质粒DNA生产工艺的研究进展

综述：质粒DNA 生产工艺的研究进展

一、质粒DNA

细菌质粒（plasmid ）是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成分，除了酵母的杀伤质粒（killer plasmid ）是一种RNA 质粒之外，迄今所知的所有质粒无一例外地都是属于这种类型的DNA 分子[1] ，质粒DNA 分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代[2] ，为了更好地适应细胞的生理特点，质粒主要以细长并具有负超螺旋结构的形式存在于原核细胞中[3] 。环形双链的质粒DNA 分子具有三种不同的构型：超螺旋型（SC）质粒DNA ;开环型（0C）质粒DNA和线性（L）质粒DNA 分子[4] 。用于基因工程改造的质粒载体通常包括复制子、选择标记和目的基因和启动子[5] ，为了获得高稳定性、高产量的质粒DNA ，在构建质粒DNA 时，需仔细从以下几个方面着手考虑。

1. 质粒复制子的选择

Prazeres[6] 报道到2010 年，以质粒为核心的基因免疫和治疗的市场产值将会超过450 亿美元，质粒DNA 的需求不断加大。因此，无论从科学还是经济角度出发，在构建DNA 疫苗和基因治疗用途的质粒时，为了提高质粒产量，复制子的选择非常关键，目前，绝大多数学者选择拷贝数高且仅需宿主编码蛋白的ColE1 复制子[7] 。在携带ColE1 复制子的质粒中，RNAII 是复制的正向调节分子，RNAI 是复制的负调节物，另外，由质粒编码的一种Rop/Rom 蛋白可提高RNAI 与RNAII 结合的效率，增强RNAI 的负调控作

用，因此，Rop/Rom 基因缺失至少可使colEI质粒拷贝数提高3至4倍[8]。丫avachev和Wang [9-10] 研究报道非荷载的转移RNA 的二氢尿嘧啶环、反义环和CCA 序列可与RNA I 或RNAII 的环有高度的同源性，从而会影响到质粒DNA 的复制，但是其具体机制还有待进一步的研究。

据Minton[11]报道，pUC19系列载体同样被缺失了rop基因，但其与其他缺失rop 基因的质粒在拷贝数上的表现却不尽相同，这是由于pUC质粒在RNAII序列上带有一个G到A的点突变，可依温度的不同而改变正向调节分子RNAII 的二级结构，Chambers S &Yanisch-Perron C 等研究表明在42 C或者45 C下，RNAII似乎折叠成抗RNAI 抑制的构型，于是DNA 合成的起始加强，结果拷贝数特别高[12-14] 。

尽管构建DNA 疫苗时普遍使用ColE1 类型复制子，但Uhlin B & Remaut E 报道的一种由低拷贝发展而来的由温度控制的“失控型” 复制子同样具有巨大的应用前景，这种失控的质粒可使质粒DNA 大量积聚在大肠杆菌中，其拷贝数可以高达1000[15-16] ，Ansorge M 和Chao Y 证实这种拷贝数已成功地应用来表达大量的重组蛋白[17-18] ，尽管“失控型”复制子的优势非常明显，但还没有使用这个类型复制子来构建DNA 疫苗的成功例子，至今不清楚什么是导致此种复制子未得到开发的具体原因[19]。

2. 抗性基因的选择在选择抗生素抗性基因时，由于极少量即可引起部分人群强烈的过敏反应，首先应避免伕内酰胺类抗生素的使用，而应考虑氨基糖苷类的新霉素和卡那霉素[20] ，因为这些氨基糖苷类的抗生素在临床上很少使用，且无耳毒性、肾毒性等副作用，所以更为合适[19] 。

