Module 5 相对定量： ΔΔCT法和相对标准曲线法

Module 5相对定量：ΔΔCT法和相对标准曲线法

定量 PCR:相对基因表达量

示例实验

未处理样本目的基因: Plat1

处理后样本

问题:样本处理后，Plat1基因的表达量有什么变化?

示例实验

未处理样本目的基因: Plat1

处理后样本

问题:样本处理后，Plat1基因的表达量有什么变化?

实验流程对照样本

time t=0 t=12 t=24 t=48

total RNA total RNA total RNA cDNA5

total RNA cDNA

cDNA

cDNA

目的基因与内参基因的比较 Rn

Ct= 24– 14= 10Ct=14 Ct= 24 Cycles

内参基因目的基因6

如果加入双倍的cDNA会怎样呢? Rn

Ct= 23– 13= 10Ct=14 Ct= 13 Ct= 24 Ct= 23 Cycles

内参基因目的基因7

比较 Ct法 Rn

t=0

Rn

t=12 h

Ct=23 Rn

Ct=30 Cycles Rn

Ct=22

Ct=27

Cycles

t=24 h

t=48 h

Ct=24

Ct=26 Cycles

Ct=23

Ct=33 Cycles

内参基因8

目的基因

两种相对定量的方法比较 Ct (ΔΔCt)法相对标准曲线法

样本间的倍数关

两种方法的区别?比较 Ct (ΔΔCt)法 没有标准曲线 简单,便宜,通量较高 额外的验证步骤

相对标准曲线法 每个实验里的每个样品都要跑一条标准曲线 工作量大,费用大,通量较低

ΔΔCt法的必要条件两个基因 (目的基因和内参基因)必须有相似的扩增效率!

ΔΔCt法的步骤通过并列跑两条扩增曲线，查看是否平行来确定扩增效率是否相似.

检查指数增长期的曲线之间是否平行

内参基因目的基因

更多数学的方法 . . .

制作两条标准曲线比较斜率

斜率= -3.38

Ct

斜率= -3.32

目的基因内参基因

[cDNA]15

标准曲线可以帮助判断扩增效率 例如,斜率 -3.3说明扩增效率接近 100%. 更小的负值 (例如 -3.5)说明扩增效率小于100%.

公式: E= 10(-1/斜率) -1

ΔCt验证实验A-F=ΔCt1A F B

对应点相减G C H

CtD

I

E J

目的基因内参基因

[Template]17

对应点相减A F B C

A-F=ΔCt1 B-G=ΔCt2 C-H=ΔCt3 D-I=ΔCt4 E-J=ΔCt5D

Ct

G

H

I

E J

目的基因内参基因

[Template]18

在Excel中制作图表

A-F=ΔCt1 B-G=ΔCt2 C-H=ΔCt3 D-I=ΔCt4 E-J=ΔCt5

ΔCt

ΔCt1

ΔCt2

ΔCt3

ΔCt4

ΔCt5

1

2

3

4稀释点

5

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/k9xi.html