灶克隆相关的肿瘤病人具有更好的治疗效果。单个原位NSCLC的多病灶性可能预示着病变部位的扩散或恶性可能性。

本研究中，我们描述了一个同步发生的多病灶NSCLC病人。用传统的分子方法阐明了这些病灶是否是克隆相关的问题。并且做了靶向二代测序，以此来验证这个相对较新的技术在肿瘤克隆关系的诊断上的准确性和额外价值。

临床史

研究中所指的病人在69岁时被诊断为患有多病灶肺癌。该病人在出现胸口疼痛和体重减轻之前是个健康的烟民（每年45包）。通过CT扫描，我们发现三个胸膜下的，小节下的病变；两处在左上肺叶，一处在正中肺叶。通过CT

介导的细胞活检，我们没能成功的得到足够的肿瘤样本，所以她被安排进行电视胸腔镜。对位于左肺顶部的两处肿瘤实施了局部切除，一个直径15mm的肿瘤位于腹面（肿瘤1），另一个直径17mm的肿瘤位于背面（肿瘤2）。检查胸膜腔时，在脏胸膜和壁胸膜都发现了扩散小节图像。切除右肺部的肿瘤是不可能的。病理结果表明左肺的两处肿瘤病灶都是腺癌和TTF1阳性的（图. 1b)，表明他们均来源于肺。病人的病情被定级为pT4N0M1 NSCLC。分子分析结果表明两处肿瘤病灶具有不同的EGFR 19外显子缺失，病人开始服用吉非替尼（TKI）。自开始服用吉非替尼起，病人已坚持服用32个月，并且效果很好。手术后30个月进行CT扫描，结果显示疾病没有复发。

材料和方法

取5至15片经过HE染色的福尔马林固定石蜡包埋组织切片（4μm），对其中的正常和肿瘤组织进行手动显微切割。按照之前提到的方法，用蛋白酶K和5%的Chelex 100 树脂提取DNA。

依照标准操作方法，分别用鼠单克隆抗体Do-7（Dako，Glostrup，Denmark）和SPT24（Monosan, Uden, The Netherlands）完成P53

和TTF-1的免疫组织化学染色。为了明确EGFR位点在肿瘤组织中是否有扩增，用EGFR/SE7探针按照标准操作方法进行荧光原位杂交。

用肿瘤DNA做模板，定制的M13尾引物对KRAS的12,13,61和146密码子，EGFR的18-21外显子，以及TP53 的4-9外显子进行序列分析。用Kapa 2G robust hotstart readymix (Kapa Biosystems, Woburn, MA) 依据说明书进行PCR扩增。用核酸外切酶I和FastAP热敏碱性磷酸酶(Fermentas, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)对PCR产物进行纯化。用BigDye Terminator v3.1 试剂盒(Applied Biosystems, Foster City, CA)和M13引物对产物测序。在ABI 3730xl 基因分析仪（Applied Biosystems）对标记的片段进行检测。用Mutation Surveyor v3.24 软件( SoftGenetics, State College, PA)对数据进行分析。当检测到突变的时候，对正常的DNA进行序列分析，以便明确突变是否是肿瘤特异性的。

用

SNaPshot multiplex kit (Applied

Biosystems) 和定制的引物和探针对EGFR进行快照分析，以检测EGFR所有的热点突变和缺失。Snapshot操作方法之前已经描述过。

用正常和肿瘤DNA进行LOH分析。以下微卫星标识用FAM标记的引物进行测序：

D1S199, D3S1038, D3S1300, D5S421,D5S433, D8S133,

D9S157,

D9S1748, PTENCA, D10S541,D13S153,

D13S263,

D17S855,

D17S1353, D17S786,D18S474, 和D19S412。PCR扩增方法同突变分析部分。标记的片段在ABI 3730xl 基因分析仪(Applied Biosystems)上进行检测。用Genemarker v1.85 软件(SoftGenetics)进行数据分析。

根据操作手册，用针对正常和肿瘤DNA的Ion AmpliSeq Cancer Panel在Ion Torrent个体化基因组测序仪（PGM）上完成Ion半导体测序。简而言之，用Ion AmpliSeq Library Preparation Kit构建文库。用 Ion OneTouch Template Kit制备模板。用Ion Sequencing Kit v2.0在Ion 316 芯片上进行测序。用Variant Caller v2.2.3-31149 (all Life Technologies, Carlsbad, CA)进行数据分析。当某个位置被覆盖至少500次的时候就认为是发生了变异。所有引物和探针的序列是可以告知的。