3. 其他元件的考虑设计、构建DNA 疫苗和基因治疗质粒载体的策略已经十

分明显，它除了必须包括一个能使质粒在大肠杆菌中维持、分裂的元件；一个能促使目的基因在机体内表达的元件和选择标记外，还包括其他一些调控元件，以促使转基因的表达和质粒的稳定[21] ，这些元件包括真核启动子、终止子及其终止信号等，启动子是外源基因在动物细胞内获得表达的必要前提，常见的有CMVI/E、SV40、EF-1 a及UbC 和MHCI等，CMV比SV40[22]和UbC[23]等更为有效，其中内含子A 更能提高CMVI/E 的表达水平[22] ，CMV 现已被广泛使用在商品化载体上，这对商业开发DNA 疫苗来说是十分有帮助的。另外，一些抗原基因本身来源的启动子也可用来构建DNA 疫苗，但对于想同时表达多个抗原基因的质粒而言，此种启动子的效果不明显；常用的转录终止子及终止信号包括牛生长激素（BGH）、SV40及人伊珠蛋白。此外，在构建DNA 疫苗时，可利用非甲基化的细菌DNA-CpG 寡脱氧核苷酸来优化整个质粒，提高DNA 疫苗的免疫原性，这是因为真核生物CpG 的概率只有原核生物的1/16 左右[24]，这种频率上的差异使得其与模式识别受体TLR-9 的相互作用，提高了免疫应答水平

[25]。

4. 目的基因

在选择和构建质粒DNA 时，首先应考虑的是质粒DNA 可否整合入宿主基因组，因此，在选择目的基因时，须严格避免目的基因同人类基因组之间具有长片断的同源序列；启动子和终止子同样须认真筛选以严格控制其生物学活性；此外所有构建质粒DNA 的过程需要有详细的记录，且附有基因的序列，宿主菌的表型和基因型鉴定[26-32] 。

5. 质粒的稳定性

质粒DNA 导入宿主细胞后，必将引起宿主菌生理发生改变[33] ，质粒的复制增加了宿主菌的负担，引起宿主菌生长速率下降，使得重组工程菌的发酵过程比非重组菌的发酵过程复杂化，进而有可能降低质粒DNA 的稳定性；同时，外源基因的插入也会干扰到质粒本身的稳定性，在以大肠杆菌为宿主的发酵过程，还必须考虑到宿主菌的遗传特性[34-36] ，判定其是否存在可以降解重组DNA ，或者产生引起重组DNA 的不稳定性的蛋白酶或其他一些蛋白分子。

5.1 质粒不稳定性的概念

质粒不稳定性，是指工程菌在生长过程中重组质粒发生变化，结果不呈现原有的表型特征。质粒不稳定可分为两类：分离不稳定性和结构不稳定性[37] 。分离不稳定是指在细胞分裂中由于缺陷分配引起部分或全部质粒的丢失；结构不稳定则是由于重组质粒DNA 上的缺失、插入或重排引起的，质粒的分配不稳定性和结构不稳定性的结果都将使我们得不到预期的质粒产量和质量。如果发生质粒分离不稳定，由于部分重组质粒的丢失，工程菌的发酵过程实际上是工程菌和不含有质粒的宿主菌的混合培养，Imanaka[38] 证实在非选择性条件下，含有重组质粒的工程菌的比生长速率（□+）往往小于宿主细胞的比生长速率（T，经过25代后，培养液中几乎都是无质粒的细胞。

5.2 质粒拷贝数质粒拷贝数是体现质粒稳定性的一个重要特征，拷贝数首先决定于自身的遗传特性，同时也受到宿主菌生理状况及生长环境的影响，Enberg & Nordstorm[39] 研究认为宿主菌生长速率增大，质粒的拷贝数下降，这可能是高比生长速率下，质粒的复制速度跟不上细胞分裂的速度，从

而质粒拷贝数不断下降。此外，Koizumi[40] 的研究同样证实了营养物质的限制或缺乏也会导致质粒拷贝数的下降。一般来讲，质粒拷贝数对质粒稳定性的影响因质粒的不同而不同，Futcher & Cox[41] 对几种质粒的稳定性进行了研究，发现质粒稳定性随着拷贝数的增大而增加，但当质粒拷贝数太高时，质粒也往往不稳定，因多次复制，增加了出差错的机会。

