TaNAC提高转基因烟草的抗旱功能

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中国烟草学报 2010年12月第16卷第6期

生物技术

TaNAC提高转基因烟草的抗旱功能

刘美英1,2,冶晓芳2,唐益苗2,高世庆2,张 朝1,2,赵昌平2,陈学平1

1中国科学技术大学研究生院,化学系,合肥市金寨路96号230026;

2北京市农林科学院,杂交小麦工程技术研究中心,北京市海淀区西郊板井曙光花园中路9号100097

摘 要:NAC(NAM ATAF CUC)转录因子在植物逆境胁迫应答反应中发挥重要作用。通过同源克隆的方法从小麦中分离得到一个编码NAC转录因子的基因 TaNAC,该基因编码的蛋白序列结构特殊,N端为保守性差的NAC保守域,只包含A,B,D3个亚结构域,进化关系上与DREB家族更近,其C端共同享有多个基序。实时荧光定量PCR实验证实TaNAC基因受干旱诱导24h后强烈表达。将该基因构建到PBI121双元植物表达载体的35S启动子下游,通过农杆菌介导的叶盘转化法转入烟草,获得T1代转基因苗。模拟干旱胁迫处理实验表明,过量表达TaNAC的转基因烟草表现出明显优于野生型对照的抗旱功能,说明TaNAC基因的过量表达能够提高烟草抗旱能力,TaNAC可以作为烟草抗旱育种的优良候选基因资源。关键词:NAC;转录因子;系统进化树;干旱胁迫;转基因烟草doi:10 3969/j.issn.1004 5708 2010 06 016中图分类号:S572 032

文献标识码:A

文章编号:1004 5708(2010)06 0082 07

EffectsofTaNACondroughtresistanceintransgenictobaccos

LIUMei ying1,2,YEXiao fang2,TANGYi miao2,GAOShi qing2,ZHANGZhao1,2,

ZHAOChang ping2,CHENXue ping1

1DepartmentofChemistry,GraduateSchoolofUniversityofScienceandTechnologyofChina,Hefei230026,China;

2BeijingEngineeringandTechniqueResearchCenterofHybridWheat,BeijingAcademyofAgricultural

andForestryScience,Beijing100097,China

Abstract:NAC(NAM ATAF CUC)transcriptionfactorsplayimportantrolesinvariousstressresponse.Inthisstudy,oneNACgenenamedTaNACencodingaNACproteininwheat(TriticumaestivumL.)wasidentified.TheputativeTaNACpro teinstructurewasspecial.TheNterminalDNAbindingdomainconsistedofonlythreesubdomains(A,B,D),whiletheC terminalwassimilartotheDREBprotein,sharingseveralmotifs.Real timePCRconfirmedthatTaNACwasstronglyinducedafter24hunderdroughttreatment.TaNACwasconstructedintoPBI121byconnectionwith35Spromoter;transgenicseedlingswereobtainedbyAgrobacterium paringtowildtypes,overexpressionofTaNACgeneshowedsignificantdroughtresistanceintransgenictobaccos.ItalsoindicatedthatTaNACwasexcellentcandi dateforplantdroughtbreeding.

Keywords:NAC;transcriptionfactor;phylogenetictree;drought;transgenictobacco

NAC(NAM ATAF CUC)转录因子是近十几年来

作者简介:刘美英,女,硕士,主要研究方向:作物遗传育种,E mail:

liumy@

陈学平(通讯作者),男,博士,副教授,主要研究方向为作物遗传育种,E mail:chenxp08@

基金项目:国家转基因生物新品种培育重大专项(2008ZX08002 002,

2008ZX08002 003,2008ZX08002 004)

收稿日期:2010 06 02

新发现的具有多种生物功能的植物特异转录调控因子。Aida等首先报道了NAC结构域,发现矮牵牛NAM基因和拟南芥ATAF1/2和CUC2基因编码蛋白的N端均包含一段保守的氨基酸序列,取其首字母命名为NAC[1]。第1个NAC转录因子由Souer等从矮牵牛中克隆得到[2],随后在拟南芥、水稻、小麦、大豆等物种中

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中,Jensen等对大麦HvNAC6进行基因沉默的研究证明,大麦表皮细胞形成对白粉病毒性细胞的渗透抵抗,另外研究证实该基因的同源基因ATAF1也可以被白粉病毒诱导[23]。

