犬瘟热病毒水貂分离株F基因的克隆及原核表达

中国兽医科技 2005,35(9):671 674

ChineseJournalofVeterinaryScienceandTechnology

犬瘟热病毒水貂分离株F基因的克隆及原核表达

袁小远

1,2,3

,单 虎,王志亮,李 俊

234

(1.山东省农业科学院家禽研究所,山东济南 250100;2.莱阳农学院动物科技学院,山东青岛 266109;3.农业部动物检疫所国家外来动物疫病诊断中心,山东青岛 266032;

4.山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东济南 250100) 摘要:根据GenBank中登录的犬瘟热病毒F基因序列设计了1对引物,以从水貂犬瘟热病毒中提取的RNA为模板,扩增出一约1000bp的F基因片段。将PCR产物按相应的阅读框架克隆到原核表达载体pET 32a中,并将重组质粒转化E.coliBL21(DE3),用1.0mmol/LIPTG在30 下诱导表达。结果显示,F基因的表达量约占细菌总蛋白的35%。SDS PAGE电泳显示,表达产物的分子质量约为55ku,与预计大小相符;经Western blotting试验进一步证实,该基因获得了正确表达。

关键词:犬瘟热病毒;水貂;F基因;原核表达

中图分类号:S852.659.6:Q786 文献标识码:A 文章编号:1000 6419(2005)09 0671 04

CloningandprokaryoticexpressionofFgeneofcanine

distempervirusfromferret

YUANXiao yuan

1,2,3

,SHANHu,WANGZhi liang,LIJun

234

(1.ResearchInstituteofPoultryScience,ShandongAcademyofAgriculturalSciences,Jinan250100,China;2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,LaiyangAgriculturalUniversity,Qingdao266109,China;

3.NationalDiagnosticCenterforExoticAnimalDiseases,NationalAnimalQuarantineInstitute,MinistryofAgriculture,

Qingdao266032,China;4.ResearchInstituteofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,

ShandongAcademyofAgriculturalSciences,Jinan250100,China)

Abstract:TheFgenewasamplifiedbyRT PCRusingRNAextractedfromthecaninedistempervirusstrainfromferrets,thenclonedintopET 32atoconstructanexpressionvectorpET 32a F.Theconstruc tedpET 32a FwastransformedintoE.coliBL21cells.Anexpectedprotein55kuinsizewasexpressedproperlyfrompET 32a Fat30 inducedby1.0mmol/LofIPTG,whichwasidentifiedcorrectlybyWestern blotting.TheSDS PAGEanalysisshowedthattheproductmadeup35%oftotalbacteriumpro teins.

Keywords:caninedistempervirus;ferret;Fgene;prokaryoticexpression 犬瘟热(Caninedistemper,CD)是由副黏病毒科、副黏病毒亚科、麻疹病毒属的犬瘟热病毒(Ca ninedistempervirus,CDV)引起的急性、高度接触性病毒病。临床上以双相热、急性鼻卡他、结膜炎、严重的胃肠炎和神经症状为特征。此病分布在世界各地,各个季节均可发生,是威胁犬类和毛皮动物的主要疫病之一。

CDVF蛋白是产生中和抗体的重要抗原之一,它所诱导的免疫反应能阻止病毒感染,并且在有病

收稿日期:2005 06 20

作者简介:袁小远(1980,女,山东荣成人,硕士,E mail:xyyuan1980@。单虎为通讯作者。

[1]

毒增殖的情况下可以抑制症状的发生。

目前,对犬瘟热的控制主要是采用疫苗接种,但缺乏有效的检测疫苗免疫效果的方法。本试验在成功构建F基因表达载体的基础上,获得了较高水平的表达产物,并且对表达产物进行了纯化,以此纯化蛋白作为ELISA的包被抗原,为研制犬瘟热抗体检测的ELISA试剂盒奠定了基础,同时获得的F蛋白可以作为病毒亚单位疫苗使用,为CD的免疫预防提供一种安全的新型疫苗。

[2,3]