5.3 培养方式对质粒稳定性的影响培养基对质粒的稳定性也起着非常重要的作用，Caulcott [42] 研究表明质粒在以葡萄糖作为碳源时的丢失频率大于以淀粉为碳源的培养

基。低温往往有利于重组质粒稳定地遗传，而当温度高于50 C时，

重组质粒在分批培养的对数后期和连续培养时均呈现遗传不稳定状态[43] 。

5.4 解决办法

在重组基因工程菌发酵过程中，克服质粒丢失的最广泛使用也是最有效的方法就是添加针对抗性基因的抗生素。FDA 规定不管在生产还是管理上都应用卡那霉素代替氨苄青霉素，其原因是考虑到B内酰胺类抗生素是一种强烈的过敏原；另外，用抗生素添加法来消除质粒脱落性的不稳定性在大规模生产时并不可取，因为这种选择压力只能维持一段时间，要从根本上解决这个问题，需要研究影响质粒稳定性的各个过程（质粒的复制、质粒的转移及质粒在子代细胞中的分配等）[44] ；此外，质粒的平衡致死系统有可能为彻底摒弃抗生素的使用奠定基础[45] 。

二、菌种库的建立对转化大肠杆菌的条件进行优化。建立原始种子库。分析种子库的遗传稳定性，要明确该种子库可以传代的次数。在此基础上建立主细胞库和工作细胞库，并应保证该类细胞库没有噬菌体和其它外源因子的污

染；并对细菌的遗传背景进行分析和检测，保证细胞库中细菌的遗传背景包括基因型、表型未发生改变；应检测细菌的形态学，保证细菌的均一性；应检测导入基因的存在状态。并对工作细胞库的规模、保存条件、扩增条件、传代过程中质粒的稳定性（拷贝数及表达量）、允许的传代次数等进行研究。三、含重组质粒基因工程菌的发酵

影响质粒DNA 产量的因素最重要的是宿主菌株的遗传背景和质粒分子本身的拷贝数，除此之外，在工业发酵中宿主菌株的生长条件和培养基类型也是不可忽视的条件。一般建议使用endA 基因发生突

变的（endA1 ）大肠杆菌宿主菌株，例如DH5 a, JM109，以及

XL1-Blue 等，因为endA 基因突变的结果，使得大肠杆菌宿主细胞失去了合成具有功能活性的核酸内切酶I的能力，从而增进了所含质粒DNA 分子的稳定性[46] 。

在典型的分子生物学实验中，质粒是由大肠杆菌在摇瓶中发酵生产的，温度、转速和培养基是唯一可控制的因素[47] 。一般培养物的质粒产量在1-10mg 之间；在高密度培养的发酵罐中，诸如培养基组成、温度、pH值、溶解氧、积累的代谢产物，搅拌速度等影响细菌及质粒产量的因素都能得到监测和控制，质粒产量可达摇瓶的10 到50 倍[48] ，Lahijani R[49] 的研究数据显示每升培养基可以产出220mg 质粒DNA ，Schmidt T[50] 也表明质粒产量可达225mg/L 。高密度培养技术的出现，不仅能增加产率，而且也为减少发酵罐容积、减轻分离纯化、减少污水、降低能耗和成本带来好处。

3.1 培养基的组成大肠杆菌可以在营养丰富或贫乏的培养基中生长，但是营养物的种类及来源对质粒DNA 的质量和数量都产生重大影响[51] 。由于可

生产高的细胞密度，丰富的、复合培养物，如酵母膏和/或蛋白水解物很受

欢迎，肉膏因为可能含有疯牛病等动物病毒而成为潜在的污染源被排除在外。除了丰富营养物，还需加入葡萄糖或甘油等碳源物质，Korz[52] 研究表明，以甘油为基础的碳源培养基的生长速度较慢，几乎不产生乙酸，终产物也比以葡萄糖为碳源的培养基多，但当它们超过一定的范围时都会阻止细胞的生