DREB转录因子属于AP2/EREBP转录因子家族,它能与核心序列为5 CCGAC 3 的脱水响应元件(DRE,dehydrationresponsiveelement)或者类似DRE的序列CRT结合,参与干旱、高盐等胁迫应答反应,在逆境胁迫调控中起重要作用[24 25]。

本研究从小麦中克隆得到1个NAC转录因子基因 TaNAC,通过在烟草中过量表达TaNAC基因研究了该转录因子抵御干旱胁迫的能力,为烟草育种提供了参考。

相继发现,目前在拟南芥和水稻中分别存在106和149个NAC成员[3 4]。研究表明,NAC转录因子在顶端分生组织和花器官发育[1 2,5 6]、植物侧根发育[7 9]、叶片凋亡

[10]

、作物品质

[11 12][15]

、次生壁形成

[13 14]

和木质部形

成等生长调节过程,以及抵御多种生物和非生物胁

迫过程中均发挥重要作用。

NAC受多种生物胁迫和非生物胁迫的诱导表达。目前,已经从多种植物中分离鉴定得到与抗逆相关的NAC转录因子。Tran等采用酵母单杂技术从拟南芥中分离到3个NAC基因ANACO19,ANAC055,ANAC072,它们的表达受干旱、高盐和ABA的诱导,过量表达3个基因中的任何一个都可以增强植株的耐旱能力

[16]

。

水稻抗旱耐盐基因SNAC1,其主要在气孔的保卫细胞中被诱导表达,当植株受到干旱胁迫时,基因的表达促进气孔关闭,但是不影响光合速率,因而抗旱性大为提高。在生殖生长期遭遇严重干旱的情况下,过量表达SNAC1的转基因植株结实率较对照提高22%~34%[17];ATAF1是最早发现的NAC转录因子之一,其功能一直未知,Lu等证实了ATAF1为干旱诱导型基因,它的表达受干旱胁迫和ABA处理的诱导,而在水处理下受到抑制。敲除该基因的突变体ataf1,在干旱胁迫后的恢复反应测试中,恢复率是正常对照的7倍,同时,已知的干旱诱导型基因(RD17、ERD10、KIN1、RD22、COR78和LT178)表达水平提高,这些结果说明ATAF1基因作为负调控转录因子,通过下调抗逆相关基因的表达在胁迫反应中起作用[18]。水稻OsNAC6的表达不但受到干旱、低温、高盐等非生物胁迫的诱导,还受机械损伤和稻瘟病的诱导,过量表达该基因的水稻提高了对干旱,高盐及稻瘟病的耐受力,但是表现出生长阻滞和低产[19]。Oh等从辣椒中分离到NAC类转录因子基因CaNAC1,该基因受病原菌快速特异诱导,同时受外源水杨酸和乙烯的强烈诱导表达[20]。Delessert等发现拟南芥转录因子ATAF2在叶片损伤部位高表达,并对损伤植物中的激素甲基茉莉酮酸和水杨酸诱导作出响应,超量表达ATAF2的转基因植株对土生镰刀霉菌敏感性增强,说明ATAF2作为病原相关蛋白的负调控子在防御反应中起作用

[21]

1 材料与方法

1 1 材料

小麦京冬17(TriticumaestivumL.)为北京杂交小麦工程技术研究中心培育的冬小麦抗旱品种,根癌农杆菌C58C1,烟草(NicotianatabacumL.)W38本实验室保存。1 2 样品处理

将25 光照培养2周左右的小麦 京冬17 植株进行干旱、高盐、低温胁迫处理,具体步骤如下:干旱处理:将小麦幼苗整个植株从盆中移出,用蒸馏水将根部泥土冲洗干净,滤纸吸净根部水分后,植株置于滤纸上进行快速干旱胁迫处理;高盐处理:将小麦幼苗置于200mmol/LNaCl溶液中,室温;低温处理:将小麦幼苗置于4 培养箱中,以上胁迫反应分别在处理0h、lh、2h、5h、10h、24h后取样,迅迅速置于液氮速冻, 80 保存备用。

1 3 TaNAC基因的克隆

根据北京天根生化科技有限公司提供的方法完成植物叶片组织的总RNA提取,之后以提取的总RNA为模板,以AP(5 GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3 )序列为引物、用RevereTran scriptase(M MLV)进行反转录,得到用于后续实验的cDNA模板。同时,以水稻NAC家族基因为参照序列,利用同源克隆的方法设计引物TaNAC F:5 TCCCCCGGGACCATGGAAGGGCTCGACGTC 3 ;TaNAC R:5 TCCGAGCTCTTAATGGACACTTGCAGACGA cD

