猫白介素-18基因的分子克隆、序列分析及其表达研究

根据GenBank中报道的猫白介素-18基因(IL-18)序列,对用ConA刺激的实验猫外周血单核细胞(PBMCf)进行了RT-PCR扩增;将扩增得到的PCR产物纯化后克隆入pMD18-T中得到重组质粒pTIL-18,进行核苷酸序列测定,并与不同物种的IL-18基因进行了序列比较。结果该基因全长579bp,编码1

农业生物技术学报 JournalofAgriculturalBiotechnology2007,15(2):198~202 

· ·研究论文

猫白介素 ­18基因的克隆、 序列分析及其表达 * 

 3 

乔 军 1，, 夏咸柱 1 **, 杨松涛 1,2 , 鞠会艳 1,2 , 黄 耕 1

（1.解放军军事医学科学院军事兽医研究所,长春130062 2.吉林大学农学部,长春130118  

3. 中国农业科学院兰州兽医研究所, 兰州 730046) 

摘要：用猫白介素18(interleukin, （ConA） （PBMCf） 刺激后猫外周血单核细胞 总 RNA进 基因特异性引物对刀豆蛋白

但存在 4 个 Cys 氨基酸序列中， 无信号肽序列和潜在的N­ 联糖基化位点，

分别为 89.8%、 88.6%、 88.4%和

)表达载体 pET28a

行了RT­PCR扩增， 并将扩增产物纯化后克隆入 pMD18­T 中进行核苷酸序列测定。结果该基因全长 579bp， 编码 192 个氨基 酸(GenBank登录号： DQ100372)。在推导的猫 残基。与不同物种 但与小鼠和鸡 88.1%，

中构建了重组质粒 pET相比，

与犬、 羊、

有明显的种属差异。将目的基因片段进一步亚克隆到大肠杆菌转化大肠杆菌 BL21（， 并用IPTG诱导。结果重组菌菌体裂解物经 SDS­PAGE 电泳可检测 DE3）

目的蛋白表达量可占菌体蛋白的 13.6%。 到分子量为 27.5kD的重组目的蛋白。经凝胶薄层扫描，

关键词:猫白介素­18基因； 克隆； 序列分析； 大肠杆菌表达

中图分类号： S188 文献标识码： 文章编号：A 1006­1304(2007)02­0198­05 

CloningandSequenceAnalysisofFelineInterleukin­18 GeneandItsExpressionin 

  1,3 1 1，2 1，2 1 

QIAOJun ,XIAXian­zhu **,YANGSong­tao ,JUHui­yan ,HUANGGeng 

Accordingtofelineinterleukin­18genesequencereportedinGenBank,feline genewasamplifiedby 

genewas579 

RT­PCRfromthefelineperipheralbloodmononuclearcells(PBMCf)stimulatedbyconcanavalin(ConA).ThePCRproductwas purifiedandligaturedwithpMD18­T.Therecombinantplasmidwasusedforsequencing.Thefulllengthoffeline paredwith nucleotide sequenceoffeline GenBank.Meanwhile,thefeline wasfurthertransformedinto of

gel scanning. 

felineinterleuk­18gene cloning sequenceanalysis expressionin

geneshares89.8%、 88.6%、 88.4%and88.1%identitieswith 

and porcinerespectively,butdisplayssignificantdifferenceswithmouseandchicken 

bp,whichencoded192aminoacids(GenbankaccessionNo.DQ100372).TherewerenosignalpeptideandN­glycosylationsites, 

genesofotherspecies,the genesofcanine,ovine,bovine genesequencewhichpublishedin 

genewassubclonedintotheprokaryoticexpressingvectorpET28aandrecombinantvector 

strainBL21(DE3)forexpressionundertheinductionofIPTG.TheresultsofSDS­PAGE 

revealedthatithadamolecularweightof27.5kD,whichamountsto13.6%inthe totalproteinoftheinducedbacteriabytheassaying 

白细胞介素 18 (interleukin­18, 子 （Okamura

最初是从 INF­酌， 故将其命名为干扰素 酌诱导因子( Interferon gammainducingfactor,IGIF)。随后的研究表明，

IL­18 分子结构类似于 IL­21 家族而功能类似于

中毒性休克的小鼠肝脏发现的一种细胞免疫调节因

， 1995） , 它能诱导 Th1 等细胞分泌

* 基金项目： 国家林业局野生动植物保护司资助。

** 通讯作者。AuthorforCorrespondence. 中国工程院院士， 博士生导师， 主要从事动物病毒学研究。

Tel： 0431­6985518 E­mail:<xia_xzh@>. 2006­04­10 接受日期： 2006­05­18 收稿日期：

根据GenBank中报道的猫白介素-18基因(IL-18)序列,对用ConA刺激的实验猫外周血单核细胞(PBMCf)进行了RT-PCR扩增;将扩增得到的PCR产物纯化后克隆入pMD18-T中得到重组质粒pTIL-18,进行核苷酸序列测定,并与不同物种的IL-18基因进行了序列比较。结果该基因全长579bp,编码1

