核磁共振波谱法测定药物基准物质的绝对含量

如何测定一个没有对照品的化合物含量,用核磁试试吧

分析化学(FENXIHUAXUE)　研究报告第4期

2004年4月ChineseJournalofAnalyticalChemistry451～455第32卷

核磁共振波谱法测定药物基准物质的绝对含量

胡　敏

(湖北药品检验所,武汉430064)

胡昌勤3

(中国药品生物制品检定所,北京100050)

刘文英

(中国药科大学药物分析教研室,南京210009)

摘　要　探讨在新药基准物质的确定过程中,、安妥沙星、卡德沙星、加替沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、学对照品为例,其中安妥沙星和卡德沙星为国家一类新药液为溶剂,对苯二酚或顺丁烯二酸为内标,。,。该方法专属、准确、简便、快速,关键词　,1　引　　言

在新药的研制开发过程中,确定基准物质的含量是该过程的重要环节。由于一类/二类新药没有已知的基准物质作参比,因此,通常需要采用组成分析的方法,通过对药物绝对纯度的分析,最终确定基准物质的含量。虽然差热分析法(DSC)和相溶度法(phasesolubilityanalysis,PSA)可满足部分药物绝对纯度分析的需要,但不适用于对热不稳定的药物的测定[1～3];传统的容量分析方法虽然准确性较高,但通常不具有专属性;而色谱法虽然具有分离上的优势,但相关物质与药物色谱响应值的差异,使得其无法准确测定绝对纯度。

核磁共振法(NMR)用于含量测定早在70年代就有报道,该方法用于定量分析的基础是各化学环境中不同的质子吸收峰的面积只与所包含的质子数有关,不需引进任何校正因子就可直接根据各共振峰的积分值推算所代表的自旋核的数量[4]。目前USP中收载有NMR定量方法[5]。由于NMR法测定药品含量时通常无需专用的药品基准物质,而仅以已知含量的普通化学物质为参比,就可测得药品的绝对含量,所以特别适用于对新药基准物质的含量确定[6]。但国内应用此方法的报道尚较少见。本实验选用9种喹诺酮抗生素对照品,其中盐酸安妥沙星和乳酸卡德沙星为国家一类新药,采用1H2NMR谱评价NMR法定量测定药物绝对含量的准确性并探讨NMR定量中需注意的问题。

2　实验部分

2.1　仪器及测试条件

VARIAN500核磁共振仪(美国瓦里安公司);探头温度25℃,累计采样8次,脉冲延迟5s,脉冲角45°,数据点36000,增益10。2.2　样品及试剂

环丙沙星、安妥沙星、卡德沙星、加替沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、依诺沙星和洛美沙星对照品由中国药品生物制品检定所提供,含量均按有效成分计,结构式如图1;重水(99.8%氘代,北京汉威士波谱公司分装);氘代二甲基亚砜(99.9%氘代,0.03%V/VTMS,CambridgeIsotopeLaboratoriesInc.);氢氧化钠(北京化学试剂公司),分析纯;对苯二酚(北京北郊农场化工厂),分析纯,含量99.5%;顺丁烯二酸(北京金龙化学试剂有限公司),分析纯,含量99.9%。

　2003205207收稿;2003211224接受

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452分析化学第32卷

2.3　测定方法

精密称取一定量的内标,加入选定的一定体积的溶剂配成浓度约为0.02mol/L内标溶液;精密称取一定量的样品,用内标溶液配制成浓度约为0.04mol/L的样品溶液;转入核磁测定管中,采集图谱;测定样品和内标选定峰峰面积的相对比值,按内标法[6]和外标法分别计算含量。各化合物的化学组成、选用的溶剂、内标和用于计算的内标峰的化学位移值见表1

。

　图1　化合物结构

Fig.1　Structureofcompounds

1表1　H2NMR含量测定方法Table1　Methodforthequantitativedeterminationby1H2nuclearmagneticresonance(NMR)

