10_羟基喜树碱的提取方法及工艺优化研究

中国医药生物技术 2010年4月第5卷第2期 Chin Med Biotechnol, April 2010, Vol. 5, No. 2 147 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.02.014

·技术与方法·

10-羟基喜树碱的提取方法及工艺优化研究

赵荣国，真国辉，王贺双

10-羟基喜树碱是从我国特有植物喜树（Camptotheca acuminala Decne）中分离得到的 20 多个单体中抗肿瘤作用最强的生物碱，它不仅是临床效果较好的抗肿瘤药物，而且还是制备其他喜树碱类衍生物药品的重要中间体。由于喜树中 10-羟基喜树碱含量甚微，其制备方法的研究已成为当前热点，其中利用现代生物工程技术的方法尤为引人注目[1]。但至今鲜有报道从喜树细胞培养物中提取天然 10-羟基喜树碱的生产工艺

[2-5]

表 2 试验因素水平表

水平

浓度 A

时间（h）B

0.5 1 1.5

溶剂倍数 C

10 15 20

次数 D 1 2 3

1 0.1% 2 0.3% 3 0.5%

表 3 超声提取试验表

试验号

时间（min）

溶剂倍数

1 30 15 2 30 20 3 60 15 4 60 20

，本文就经次生代谢调控和微生物转化

后的喜树细胞培养物中提取天然 10-羟基喜树碱的方法及工艺进行了研究，以期为规模化生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 试剂 甲醇、乙醇，分析纯，购自天津东丽化学试剂厂；二氯甲烷，分析纯，购自天津瑞金化学试剂厂；氢氧化钠、石油醚、环己烷，分析纯，购自北京化工厂；10-羟基喜树碱标准品由中国药品生物制品检定所提供。 1.1.2 仪器 高效液相色谱仪为美国 Waters 公司产品；Techsphere ODS 色谱柱和 KQ2250DB 超声波清洗仪均为大连依利特分析仪器有限公司产品；RS-20III 冰冻高速离心机为日本 Tokyo 公司产品；H.H.S21.6 恒温水浴锅为上海医疗器械五厂产品。 1.2 方法

1.2.1 细胞培养物样品 将收获的细胞培养物于 60 ℃ 烘箱中烘干后粉碎，过 60 目筛备用。

1.2.2 乙醇回流提取 称取细胞培养物样品 10 g，按表 1 设计因素水平，选 L9（34）正交设计表，进行乙醇回流提取，收集提取液，浓缩后进行测定。

表 1 试验因素水平表

水平

浓度 A

时间（h）B

0.5 1 1.5

溶剂倍数 C

10 15 20

次数 D 1 2 3

1 75% 2 85% 3 95%

乙醇超声提取 30 和 60 min，见表 3。 1.3 含量测定

1.3.1 高效液相色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（60:40）为流动相；流速 1.0 ml/min；柱温 25 ℃；检测波长为 266 nm；出峰时间约 24 min。 1.3.2 样品测定 按照 10-羟基喜树碱标准品的测定条件，分别测定乙醇回流提取样品、碱水回流提取样品以及超声提取样品中 10-羟基喜树碱的含量。

2 结果

2.1 标准曲线的制备

取 0.02 mg/ml 的 10-羟基喜树碱标准液，稀释成 0.8 × 进样 20 μl，以浓度与峰10-3 ~ 12 × 10-3 mg/ml 的系列溶液，

面积进行线性回归，得标准曲线方程：Y = 68.552X+32.138，r = 0.9995。10-羟基喜树碱在 0.8 × 10-3 ~ 12 × 10-3 mg/ml 时浓度与峰面积具有良好的线性关系。 2.2 乙醇回流提取工艺的正交试验

根据极差 R 的大小，其影响顺序为 A > D > B > C，即乙醇浓度 > 提取次数 > 提取时间 > 溶剂量，最佳工艺为 A1B3C3D3，即 20 倍 75% 乙醇回流提取 3 次，1.5 h/次，结果见表 4。

2.3 碱水回流提取工艺的正交试验

根据极差 R 的大小，其影响顺序为 A > D > B > C， 即碱的浓度 > 提取次数 > 提取时间 > 溶剂量，最佳工艺 基金项目：大连市产业技术创新资金项目（2008039）