长，这就解释了为什么在间歇发酵

中增加营养物的浓度并不能得到高细胞密度的原因目前，常用的有三种形式的培养基：限制性培养基、半限制性培养基和复合培养基，其可重复性依次降低。O'Kennedy[53] 的研究结果表明，半限制性培养基生产质粒pSV的产量为9.12⑷/mg干菌，比复合培养基的4-6 gg/mg干菌高一些。同时，0'

Kennedy[54]还证实了用于质粒生产培养基最佳的C ：N为2.78 ：1 ,最大比例不要超过12 : 1 ,因为在此范围内，细菌膜上的肽聚糖的成分没有发生改变，不会影响到化学裂解的特性，在试验过程中，0' Kennedy 还发现添加氨基酸后的限制性培养基SDCAS，无论在提咼质粒超螺旋的比例上还是在减少质粒的丢失率上都比LB 培养基的效果好，且SDCAS 经碱裂解后产生的宿主基因组DNA 也明显减少。

3.2 发酵方式的选择发酵一般以分批或者流加的方式进行[55] 。在这两种方式中，流加发酵可以提高细胞密度，并因此可能改变质粒的质量，

Matsui[56] 报道在发酵过程中添加固体葡萄糖，可以使DCW(dry cell weight) 达到134g/L ，质粒在细胞中一般呈现负超螺旋结构，但据了解，宿主菌的生长条件，溶解氧及温度等的改变都可以改变超螺旋质粒的密度[57] 。D.J.Korz[58] 研究证实，溶氧不足或C02 过剩都会促进乙酸形成，促使细胞衰老和死亡，降低质粒DNA 的产量和质量。

Lahijani[59] 探讨了温度和流加操作对质粒产量的影响，培养物在连续流加操作中保持37 C直至OD6OO达到某个数值后，升温至42 C 或45 C,这样可大大提高质粒的产量，补料过程中，可尽量使用氨水来调节pH ，这样可以

补充氮源。也有实验指出质粒的生产因为质粒本身而异，相同发酵条件下不同的质粒产量会有很大差异；但多数研究者认为，控制细菌较低的比生长速率，对质粒的复制有很大的好处，因为，宿主菌过快的直接后果是质粒复制跟不上细菌的生长，导致拷贝数下降或者质粒丢失。理想的质粒收获阶段应该是在细菌生长进入生长对数后期或静止期前期，此时RNA 转录，蛋白质翻译的水平处于最低，质粒的复制达到最高水平。

1989 年，Reinikainen [60] 研究小组得出结论，pH 值介于6.2-6.8 之间和30 C的培养温度有利于ColEI类型复制子质粒产量的提高，此外，添加氯霉素[61 ] ，氨基酸饥饿[62] ，添加痕量维生素[63] 等都可以提高质粒DNA 的产量。

四、质粒的分离和纯化在质粒的最终产物中，宿主基因组片段、高分子量的RNA 尤其是核糖体RNA 和质粒的异构体不利于质粒的基因转染，因此，如何有效消除这些杂质尤为关键。因为质粒DNA 的这种带负电荷的多形结构使得它的电荷性和亲水性能够与许多分子如内毒素和杂蛋白相结合，加大了其纯化的难度，虽然目前有很多种方法可用来纯化质粒DNA ，但迄今并没有一个相关的标准。

在实验室未优化的条件下，质粒产量通常较低，且提取和制备的质粒DNA 损失严重，不符合FDA 等相关组织机构的条例。除此之外，质粒的大规模提取要考虑到如何降低生产成本，并按照生物制品评价和研究中心( Center for Biologics Evaluation and Rrsearch, CBER ) 下属的疫苗研究和管理办公室已有的章程严格执行[64] 。如前所述，质粒纯化时，主要考虑四种杂质：gDNA ，RNA ，蛋白质和内毒素。质粒的工业化