化合物

Compounds

组成

Consistent

C17H18FN3O3 HClC18H21FN4O4 HClC19H20F3N3O3 C3H6O3C19H22FN3O4C18H20FN3O4C18H20FN3O4C16H18FN3O3

H2O2

CHFNO HClC15H17FN4O3D2OD2OD2O

溶剂

Solvent

内标　　

Internalstandard　　

内标化学位移

Internalstandard

chemicalshift

6.8(s)6.8(s)6.8(s)6.5(s)6.5(s)6.0(s)6.0(s)6.0(s)6.0(s)

环丙沙星Ciprofloxacin安妥沙星Antofloxacin卡德沙星Caderofloxacin加替沙星Gatifloxacin左氧氟沙星L2Ofloxacin氧氟沙星Ofloxacin诺氟沙星Norfloxacin依诺沙星Enoxacin洛美沙星Lomefloxacin

对苯二酚Hydroquinone对苯二酚Hydroquinone对苯二酚Hydroquinone对苯二酚Hydroquinone对苯二酚Hydroquinone顺丁烯二酸Maleicacid顺丁烯二酸Maleic顺丁烯二酸Maleic顺丁烯二酸Maleic

D62DMSO

(dimethylsulfoxide)D62DMSO0.3mol/LNaOH0.3mol/LNaOH0.3mol/LNaOH0.3mol/LNaOH

3　实验结果

3.1　NMR测定喹诺酮抗生素含量方法的建立

3.1.1　溶剂的选择　根据喹诺酮抗生素的溶解性选择溶剂。对溶解于水的样品首选重水为溶剂;不溶

于水的样品选用氘代二甲基亚砜为溶剂;如果样品在上述2种溶剂中均不溶解,则选用氢氧化钠的重水溶液为溶剂。测定时,样品内标和外标均采用相同的溶剂溶解;只要溶剂峰不干扰测定,可选用普通的试剂以降低实验成本。实验中我们选用普通的氢氧化钠配制重水溶液,溶剂峰位移值在4.8处,不干扰样品测定。诸样品测定时采用的溶剂见表1。

3.1.2　内标和外标的选择　内标应具有较高的纯度;含有多个质子,并在NMR图谱中表现为尖锐单

峰;吸收峰与所测的样品峰之间应避免干扰。实验中当采用重水和氘代二甲基亚砜做溶剂时,选用对苯二酚为内标,用4个芳香质子单峰来进行定量计算;采用氢氧化钠的重水溶液做溶剂时,由于对苯二酚与氢氧化钠发生氧化反应,故改用顺丁烯二酸为内标,选用2个烯质子的单峰来进行定量计算(表1)。

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第4期胡　敏等:核磁共振波谱法测定药物基准物质的绝对含量45　　3

外标则选用含量已知的供试品对照品或含量已知的相同母核的同类化合物。

3.1.3　定量峰的选择　采用NMR进行定量时应首先对样品的各个质子峰进行归属,明确每个质子峰所对应的质子数,并首选含多个氢质子的单峰用于定量。其中(左)氧氟沙星和安妥沙星各原子的编号与其他喹诺酮有所不同,为讨论方便,将其与其他样品统一编号(图1)。氧氟沙星的1H2NMR图谱如图2所示。对不同的质子峰进行归属、积分,用内标法计算含量(表2)。可见,利用钝峰计算的含量误差较大;偶合裂分峰如裂分数较多时,计算的含量误差较

大;相邻质子峰分离条件不佳时,误差较大;但含有多个质子的峰计算的含量的误差较小。喹诺酮抗生素喹啉羧酸母核和1,82萘啶羧酸母核上与2、5、81图谱

1

ofofloxacin碳相连的质子峰,7,合裂分简单,,。加替沙星母核上2位上的质子峰因受对苯。

表2　用不同的峰计算的氧氟沙星含量值Table2Contentofofloxacincalculatingwithdifferentpeaks

化学位移

Chemicalshift8.3(s)7.5(d)

4.6(m)4.4(m)3.3(m)2.5(m)2.3(s)1.5(d)