第 2 期 乔 军等：猫白介素 ­18基因的克隆、 序列分析及其表达

199

IL­12 家族，

除能诱导 INF­酌大量分泌， 还可促进 T、 B 淋巴细胞的分化、激活 NK 细胞以及诱导产生

IL­22等, 在抗微生物感染和肿瘤免疫中具有重要的 作用 （Dinarello， 1999； Zhang， 1999； Lebel­Binay 2000）

。鉴于 IL­18 具有广泛的生物学活性和潜 在的开发前景(Biet 

， 2002 Ohkusu 2000)，

因此成为众多细胞因子中的研究热点之一。 虎、 狮和 豹等均属于国家重点保护的大型猫科动物，积极开 展猫 IL­18 研究对于珍稀猫科野生动物病毒性感染 的防治具有重要的意义。本实验对猫

基因进

行扩增及序列测定， 并在大肠杆菌中进行了表达。

1 材料和方法

1.1 主要试剂、 质粒及菌株 

DNA 聚合酶、 DNAgelExtractionKit 和 dNTPs 购自上海生物工程公司。 TrizoL 购自

Invitrogen 公司 （美国)。反转录酶 M­MLV、 RNasin、 T4 DNA 连接酶、

限制性内切酶和 pMD18­T 载体购 自大连 TaKaRa 公司。DMEM培养基为 GIBCO（美 国) 产品；大肠杆菌表达载体

pET28a(+)、

克隆宿主菌 JM109 和表达宿主菌 BL21 (DE3)由本室保存。

1.2 猫外周血淋巴细胞的制备及总 RNA 的提取

对健康的实验猫进行心脏采血，

肝素抗凝， 用淋 巴细胞分离液分离猫外周血单核细胞 （PBMCf）， 用

Hank's 液洗涤 3 次后进行计数，调整 PBMCf 至

1.5伊10  6 个 /mL， 用 DMEM 培养液 （内含 8％的牍牛 血清， 10mg/LConA(A 伴刀豆球蛋白)以及青、 链霉 素 1000IU/mL） 进行培养。37 ℃下培养 24h 后， 用

TrizoL 按常规方法提取 ConA 刺激后 PBMCf 的总 RNA。

1.3 引物的设计与合成

根据 GenBank 中已发表的猫 cDNA 序

列, 设计了 1 对特异性引物 P1 和 P2， 预期扩增长度

为 579bp。

上游引物P1: 

5'­ACCGAATTCATGAGAATTTCGAAACCGTATCTGAG­3'

下游引物P2: 

5'­ACCAAGCTTTCAAGGAGAATTGATGAACATTTG­3'。

为下一步克隆需要， 分别在上、

下游引物中引入 玉和 芋酶切位点，并加有 3 个保护性碱 基。引物由大连 TaKaRa公司合成。

1.4 猫

基因 RT­PCR 扩增、 克隆及序列测定

以提取的总 RNA为模板，以 P2 和 Oligo­T 为 引物按常规方法用反转录酶 M­MLV 进行 RT 反 应。取 RT 产物 2 滋L ， 10伊PCRbuffer5 滋L 、

25 mmol/LMgCl 2 4 滋L

 、引物 P1（25pmol/滋L ）、 P2（ 25 pmol/滋L ） 各 1 滋L ， 2.5mmol/LdNTPs 4 滋L ， 水 32.7 滋应条件为： L DNA96 聚合酶 ℃预变性 （5U/200 滋Ls ； ） 94 0.3℃ 滋,40L 混匀。

s 56 ℃PCR,30 反 s  

72 ℃,50s， 35 个循环；然后 72℃ 再延伸 10min。 PCR 产物用 1.2%琼脂糖凝胶电泳分析。切下目的 DNA 片段，按凝胶回收试剂盒进行回收。取回收 DNA 片段，