大规模生产除了要除去这些杂质之外，还应该避免使用有毒，有机、易燃试剂和动物源性的酶试剂[65] 。在保证产率和纯度合格的情况下应选择省时、省成本、省纯化工艺的操作流程。所有的操作都应该能够放大到每批生产克级甚至千克级的质粒。最重要的是，所有过程要有重复性，这样才能使生产出的质粒一直符合产品规格。一般的，质粒的大规模纯化包括下面几个或所有步骤：细胞裂解，沉淀，酶消化，柱层析（一步或多步），脱盐或着改变缓冲液，以及无菌过滤。质粒的大规模生产纯化的大致流程如下图所示[66]：

4.1 细胞收集细胞培养结束后，必须通过连续流或者微过滤[67] 对培养菌体进行浓缩，这不仅仅是要对菌体进行浓缩，而且是为了去除对接下来的纯化有影响的培养基成分。

4.2 细胞裂解细菌细胞裂解是纯化流程中的关键一步。可以通过多种手段来完成细胞的破碎：机械破碎（珠磨法、渗透压冲击等），酶解法，热裂解和碱裂解法。

4.2.1 机械裂解

关于机械破碎裂解大肠杆菌以释放质粒的研究表明只有微流体化和珠磨法能获得完整的质粒分子。当用微流化器破碎细胞达65 ％时，

质粒最多可以回收35 ％，而用玻璃珠研磨破碎细胞达50 ％时质粒分子最多可以回收达74 ％，用微流化和玻璃珠研磨破碎细胞后，超螺旋质粒在总释放质粒中分别为80％和94 ％，增加细胞破碎频率将使超螺旋质粒减少至

10 ％以下[68] ，绝大多数质粒呈现“ smear ”形状，为获得相对产量较高

的超螺旋质粒必须降低细胞破碎率，因此，在规模化生产上，这些破碎方法并不适用。

4.2.2 热裂解

Zhijun Wang[69] 等研究认为热裂解具有不需完全破裂细胞、价格低廉、操作简便快捷等诸多优点，其所需设备一般有蠕动泵、去污剂和循环热水浴等，但是我们的热裂解实验结果表明：靠蠕动泵将悬浮在Triton 、EDTA 中的菌液循环于沸水浴一段时间后，得到的菌液粘度太大，不易下一步操作，且含有的宿主基因组DNA 太多，因此我们放弃了进一步的尝试。

4.2.3 碱裂解目前最受欢迎的细胞裂解法是由Birnboim & Doly[70] 提出的碱裂解法，它主要是靠0.2M NaOH 、1%SDS 和pH4.8 的KAC 来完成的，它的整个步骤包括我们常说的SolutionI 、SolutionII 、SolutionIII 三步，首先是将菌体悬浮在SolutionI 中，其中的EDTA 比较关键，它起着两个作用：（1 ）鰲合细胞膜和骨架上的Ca2+ 、Mg2+ ，从而使细胞更易破碎（2）鰲合Mg2+ ，使得内源性DNase 没有Mg2+ 不能发挥作用，保持质粒DNA 的稳定性，另外SolutionI 中的Tris

起着稳定pH 的作用，葡萄糖起着缓冲防止gDNA 断裂的作用。SolutionII 是非常关键的一步，SDS 破坏胞膜，释放菌体内容物，同时也能使绝大多数的蛋白质和脂肪变性并溶解，NaOH 使质粒DNA 和基因组DNA 都变性，而质粒DNA 由于有特有的拓扑超螺旋结构，可以在下一步中自然复性，而基因组DNA 则永久变性，在这一步中注意事项是在混匀过程中动作必须轻柔，原因是防止局部pH 大于13 而导致质粒DNA 不可逆变性和粗暴操作导致的

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