平菇及杏鲍菇原生质体的分离与再生 - 图文

平菇及杏鲍菇原生质体的分离与再生

一：材料及用具

1:固体培养基

PDA固体培养基:马铃薯200g/l，蔗糖20g/l,琼脂20g/l,水1000ml， PH自然;

SPA固体培养基：蔗糖20g,蛋白胨5g,酵母粉5g,琼脂粉12g, 0.6M甘露醇溶液1000ml.

2:液体培养基：马铃薯200g/l，蔗糖20g/l,水1000ml ，PH自然; 3：再生固体培养基：

PDA固体再生培养基：马铃薯200g,蔗糖20g,琼脂20g，0.6M甘露醇溶液1000ml.

SPA固体再生培养基：蔗糖20g,蛋白胨5g,酵母粉5g,琼脂粉12g, 0.6M甘露醇溶液1000ml. 4:再生液体培养基：

PD液体再生培养基：马铃薯200g,蔗糖20g，0.6M甘露醇溶液1000ml.

SP液体再生培养基：蔗糖20g,蛋白胨5g,酵母粉5g， 0.6M甘露醇溶液1000ml.

5:酶制剂：溶壁酶1.5%（用灭过菌的稳渗剂配制） 6:稳渗剂：0.6M的甘露醇；

7:菌株：平菇菌株（平菇1500，2002-4,1218，黑8，冀农11,50869,1206,8902）.杏鲍菇菌株.

8:用具：小刀，玻璃棒，大瓷缸，试管，三角瓶，培养皿，纱布，离心机，小指管，镊子，檫镜纸，移液管，移液枪,恒温振荡培养箱。 二：实验步骤

1：培养基及酶液的配制

①： PDA固体培养基的制备：将马铃薯去皮，挖掉芽眼后称量200g,切成1cm见方的小块。将切好的马铃薯块加适量水放入电热锅中，煮至酥而不烂。用8层纱布过滤，放在1000ml大瓷缸中，加入琼脂20g,蔗糖20g，搅拌直到琼脂蔗糖完全溶化为止，定容至1000ml。121度高温灭菌20min。

②：PD液体培养基的制备：将马铃薯去皮，挖掉芽眼后称量200g,切成1cm见方的小块，将切好的马铃薯块加适量水放入电热锅中，煮至酥而不烂。用8层纱布过滤，放在1000ml大瓷缸中，加入蔗糖20g，定容至1000ml。121度高温灭菌20min。

③SPA固体培养基：称取蔗糖20g,蛋白胨5g,酵母粉5g,琼脂粉12g, 用清水定容至1000ml.，121度高温灭菌20min。

④: PDA固体再生培养基：将马铃薯去皮，挖掉芽眼后称量200g,切成1cm见方的小块。将切好的马铃薯块加适量水放入电热锅中，煮至酥而不烂。用8层纱布过滤，放在1000ml大瓷缸中，加入琼脂20g,蔗糖20g，搅拌直到琼脂蔗糖完全溶化为止，0.6M甘露醇溶液定容至1000ml。121度高温灭菌20min。

⑤：SPA固体再生培养基：称取蔗糖20g,蛋白胨5g,酵母粉5g,

琼脂粉12g, 用0.6M甘露醇溶液定容至1000ml.，121度高温灭菌20min。

⑥：PDA液体再生培养基的制备：将马铃薯去皮，挖掉芽眼后称量200g,切成1cm见方的小块，将切好的马铃薯块加适量水放入电热锅中，煮至酥而不烂。用8层纱布过滤，放在1000ml大瓷缸中，加入蔗糖20g，用0.6M甘露醇溶液定容至1000ml。121度高温灭菌20min。

⑦：SPA液体再生培养基：称取蔗糖20g,蛋白胨5g,酵母粉5g, 用0.6M甘露醇溶液定容至1000ml.，121度高温灭菌20min。

⑧：稳渗剂的配制：取甘露醇109.32g至烧杯中，加水至

1000ml,121度，灭菌20min.