与 pMD18­T 载体 16 ℃连接过夜； 将连 接产物转化大肠杆菌 JM109， 然后用 Amp 琼脂平板 上筛选， 并用限制性内切酶酶切和 PCR 方法鉴定获 得重组质粒 （命名为 pET， 送上海联合基因生

物公司进行序列测定。所测序列用 DNAMAN 和

DNAstar 软件分析，并 对不同生物物种 基因

进行遗传进化分析。 1.5 的构建

用

玉和 芋同时分别双酶切 pET和 pET28a， 然后回收目的片段和载体片段， 用 T 4 连 接酶连接进行定向克隆，构建原核表达载体

pET并用酶切和 PCR 进行鉴定。

1.6 在大肠杆菌中的表达及表

达产物的鉴定

将 pET转化于感受态菌 BL21(DE3 )后，

挑 选单菌落， 接种含卡那霉素 （30mg/L） 的 LB 培养基 中， 37 ℃摇荡培养至

0.6~1.0， 加 IPTG（终浓

度为 1mmol/L）诱导 6h。离心收集菌体，重悬于 200 滋L TE 中, 加等体积 2 倍 SDS 凝胶加样缓冲

液， 100 ℃煮沸变性 5min，在 12%的凝胶上进行 SDS­PAGE 电泳以检测目的蛋白的表达，并用双波 长非点扫描仪对上述凝胶电泳的蛋白带进行扫描。

2 结果

2.1 猫

基因 RT­PCR 扩增结果

经 1.2%琼脂糖凝胶电泳 , 猫

基因

RT­PCR 产物为 579bp，

与预期结果相符 （图 1）。 2.2 的鉴定

以重组子 pET为模板，用 PCR 方法进行 鉴定， 可扩增得到 579bp 的核酸片段， 与预期的一

致。将重组质粒 pET用

玉和 芋双酶 切， 可得到 2692 和 579bp2 个片段， 与预期结果一 致 （图 2）， 表明目的基因已克隆到 T 载体中。 2.3 猫 基因 cDNA 序列测定结果及推导的氨

基酸序列

经序列测定表明, 猫

cDNA 的阅读框全

长 579bp，编码 192 个氨基酸。此信息已被 Gen­ Bank 收录， 登录号为 DQ100372。与 GenBank 中报 道的猫

相比，两者核苷酸和氨基酸的同源性

根据GenBank中报道的猫白介素-18基因(IL-18)序列,对用ConA刺激的实验猫外周血单核细胞(PBMCf)进行了RT-PCR扩增;将扩增得到的PCR产物纯化后克隆入pMD18-T中得到重组质粒pTIL-18,进行核苷酸序列测定,并与不同物种的IL-18基因进行了序列比较。结果该基因全长579bp,编码1

200农 业 生 物 技 术 学 报 2007 年

均为 100%。用 SignalIP 软件分析表明， 在推导的猫

氨基酸序列中没有信号肽； PROSITE 软件分 析， 也没有发现潜在的 N­ 联糖基化位点， 但存在 4 个 Cys 残基， 推测可能会形成二硫键结构。在氨基 酸序列比较时，发现猫

分子上存在有

分

即 phe­x(12)­phe­x­ser­x 子类似的特征性序列结构，

和推导的氨基酸序列的同源性分布为 89.8%、

88.6% 、 88.4% 、 88.1% 和 90.6% 、 88.9% 、 85.2% 、

但与小鼠 的差异较大， 核苷酸的同源 84.9%；

性在 66.1%左右，推导的氨基酸序列的同源性为 与鸡 66.5%； 约为 30.1%。

的差异很大， 核苷酸序列同源性

(6)­phe­leu（ x 代表相对变化的氨基酸）

。 图1.Fig.1.AmplificationofM， DL­15000+2000 1， negativecontrol 2and3， feline 

gene.

图 2. 重组质粒 pET的酶切鉴定

Fig.2.Identificationofrecombinantbyenzyme 

digestion 

M,DL­15000+2000 1and3,non­recombinant玉

芋；

2,4,5and6,recombinant玉芋. 