672中国兽医科技第35卷

1 材料与方法

1.1 病毒和菌种

CDV水貂株由笔者分离并保存;E.coliDH5 、BL21(DE3)均由农业部动物检疫所国家外来动物疫病诊断中心保存。1.2 主要试剂

限制性内切酶EcoR 和BamH 、T4DNA连接酶、小量质粒提取试剂盒购自大连宝生物工程有限公司,胶回收试剂盒购自上海华舜公司,HRP标记羊抗兔IgG购自华美公司,载体pET 32a和His Bindresins柱购自Novagen公司。

1.3 引物

根据GenBank中登录的CDVF基因序列,利用PrimerPremier5.0软件设计了如下1对引物:

P1:5! TTGACTCTAATGA

CC 3!P2:5! GTCAGCAACTTATCA

GG 3!

其中P1下划线处为BamH 酶切位点,P2下划线处为EcoR 酶切位点,预期扩增产物为986bp。上述引物由大连宝生物工程有限公司合成。1.4 RT PCR

病毒RNA的提取按Trizol使用说明进行;RT PCR反应按常规操作[4,5]。反应条件:94 2min,94 1min,55 1min,72 1min,30个循环,最后72 延伸10min。反应结束后取5 LPCR产物于8g/L琼脂糖凝胶中电泳,观察结果。按胶回收试剂盒说明回收PCR产物。1.5 重组质粒的克隆和鉴定

将回收后的PCR产物和表达载体pET 32a分别用EcoR 和BamH 双酶切后回收,按常规方法进行连接、转化E.coliDH5 。将PCR和双酶切鉴定均为阳性的重组克隆pET 32a F送至上海博亚公司测序,以验证其阅读框架是否正确。1.6 重组质粒pET 32a F的诱导表达[7,8]

将重组质粒pET 32a F转化E.coliBL21(DE3)中。挑取单个菌落在5mLAmpLB培养基中37 振荡培养过夜,然后按10%的比例接种于新的5mLAmp

+

+

[6]

脱色后,观察结果。

1.7 Western blotting鉴定

将经SDS PAGE分析后的蛋白条带转移至PVDF膜上,室温轻摇封闭2h;加入一抗(兔抗CDV阳性血清),反应1.5h,TBST洗涤3次;加入1 50稀释的HRP标记羊抗兔IgG,反应1.5h,TBST洗涤3次;然后将膜置于DAB显色液中,显色数分钟后,观察结果。

1.8 表达的融合蛋白的纯化

将表达菌体超声后离心,取上清和沉淀分别进行SDS PAGE。结果显示,表达蛋白以包涵体的形式存在。收集沉淀,充分溶解后用His Bind蛋白纯化柱纯化表达蛋白。

[9,10]

2 结果

2.1 RT PCR的扩增

以CDV水貂分离株的RNA为模板,通过RT PCR扩增得到一约1000bp的特异性DNA片段,与理论设计大小相符(见图1)。

图1 RT PCR的扩增结果Fig.1 AmplificationofRT PCR

1、2.分离株;M.DNA分子质量标准

1,2.Theisolatestrains;M.DL2000DNAMarker

2.2 重组质粒的鉴定

将重组质粒pET 32a F进行PCR扩增,电泳结果显示,扩增出一约1000bp的DNA片段(见图2)。重组质粒用EcoR 和BamH 进行双酶切鉴定,获得与预期大小一致的2个DNA片段(5894bp和986bp),结果见图3。

2.3 重组质粒pET 32a F的序列分析

序列测定结果表明,在pET 32a F中插入的为编码CDV部分F蛋白的基因。通过DNAStar软件,与疫苗株OND进行核苷酸分析和同源性比较,结果显示,两者的核苷酸同源性为97.1%,推导氨98.1%LB培养基中,待D600nm值达到

0.4~0.6时加入IPTG进行诱导,同时对诱导表达的条件进行筛选优化。最终确定最佳的诱导条件为:温度30 ,IPTG终浓度1.0mmol/L,诱导时间4h。将表达菌和未诱导对照菌、空载体对照菌处理