。Selth等证

实在复制增强子的作用下,番茄缩叶病毒诱导SINAC1在染毒细胞中特异表达,过量表达SINAC1导致TLCV病毒DNA大量积累,说明SINAC1在复制增强子增强的[22]

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NA,将每个cDNA样品取出一部分,组成各种处理材料的混合cDNA模板),以TaNAC F/R为引物,进行RT PCR反应,扩增程序:94 预变性5min,94 变性30s,62 退火45s,72 延伸1min,共32个循环,之后72 10min。

1 4 构建系统进化树与基序分析

使用DNAMAN软件将测序成功的核苷酸序列翻译为蛋白序列,进化树分析之前,NCBIBLAST搜集TaNAC的近缘序列,包括DREB家族及NAC家族的几个基因,整理得到这些序列开放阅读框(ORF)的FAS TA文件,在MEGA4 0中生成进化树,主要参数设置为:邻近法建树,拔靴法(重复计算次数1000;随机种子64238),成对缺失,泊松修正

[26]

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基因和内参基因的CT值;Timex指处理的不同时间点(胁迫处理1h、2h、5h、10h、24h),Time0表示经actin校正后1倍量的目标基因未处理时的表达量。

CT=(CT.Target-CT.Actin)Timex-(CT.Target-CT.Actin)Time0

1 6 转基因烟草抗旱功能验证

将TaNAC基因连接到PBI121双元植物表达载体的35S启动子下游,构建过量表达载体,并通过根癌农杆菌C58C1介导的烟草叶盘转化法转化到烟草W38株系中。待PCR检测为阳性的转基因烟草植株生长到一定高度后移栽至花盆,24 ,16h光照培养,5个月左右收获种子,之后进行模拟干旱胁迫处理,经消毒处理的种子播种到含2%PEG的MS培养基中,观察转基因苗和野生型对照的生长情况。

。将TaNAC同几个

NAC家族的序列提交到TheMEMEsuitetool(/meme4_4_0/cgi bin/meme.cgi),主要分析其N端序列,将TaNAC同DREB家族的几个序列同样提交到该网站,主要分析其C端序列。本实验中用于进化树分析和基序分析的蛋白序列GeneBank登录号如下:WheatTaNAC2(AY625683),(HM027572),(DQ394702),

TaNAC6OsNAC4

(HM027573),(AB028183),

TaNAC4TaDREB4BONAC300

2 结果与分析

2 1 TaNAC基因的克隆

本实验以小麦胁迫处理材料的混合cDNA为模板,利用同源克隆的方法分离得到1个NAC转录因子家族的基因,其核苷酸序列及编码的氨基酸序列如图1,TaNACORF长度1445bp,编码485个氨基酸,Scan Prosite(/tools/scanprosite/)输出的NAC保守域在图中用灰色背景标示。2 2 进化树生成与基序分析

TaNAC与NAC及DREB转录因子的系统进化关系如图2,图中显示,TaNAC与DREB进化关系更近,这个结果与NCBIBLAST查询一致,均说明我们所分离的基因的特殊性,该基因与所有的已知序列相似性都很低,它具有NAC转录因子的保守结构域,而从进化关系上看来,又具有DREB家族的特征,进一步的序列基序分析发现,TaNAC与NAC家族的其他转录因子相比,保守域序列的保守性较差,其亚结构域并非典型的A,B,C,D,E5个亚结构域[28],而只包含A,B,D3个亚结构域(图中的motif1,2,3,4,5分别对应亚结构域B,D,A,E,C),且保守性也较差(如图3A)。对TaNAC与部分DREB家族的蛋白序列基序分析表明,TaNAC与DREB家族的某些基因相似性更近,这些序列的C端至少共享4种以上基序(motif1,5,6,10),如图3B所示。

(AAX13283),TaDREB4A(AAX13282);riceSNAC1(AB182278);Leymuschinensisunnamed(ACH73204);AegilopscolumnarisDRF1(ACX94335)。1 5 TaNAC干旱、高盐逆境胁迫下的基因表达

利用步骤1 2中反转录得到的干旱、高盐胁迫处理的cDNA模板,实验研究了TaNAC基因在这两种非生物胁迫条件下的表达情况。选用wheatactin(GeneBank登录号AB181991)作为本实验的内参基因,内参基因扩增引物actin F:5 CGGCTACCACATCCAAGGAA 3 ;actin R:5 GCTGGAATTACCGCGGCT 3 。从目的基因的非保守序列部分设计引物,控制扩增片段长度尽量接近内参基因长度,目的基因扩增引物序列TaNAC F1:5 AGGACCACTTGTTCAAACCG 3 ,TaNAC R1:5 CCAGCATGAAGATTGTCCCT 3 。本实验环节PCR扩增程序:95 预变性15min,95 20s,60 20s,72 20s,共40个循环,72 10min。实时定量RT PCR完成后,采用2 CT算法[27]分析实验结果(公式如下),其中CT.