⑨：酶液的配制：取15mg溶壁酶于刻度离心管中，加入渗透

压稳定剂至1ml，摇匀，用0.22的微孔过滤筛过滤（在无菌操作台中进行，现用现配）。

2：原生质体的分离

①：菌丝的培养:将保藏菌株接种于PDA固体培养基上,25度培养。将在培养基上生长7d左右的菌丝接入装有液体培养基的三角烧瓶内，150r/min,25度恒温培养5天。

②：捞取好的菌丝于刻度离心管中，离心6000r/min 15min,去上清，用稳定剂洗涤三次，吸干称重每15mg菌丝加0.1ml酶液，于32度水浴中酶解至原生质体释放量达到最大，约为2-2.5h.将酶解液用两层擦镜纸过滤，滤液离心2500r/min 3min,去上清，用甘露醇稳渗剂洗

涤2次，离心，得纯化的原生质体，加0.2ml稳渗剂制成原生质体悬液。

③：原生质体的再生：直接用移液枪吸取100ul原生质体悬浮液于再生培养基上，用涂布棒涂布均匀，25度培养。或吸取300UL液体再生培养基于剩下的原生质体悬浮液中，25度培养一天（期间摇匀数次），再接于固体再生培养基中25度培养。 三：实验结果与分析 1：酶解情况

平菇，杏鲍菇，酶解1小时后开始出现原生质体，1.5小时时刚酶解出的原生质体还排列成线状，2小时后原生质体基本分离开，1ML酶液中约含有原生质体10000-15000个。

1500 1.5小时 1500 2小时

2：再生情况

平菇和杏鲍菇的原生质体再生出单菌落需要5-9天。且发现

PDA再生培养基和SPA再生培养基对于原生质体形成单菌落的效果几乎无差别；此外将原生质体悬液直接涂布于固体再生培养基上形成

单菌落的数量较先接入液体培养基过夜后再涂布于固体培养上的数量多，再生出单菌落的时间也短于接液过夜后再涂布于固体培养上形成原生质体的时间，因此将获得的原生质体直接涂布于再生固体培养基上即可形成较好的单菌落。

杏鲍菇 生长13天 黑8 生长10天 3：单菌落继续生长情况

将单菌落接入SPA斜面和PDA斜面上，其生长状况如下表

菌种 黑8 生长天数 8 9 10 菌落平均半径(CM) SPA培养基 刚开始生长 0.15 PDA培养基 0.87 1.17 1.43 0.25 0.3 0.4 0.2 0.20 无生长迹象 刚开始生长 0.1 0.1 1218 6 7 8

6

杏鲍菇 7 8 0.1 0.15 刚开始生长 生长情况无变化 0.3 0.4 0.3 0.5 0.7 0.2 0.25 0.3 0.2 0.2 0.3

冀农11 6 7 8 0.1 刚开始生长 生长情况无变化 生长情况无变化 8902 6 7 8 1500 6 7 8 刚开始生长 生长情况无变化 生长情况无变化 由上表可以看出与SPA培养基相比，PDA培养基明显有利于再生单菌落的生长，且菌丝形态与原菌种无差别；SPA培养基上生长的单菌落菌丝堆积，不沿着培养基斜面延伸,随着培养时间的延长培养基颜色逐渐变成棕黄色，且颜色不断加深，其原因可能是SPA培养基的营养不足。因此单菌落形成后将其接入PDA斜面培养基上即可。

SPA斜面上生长的黑8菌株 PDA斜面上生长的黑8菌株

4.再生菌株和原菌株的生长情况比较（PDA培养基）

菌种 生长6天的菌丝半径(cm) 原菌种 黑8 1500 3.45 1.50 再生菌种 1.13 2.75

2002-4 2.70 2.10

8902 4.00 2.70

1206 2.95 1.5

冀农11 4.00 3.33

根据上表可以看出大多数再生菌株菌丝的生长速度低于原种的生长速度。可能是由于再生出的菌株还处于比较脆弱的生长阶段，因此其生长速度较慢。但平菇1500再生菌株的菌丝生长速度却比原菌株的生长速度快，可能是原菌株经过几代培养以后性状不再优良，甚至受到某些抑制因子的作用，因为其原菌株菌丝的生长速度比其它平菇菌种的生长速度要低很多。而其菌丝经过细胞去壁再生后，脱去了原来某些抑制作用，因此再生菌丝的生长速度高于原菌株菌丝的生长速度。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/k31r.html