2.4 猫 IL­18 成熟蛋白氨基酸序列二级结构与三级 结构预测

用 HNN软件对猫 IL­18 二级结构预测表明， 猫

IL­18分子包括 3 段 琢­  螺旋，中间由无规则圈曲相

连接 （图 3）； 用 Swiss­model 软件进行三级结构预测 表明，猫 IL­18 三级结构是由无规圈曲连接的多段 平行的 琢­  螺旋所形成中空状的桶样结构 （图 4）。 2.5 不同物种 基因的遗传进化分析

序列分析表明， 猫

基因与犬、 羊、 牛和猪

等哺乳动物的

同源性相对较高(图 5)， 核苷酸

图3.猫 IL­18二级结构分析

Fig.3.Thesecondstructureanalysisoffeline

IL­18by 

hierarchicalneuralnetwork(HNN)method 

图4.猫 IL­18氨基酸序列 3D结构分析

Fig.4.3DstructureanalysisoffelineIL­18aminoacidsequence 

2.6 的构建

以重组质粒 pET为模板， PCR 可扩增出

目的基因片段（图 6）； pET用

芋与预期结果相一致， 双酶切，

可得到 5369表明该重组质粒构建正确。 和 579bp2 个片段 玉（图 和 7），

2.7 猫

基因在

中的表达及其检测

经 SDS­PAGE 分析， pET转化菌的诱导产

物在约 27.5kD处有 1 条特异的蛋白带（图 8 箭头 处）， 与预期值大小相符； 而 pET­28a(+)转化菌的诱 导产物和 pET

转化菌的非诱导产物在该处没

根据GenBank中报道的猫白介素-18基因(IL-18)序列,对用ConA刺激的实验猫外周血单核细胞(PBMCf)进行了RT-PCR扩增;将扩增得到的PCR产物纯化后克隆入pMD18-T中得到重组质粒pTIL-18,进行核苷酸序列测定,并与不同物种的IL-18基因进行了序列比较。结果该基因全长579bp,编码1

第 2 期 乔 军等：猫白介素 ­18基因的克隆、 序列分析及其表达

201

图 5. 不同物种

GenBankaccessionnumberswereasfollows: 

Y11133  

NM_001009207  

基因的遗传进化分析

genes ofdifferentspecies 

TNI555459.

Fig.5.Phylogenetictreebasedonhomologyof 

NM_204608

有蛋白带。结果表明猫 在大肠杆菌中实现了

转化的

表达。凝胶薄层扫描结果显示， pETBL21(DE3)在 IPTG诱导 6h 后的 IL­18 蛋白的最高

表达量可占菌体总蛋白量的 13.6%。

图7. 重组质粒 pETdigestion 

M,DL­15000+2000 1,3,的酶切鉴定

byenzyme 

/ 

玉芋.

芋  

Fig.7.Identificationofrecombinant2,  4,图 6. 重组质粒pET的 PCR鉴定

byPCR 

Fig.6.IdentificationofrecombinantM,DL­15000+2000 1and2,positiverecombinant3 讨论

人 IL­18 于 1996 年首次被克隆（Ushio （Dinarello， 1999； Gardella 

，它是由激活的单核细胞及巨噬细胞产生 1996）

。Ushio ， 1999）

(1996) 用 Northern 杂交技术对成年人不同组织的

图8. 猫

基因在

DE3(BL21)中的表达 genein 

DE3(BL21) 

4~8, 

mRNA 进行分析，结果发现胰、肾、脾和骨骼肌

mRNA 含量较高，肝和肺中也能检测到。 Okamara etal.(1998) 发现肝 Kuffer 细胞

这与有无 LPS 刺激无关， 但单 mRNA 表达量较高，

核细胞只有当 LPS 刺激后才有高表达。在分子组 成，鼠

前体蛋白由 192 个氨基酸组成，分子

Fig.8.Expressionoffeline 

M,standardproteinmarker 1,BL21(DE3)transformedbypET28a  2and3,uninducedBL21(DE3)transformedbyinducedBL21(DE3)transformedbypET

arrowindicates27.5 ；

与鼠 有 65%同源性，也没有糖基化位点和疏

都有

无 N­ 联糖基化位点、 无野生型疏水信号肽 23.8kD，

样位点。人 基因编码 193 个氨基酸前体蛋白，

水信号肽位点。在分子结构上，鼠和人

即 phe­x(12)­phe­x­ser­x(6) IL­1 类似的特征性结构，

根据GenBank中报道的猫白介素-18基因(IL-18)序列,对用ConA刺激的实验猫外周血单核细胞(PBMCf)进行了RT-PCR扩增;将扩增得到的PCR产物纯化后克隆入pMD18-T中得到重组质粒pTIL-18,进行核苷酸序列测定,并与不同物种的IL-18基因进行了序列比较。结果该基因全长579bp,编码1