结果

肿瘤1具有混杂的P53染色，大多数细胞是阴性的，但是一些零散的单个细胞显示了轻微的阳性核染色（图. 1c). 肿瘤2中几乎所有的肿瘤细胞都有阳性P53核染色，表明肿瘤2是

TP53突变的。EGFR FISH结果表明肿瘤1中EGFR位点有两个拷贝，肿瘤2是EGFR扩增

的（图. 1d）。

图.1 肿瘤1（上排）和肿瘤2（下排）苏木精-伊红（HE）染色，TTF-1和P53免疫荧光和EGFR荧光原位杂交结果。a HE染色；非小细胞肺癌用箭指示，正常肺组织用箭头指示。两处肿瘤病灶都诊断为腺癌；b TTF-1染色在两处肿瘤都是阳性的，表明他们的肺来源。c

两处肿瘤样本的分子结果总结在表1中。序列分析表明两处肿瘤样本在EGFR 19外显子处都有缺失。肿瘤1是p.E746_A750del (c.2235_2249del15)

，

肿

瘤

2

是

的TP53 4-9外显子都进行了测序。肿瘤1是野生型的，肿瘤2在外显子6上具有p.S215I (c.644G>T)突变（图. 2c）。突变得到了PGM结果的进一步确认（图. 2d）。肿瘤2同样也显示了D17S786的LOH结果，与TP53位点很近（图. 3b）。十条染色体的LOH分析表明T1和T2在四条染色体上的LOH分布不同，包括TP53和APC位点（图. 3）。此外，肿P53染色在肿瘤1的大部分细胞中无染色；肿瘤2显示清楚的核染色。d EGFR FISH中EGFR的位置是红点，染色体7的着丝粒是绿点。肿瘤1的细胞中出现2个拷贝的EGFR，然而肿瘤2显示EGFR位点的扩增。

p.L747_T751del (c.2240_2254del15)（图. 2a）。这些缺失得到了SNaPshot（数据未显示）和PGM（图. 2b）分析结果的进一步确认。两处肿瘤样本的KRAS都是野生型的。两处肿瘤

瘤2的少量PGM序列（该位置覆盖了1351次，其中94条序列有变异）在ATM（(p.Q3014X, c.9040C>T）中检测到了未知重要性的变异（VUS）。PGM未检测到其他的变异。 表1 所述病人两处肿瘤的分子数据总结

FISH 荧光原位杂交，LOH 缺失杂合性，PGM

Ion Torrent个体基因组测序仪，ROH 保留 异质性，WT 野生型

a

只显示有信息标识

b

在1351条序列中检测到94条

讨论

所述病人的多病灶NSCLC代表两个不相关的原位瘤。两处肿瘤具有不同的活化的EGFR突变，是NSCLC早期体细胞突变。两处肿瘤中也发现了几个其他的区别，包括EGFR扩增情况，TP53突变情况，LOH模式，支持了这些肿瘤是不同并且无关的实体的结论。 本病例中，用PGM进行的靶向二代测序结果是准确的；传统分子技术检测到的突变用PGM都得到了确认。肿瘤2中在ATM上检测到了额外的VUS，就目前所知，这点没有被报道过。该变异在密码子3014处引入了提前终止，导致42个氨基酸的短缺。该变异体的实际功能目前还不明确。只在一小部分PGM序列中发现了这个变异，意味着肿瘤内部分子的杂合性。和传统分子分析技术相比，PGM测序在决定肿瘤克隆起源方面会有额外的重要性，尤其当用传统分子技术没有检测到任何突变的时候。由于需要的起始DNA量较

少，甚至细胞水平或者少量的活检样本，PGM 都可以提供多个基因的信息。用

10ng的起始

DNA，Ion Ampliseq Cancer Panel可以检测

46个致癌和抑癌基因的739个热点突变。而

且，PGM测序也可以成功地检测从常规的病

例FFPE样本中提取的DNA。PGM的另一个

优点是高覆盖度，能够检测低至5％等位基因

频率的变异。对于传统测序，样本中需要含有

40%-50%的肿瘤细胞才能正确检测突变，然而

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