WB实验步骤

WB 实验步骤

1. 蛋白提取，吸出培养基，用适量DPBS清洗，吸出DPBS，尽量吸干净，加入适量细胞裂解液，冰上裂解15-30min

2. 用细胞刮刀刮取皿或瓶底部的细胞，收集至1.5ml的离心管中，12000rpm离心，4度，15-30min将上清转移到新的离心管中 3. 检测蛋白浓度，定量（20-40ug），用水和蛋白上样缓冲液配成30ul以内的体积，100度变性10min，冷却后离心，上样

4. 将胶装在电泳槽内，加入1x电泳缓冲液到指定刻度，拔出梳子用注射器清洗胶孔，上样 5. 60V电压压缩蛋白至同一位置（分离胶与浓缩胶交界处），130V分离蛋白。配置转膜缓冲液，并将膜浸泡其中，4度预冷

6. 待蓝色的缓冲液条带到达距离胶底面0.5cm处即可开始转膜，按照从负极到正极海绵，滤纸，胶，膜，滤纸，海绵的顺序组装，避免产生气泡，对应正负极放入转膜槽

7. 低温转膜90min，丽春红染色，初步判定WB效果，并在对应位置将目的条带剪下来 8. 用5%的脱脂牛奶封闭，室温1小时以上，用特定的一抗4度过夜 9. 清洗一抗，用适量的TBST，室温3次，每次10min

10. 加入对应的二抗，室温孵育1小时以上，并清洗3次，同9 11. 按1:1的比例配置发光试剂，并发光 注意

电泳时电压可适当更改，根据个人时间安排及经验

我们有2种膜，PVDF和NC膜，大家可根据需要选用，另外膜的孔径也有差异，0.22um的适合检测分子量较小的蛋白，0.45um的适合检测分子量较大的蛋白

抗体分为兔抗，羊抗，鼠抗等，大家看清楚，抗体通常用5%的牛奶配制 转膜时盒子里面要有冰袋，外面要有冰，尽量保持低温，提高转膜效率 发光液最好现配现用

曝光时不要过曝或者用过曝的图片，可能会掩盖差异

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