202农 业 生 物 技 术 学 报 2007 年

­phe­leu。本实验在分析猫 存在 IL­1 类似的特征性结构。

分子时， 也没有发

导 NK细胞产生 IFN­酌(Okamura 。鉴于

现其含有信号肽序列和 N­ 联糖基化位点，但同样

目前的研究表明， IL­18 是一种多效细胞因子， 可能在大型猫科动物疫病 IL­18 的多种生物学功能，

的防治中发挥重要的作用，因此对全长的 基 因进行了融合表达，由于 IL­18 分子含有多段疏水 它主要具有以下生物学功能：第一， IL­18可以刺激

T 细胞进行分化增殖，能诱导 CTL 细胞和 PHA 激

活的 T 细胞的增殖（Reddy， 2004 Okamura 1995）

。第二， 可诱导 B 细胞的分化增殖。Airoldi (2000)检测了 IL­18 对 B 细胞的刺激能力，

发现 IL­18 对活化的 B 细胞具有激活能力，对静止的 B

细胞不产生刺激效应。第三， IL­18 可以通过 IL­2R 的某些成分来激活 NK细胞的增殖 (Okamura 

1998)，

同时诱导 NK细胞的细胞毒活性。第四， 可诱 参 考 文 献 

AiroldiI,GriG,MarshallJD,CorcioneA,FacchettiP, GuglielminoR,TrinchieriGandPistoiaV.Expressionand functionofIL­12andIL­18receptorsonhumantonsillarB cells(J).Journalof 

2000,165:6880~6888 

BietF,LochtCandKremerL.Immunoregulatoryfunctionsof interleukin18anditsroleindefenseagainstbacterial pathogens(J). 2002,80(3): 

147~162 

DinarelloCA.Interleukin­18(J). 

1999,19(1):121~132 

GardellaS,AndreiC,CostiglioloS,PoggiA,ZocchiMRand RubartelliA.Interleukin­18synthesisandsecretionby dendritic

cells

are

modulated

by

interaction

with 

antigen­specificTcells(J). 1999,66(2):237~241 

Lebel­BinayS,BergerA,ZinzindohoueF,CugnencP,Thiounn N,FridmanWHandPagesF.Interleukin­18:Biological propertiesandclinicalimplications(J). 

2000,11(1):15~26 

OhkusuK,YoshimotoT,TakedaK,OguraT,KashiwamuraSI, IwakuraY,AkiraS,OkamuraHandNakanishiK. Potentialityofinterleukin­18asausefulreagentfortreatment andpreventionof 

majorinfection. 

性 琢螺旋结构， 导致表达量不高。将表达的蛋白进 行纯化和复性后，我们初步进行了体外淋巴细胞转 化试验 （MTT 法）， 结果复性的蛋白没有检测到生物 学活性 （另文发表）

， 这与 Ushio 研究结果

不同。 本实验表明， 用原核表达系统来制备具有生物 学活性的 IL­18 蛋白是非常困难的，下一步我们将 利用毕赤酵母或杆状病毒表达系统来表达猫 IL­18， 探讨重组猫 IL­18 的生物学活性，为其在猫科动物 病毒性感染的防治研究提供了基本资料。

OkamuraH,TsutsuiH,KomastuT,YutsudoM,HakuraA, 

TakimitoT,TorigoeK,OkuraT,NukadaY,HattoriK,Akita K,NambaM,TanabeF,KonishiK,FukudaSandKurimoto M.CloningofanewcytokinethatinducesIFN­gproduction byTcells(J). 

1995,378:88~91 

OkamuraH,TsutsuiH,KashiwamuraS,YoshimotoTand NakanishiK.Interleukin­18:Anovelcytokinethataugments bothinnateandacquiredimmunity

1998 70:281~312 

OkamuraH,KashiwamuraS,TsutsuiH,YoshimotoTand NakanishiK.Regulationofinterferon­gammaproductionby IL­12andIL­18(J). 1998,10 (3):259~264 

ReddyP.Interleukin­18:Recentadvances(J). 

2004,11(6):405~441 

UshioS,NambaM,OkuraT,HattoriK,NukadaY,AkitaK, TanabeF,KonishiK,MicallefM,FujiiM,TorigoeK, TanimotoT,FukudaS,IkedaM,OkamuraHandKurimoto M.CloningofthecDNAforhumanIFN­γ ­inducingfactor, expressionin 

andstudiesonthebiologic 

activitiesoftheprotein(J). (9):4274~4279 

ZhangXY(张艳仙).Progressoninterleukin­18(J). 

国外医学

·生理、 病理科学与临床分册).1999,19 (6):532~535(inChinese) 

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/k964.html