作者单位：116023 大连国人生物科技有限公司（赵荣国、真国辉）；116024 大连理工大学环境与生命学院（王贺双） 通讯作者：赵荣国，Email：zrgmail@ 收稿日期：2009-09-25

1.2.3 碱水回流提取 称取细胞培养物样品 10 g，按表 2 设计因素水平，选 L9（3）正交设计表，加稀 NaOH 溶液回流提取，收集提取液，适当浓缩，调 pH 至 6.0 左右，离心半径 9 cm，8 000 r/min 离心 10 min，沉淀用适量甲醇溶解后进行测定。

1.2.4 乙醇超声提取 称取细胞培养物样品 10 g，在 25 ℃，工作频率为 40 kW 的条件下，分别以 15、20 倍量的 75%

4

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表 4 乙醇回流提取正交试验安排及结果

因素试验号 A B C D HCPT（g/g，%）

1 2 3 4 5 6 7 8 9 K2 K3 R

1 1 1 2 1 2 2 1 1 3 3 3 2 1 2 3 2 2 3 1 2 3 1 2 3 1 3 2 3 2 1 3 3 3 2 1 0.916 1.000 1.0040.865 1.019 0.9750.092 0.039 0.021

0.912 1.050 0.046

0.303 0.416 0.421 0.317 0.272 0.327 0.282 0.312 0.271

表 6 乙醇超声提取结果

试验号

时间（min）

溶剂倍数 HCPT（g/g，%）

1 30 15 0.342 2 30 20 0.355 3 60 15 0.395 4 60 20 0.429

回流提取的效果较差，可能是 10-羟基喜树碱 E 环的 α-羟基内酯结构遇碱开环生成钠盐后，再遇酸不能完全还原为 10-羟基喜树碱的缘故；以 75% 乙醇作溶剂进行超声提取，有利于喜树细胞培养物中 10-羟基喜树碱的提取，收率高且工艺简单。由于超声波可以使液体流动，并产生空化现象，从而有利于将 10-羟基喜树碱从喜树脱分化组织中快速地浸提出来。喜树细胞培养物中 10-羟基喜树碱提取的最佳工艺为 20 倍量的 75% 乙醇超声提取 60 min。

参考文献

[1] Zhang DY, Zhao XQ, Yu F, et al. Callus induction of Camptotheca

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[2] Zhang ZX, Zhang SX, Song GB. Study on the Camptothecine

extraction technology of Camptotheca leaves. Biotechnology, 2003, 13(5):24-25. (in Chinese)

张志信, 张仕秀, 宋关斌. 从喜树叶中提取喜树碱工艺研究. 生物技术, 2003, 13(5):24-25.

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郭忠军, 麻长娟. 天然喜树碱和10-羟基喜树碱柱层析分离工艺研究. 中医药学报, 2005, 33(4):10-11.

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[5] Ming X, Wei ZH, Xu QH. A process for the extraction of

Camptothecine from fruits of Camptotheca acuminata decne. J Shenyang Agric Univ, 2005, 36(1):101-103. (in Chinese)

明霞, 魏忠环, 徐清海. 从喜树果实中提取喜树碱工艺研究. 沈阳农业大学学报, 2005, 36(1):101-103.

K1 1.140 0.902 0.9420.959 ∑Xi = 2.921

表 5 碱水回流提取正交试验安排及结果

因素试验号 A B C D HCPT（g/g，%）

1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 K2 K3 R

1 1 1 2 1 2 2 1 1 3 3 3 2 1 2 3 2 2 3 1 2 3 1 2 3 1 3 2 3 2 1 3 3 3 2 1 0.731 0.889 0.815 0.814 1.013 0.821 0.868 0.840 0.801 0.835 0.862 0.891 0.094 0.023 0.018 0.026

0.231 0.242 0.258 0.372 0.318 0.323 0.286 0.261 0.254 ∑Xi = 2.545

NaOH 溶液回流提取 3 次， 为 A2B1C2D3，即 15 倍 0.3% 0.5 h/次，结果见表 5。 2.4 乙醇超声提取

由表 6 可以看出，与乙醇回流提取最佳工艺相比，乙醇超声提取 10-羟基喜树碱的得率更高。

3 讨论

通过考察不同的提取方法对 10-羟基喜树碱提取的影响，结果表明：乙醇回流提取时以 75% 乙醇作溶剂效果较好，可能是高浓度乙醇不易穿透脱分化组织的细胞壁；碱水

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