后进行SDS PAGE电泳,经考马斯亮蓝染色,轻摇

第9期 袁小远等:犬瘟热病毒水貂分离株F基因的克隆及原核表达673

图2 重组质粒pET 32a F的PCR鉴定

Fig.2 IdentificationofrecombinantplasmidpET 32a Fby

PCR

1~7.重组质粒的PCR产物;M.DNA分子质量标准

1-7.PCRproductsoftherecombinantplasmid;M.DL2000DNAMark

er

图4 表达产物的SDS PAGE电泳

Fig.4 SDS PAGEanalysisoftheexpressedproductfromF

gene

1.pET 32a;M.蛋白分子质量标准;2.重组菌;3.未诱导的重组菌1.pET 32a;M.ProteinMarker;2.Recombinantbacterium;3.Not inducedrecombinantbacterium

图3 重组质粒pET 32a F的双酶切鉴定

Fig.3 IdentificationofpET 32a Fbyrestrictionenzymedi

gestion

1.重组质粒双酶切后的产物;M.DNA分子质量标准

1.ProductsofpET 32a FdigestedbyEcoR andBamH ;M.DL2000DNAMarker

图5 表达蛋白的Western blotting鉴定

Fig.5 Western blottingassayoftheexpressedproductFpro

tein

1.pET 32a;2.表达的F蛋白;3.纯化后的F蛋白;M.预染蛋白分子质量标准

1.pET 32a;2.ExpressedproductfromFgene;3.Purifiedtargetprotein;M.PrestainedproteinMarker

2.4 重组质粒的诱导表达

将构建成功的pET 32a F转化宿主菌BL21(DE3)后,进行诱导表达。经SDS PAGE电泳检测,于55ku处出现一特异性的条带,与预期大小相符,而对照组相应位置无此条带。经扫描分析,表达的蛋白约占细菌总蛋白的35%。见图4。2.5 Western blotting试验

转印的PVDF膜上出现与预期大小相同的条带,而对照组相应位置无此条带。说明,表达蛋白为犬瘟热的F蛋白,而且可以与CDV阳性血清结合,具有CDV的抗原性。见图5。

2.6 表达产物的纯化

将表达菌体的包涵体充分溶解后,用Ni柱纯化表达蛋白,结果获得了纯度较好的目的蛋白。见

图6。

3 讨论

3.1 pET 32a表达载体采用T7调控启动子来控制目的基因的表达,可将目的基因和载体本身的融合伴侣硫氧还蛋白(TrxA)基因以融合蛋白的形式表达出来。这类表达系统有一个独特的优点,就是用不同的宿主细胞进行外源基因的克隆和表达,在外源基因表达产物是宿主细胞的毒蛋白时,如果在同一细胞进行克隆和表达会很困难,或者是不可能的。因此,本试验将连接产物首先转化E.coliDH5 ,再将鉴定为阳性的重组质粒转化宿主菌E.coliBL21(DE3),进行诱导表达,从而保证了克隆和表达的顺利进行。

3.2 现有的证据表明,包涵体的形成是因为部分折

[10]

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中国兽医科技第35卷

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图6 纯化的目的蛋白Fig.6 Purifiedtargetprotein

1.纯化后的目的蛋白;M.蛋白分子质量标准;2.未纯化的蛋白1.Purifiedtargetprotein;M.ProteinMarker;2.Not purifiedtargetprotein

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,

叠或错误折叠的多肽发生不适当的聚集,而不是由天然蛋白的不溶性和不稳定性所导致的。本试

验可溶性分析显示,目的蛋白以包涵体的形式存在。为了获取可溶性的蛋白,必须将洗涤过的包涵体溶解,通常采用5~8mol/L的盐酸胍或6~8mol/L的尿素来溶解包涵体。每种蛋白所采用的方法可能不同,经过多次摸索,本试验最终确定8mol/L尿素的溶解效果最佳。

3.3 此分离株与疫苗株OND的核苷酸同源性为97.1%,推导的氨基酸序列的同源性为98.1%。两者有如此高的同源性,笔者推测此水貂分离株或许就是OND株。这就对CDV活疫苗的使用提出了疑问:为何使用活疫苗后仍会引起犬瘟热的发生,是因为免疫程序不合理还是由于其他病毒如冠状病毒等的干扰所造成,这些问题有待于进一步地探索和研究。

[11]

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/k461.html