质子数

Numberofprotone

11124433

归属

AssignmentC22HC52HCHCH2

含量

Content(%)99.399.2102.3103.0104.7102.999.599.1

RSD(%)0.80.72.41.82.02.80.60.5

哌嗪环Piberazine1′CH2哌嗪环Piberazine2′CH2

N2CH3C2CH3.2　定量结果

内标法测定诸喹诺酮抗生素对照品的含量与其标签示值的结果基本一致,最大绝对误差为1.7%(表3)。利用各样品的选定质子峰与内标峰峰面积的相对比值,各样品互为外标计算含量(表4),不同外标的计算结果的绝对误差约为1%。由表3和表4结果可见,各样品采用内标法与外标法计算,结果一致。

表3　内标法计算结果Table3Contentcalculatedbyinternalstandardmethod

C2C5C8化合物

Compounds

化学位移

Chemical

shift8.5(s)8.3(s)8.8(s)8.5(s)8.6(s)8.3(s)8.3(s)8.3(s)8.3(s)

含量

Content(%)85.890.081.4-96.099.399.290.289.9

化学位移

Chemicalshift7.4(d)7.5(d)7.7(d)7.5(d)7.5(d)7.8(d)7.8(d)7.7(d)

含量

Content(%)85.681.396.695.599.299.390.489.0

化学位移

Chemicalshift7.3(d)

含量

Content(%)86.2

平均值

Average(%)85.990.081.496.695.899.2

标示量

Labelledcontent(%)84.289.881.396.997.199.598.991.190.0

差别

Difference(%)1.70.20.10.31.30.30.30.80.6

环丙沙星Ciprofloxacin安妥沙星Antofloxacin卡德沙星Caderofloxacin加替沙星Gatifloxacin左氧氟沙星L2Ofloxacin氧氟沙星Ofloxacin诺氟沙星Norfloxacin依诺沙星Enoxacin洛美沙星Lomefloxacin

6.9(d)99.199.290.389.4

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454分析化学第32卷

4　讨　　论

4.1　核磁共振定量法的误差

NMR常用的计算方法有内标法和外标法[6]。内标法为NMR定量分析最常用的方法。由于NMR

无法测定质子共振峰的绝对峰面积,只能测定各个峰的相对峰面积比,故不管是内标法测定还是外标法测定,都需在样品溶液中加入一定量的内标物质。内标法通过内标的相对峰面积与样品指定质子共振峰的相对峰面积计算含量;外标法则通过样品与内标和外标与内标的相对峰面积比计算含量。早期文献报道的NMR含量测定误差多在2%～3%[5],随着傅里叶变换强磁场核磁共振仪的普及,测定的分辨率及灵敏度均大为提高,选择合适的条件可提高测定精度和方法的专属性。由表和表4可知,NMR定量的诸喹诺酮抗生素对照品的含量与各对照品标签示值的误差一般不超过氧氟沙星的误差略大(小于2%),提示对喹诺酮抗生素的结果基本一致。由于NMR氢谱的NOE,(如称样、稀释、图谱采集、积分等)。结果表明:采用NMR。

表4　Table4　Contentmethod

外标

Externalstandard

含量Compoundcontent(%)

环丙沙星安妥沙星卡德沙星加替沙星左氧氟沙星氧氟沙星诺氟沙星依诺沙星洛美沙星Ciproflo2Antoflo2Cadero2Gatiflo2L2Oflo2Ofloxa2Norfloxa2Lomeflo2

Enoxacin

xacin

xacin

floxacin

xacin

xacin

cin

cin

xacin

89.1

84.685.3

89.7

95.8

98.2

99.3

99.1100.0100.4

99.8100.2

91.590.990.3

89.288.889.6

80.380.6

环丙沙星Ciprofloxacin安妥沙星Antofloxacin卡德沙星Caderofloxacin加替沙星Gatifloxacin左氧氟沙星L2Ofloxacin氧氟沙星Ofloxacin诺氟沙星Norfloxacin依诺沙星Enoxacin洛美沙星Lomefloxacin

4.2　实验注意事项

影响NMR定量测定准确性的关键在于对选定质子峰的准确积分。为保证积分结果的准确,测定中样品浓度要适宜,使样品峰面积与内标峰面积相差不大,以减少测定误差。此外还应注意:测定前仪器应多次匀场,以保证磁场均匀;吸收峰应进行相位校正,使之呈吸收型正态分布,减少色散型信号对积分结果的影响;可采用不旋转样品管来避免旋转边带峰的产生;图谱基线应平直,积分时应进行基线校正,积分曲线两端应水平;对每一信号进行多次(不少于5次)积分,取平均值或去掉极值后取平均值进行计算,以提高积分的准确性和重现性;测定相对峰面积比时,将参比峰面积设定成较大的数值,以提高计算精度。影响核磁图谱的因素很多,如果发现吸收峰不符合上述要求,计算时应舍去不用。采用外标法定量时应尽量保证操作条件如磁场强度、样品管内径、样品配制方法和浓度、实验温度等一致,并采用母核上相同位置的氢来计算;采用同一种溶剂,可避免因在不同的溶剂中各原子核弛豫时间的不同而引入的定量误差。4.3　与其它对照品含量测定方法的比较环丙沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、依诺沙星、洛美沙星和加替沙星6种喹诺酮抗生素均为国内仿制品种。由于可以得到含量已知的化学对照品做参比,其国家对照品的含量均为采用协作标定的方法确定的(未发表资料)。6种喹诺酮抗生素的NMR测定结果与通过协作标定得到的标签示值含量的偏差在1%左右(见表3),与不同实验室间HPLC协作标定的偏差相仿(未发表资料),提示采用NMR法定量可以满足药品基准物质定量的要求。采用NMR法测定国家一类新药盐酸安妥沙星和乳酸卡德沙星对照品的含量(见表3),与利用组成分析(分别测定对照品中挥发性物质、灰分、酸根和杂质的

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第4期胡　敏等:核磁共振波谱法测定药物基准物质的绝对含量45　　5

含量,采用扣除法确定对照品的含量)得到的结果比较,发现其绝对误差均在0.5%以内;但NMR法测

定更快速、简便。

虽然NMR仪目前在国内尚未普及,但相对于其它药品基准物质测定方法,NMR法具有专属、准确、简便、快速等特点,在建立一类/二类新抗生素国家基准物质时,目前已被列为必备的检测方法。致谢　本实验得到浙江新昌制药有限公司的赞助,华北制药集团有限公司新药研究开发中心协助测定NMR图谱。References

1　ZhuJihong(朱霁虹),YangLahu(杨蜡虎).ChineseJ.Pharm.Anal.(),()～2542　VanDoorenAA,MullerBW.Inter.J.Pharm.,1984,20:2173　YangLahu(杨蜡虎).ChineseJ.Pharm.Anal.(),8(:3454　RackhamDM.Talanta,1976,23:269～2745　USP24/NF19:1221～1222

6　LiuYing(刘　英).J.Pharm.Anal.(药物分析杂志),2001,21(6):447～4527　USP24/NF19:DeterminationofDrugReferenceSubstanceContentby

1H2NuclearMagneticResonanceSpectroscopy

HuMin

(HubeiProvinceInstituteofDrugControl,Wuhan430064)

HuChangqin3

(NationalInstitutefortheControlofPharmaceuticalandBiologicalProducts,Beijing100050)

LiuWenying

(ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009)

Abstract　Thisarticlediscussedthefeasibilityofdeterminingthecontentofreferencesubstanceby1H2nuclearmag2

neticresonancespectroscopy(NMR).9referencesubstancesofquinoloneantibioticswerechosenasexamples,suchasciprofloxacin,antofloxacin,caderofloxacin,gatifloxacin,L2ofloxacin,ofloxacin,norfloxacin,enoxacin,lomefloxacin.D2O,D62dimethylsulfoxide(DMSO),or0.3mol/LNaOHinD2Osolutionwasusedassolvent.Hy2droquinoneandmaleicacidwereselectedasinternalstandard.Bymeasuringtheselectedprotonpeakintensity,thequantitativeanalysisofsampleswasachieved.ThedifferencebetweentheresultofNMRmethodandlabelledcon2tentwasabout1%.Theresultscamefromtheinternalstandardmethodweresameasthoseofexternalstandardone.Thismethodisspecificity,rapid,accurate,simple,anditissuitableforthequantitativedeterminationofthereferencesubstancecontent.

Keywords　Nuclearmagneticresonance,quantitativeanalysis,quinolone

(Received7May2003;accepted24November2003)

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/k9d4.html