Target和CT.Actin分别是目标

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图1 TaNAC

基因核苷酸序列及编码的蛋白序列

别见图4A,图4B。干旱诱导下,处理24h后TaNAC基因强烈表达;NaCl诱导下,处理1h后转录水平表达积累至峰值,而后慢慢恢复至原始水平。2 4 转基因烟草抗旱功能鉴定

图5是T0代阳性植株收获的种子在含2%PEG的MS培养基上的生长状况,左图,种子萌发后2周的生长情况,平板左半边是转基因株系,右半边为野生型对照,转基因烟草在培养基上生长良好,而野生型对照发芽率及植株高度均受到PEG抑制。右图,种子萌发后1个月生长状况,平板的左半边是野生型对照,右半

图2 TaNAC与已知序列的系统进化树分析

注:底部图标表示therelativedivergenceofthesequences,节点上的数字代表bootstrap值,实验分离的TaNAC基因用实心三角标示。

边是转基因苗,受PEG影响,两者叶片均出现一定程度的卷曲,转基因苗较对照苗植株高度更高,且根的长度更长。以上实验结果均说明过量表达TaNAC的转基因烟草提高了植株的抗旱功能。

2 3 TaNAC受干旱诱导强烈表达

TaNAC在干旱、高盐胁迫处理下基因表达趋势分

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图3 TaNAC蛋白序列基序分析

注:图中第1列为基因名称,第2列为基序结合p value值,第3列代表不同基序在整个氨基酸序列中所处的位置,图下面不同颜色小方块代表不同的基序,

上下两个图中相同的颜色指代不同的基序。

图4A TaNAC基因干旱胁迫处理下的相对表达趋势

图4B TaNAC基因高盐胁迫处理下的相对表达趋势

注:图中横坐标代表胁迫处理时间,

纵坐标代表基因相对表达量

图5 T1代小苗2%PEG胁迫处理生长情况

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.2005,

3 讨论

本研究利用同源克隆的方法从小麦中克隆到1个基因TaNAC,该基因编码的蛋白序列结构非常特殊,其N端为保守性差的NAC结构域,仅包含A,B,D3个亚结构域,C端序列与DREB家族转录因子相似性很高,且在进化关系上两者更近。干旱和高盐胁迫处理表达实验确认TaNAC基因受干旱诱导强烈表达,对高盐处理敏感。构建该基因的过量表达载体并通过农杆菌介导的叶盘转化法将TaNAC转入烟草,PEG胁迫处理实验表明转TaNAC基因烟草具有抗旱性,证明了TaNAC基因在烟草中成功表达,且提高了烟草的抗旱能力,可以作为烟草抗旱育种的优质候选基因。

TaNAC与已知的NAC转录因子同源性很低,同胁迫相关NAC转录因子的同源性也很低,从结构和进化关系看来,TaNAC所具有的抵御干旱胁迫的功能可能不是由NAC家族的共有结构特征决定的,其C端序列与DREB家族转录因子具有高度相似性,而DREB家族基因主要功能就是参与逆境胁迫应答,本实验所分离的TaNAC转录因子的功能是由N端的保守域决定,或是C端结构决定还需要更进一步的研究,这一工作将为研究植物转录因子提供新的思路。参考文献

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2010年度 中国烟草学报 引证数据

中国科技信息研究所 万方数据 发布的 2010年版中国期刊引证报告 显示: 中国烟草学报 各项评价指标保持较高水平(见表1),其中,主要学术影响力指标 总被引频次、影响因子、他引率、基金论文比等,较2009年度有所提高,影响因子达到1 195(中国境内6063种科技期刊影响因子 1的期刊共380种),比2009年提高0 223,比同期国内6063种科技期刊影响因子平均值0 422(见表2)高0 773, 学报 在 轻工纺织食品类 (56种期刊)学科中影响因子位列第一;总被引频次910次,比2009年提高了177次,比同期科技期刊平均值756次高154次,基金论文比0 650,比2009年提高了0 09,比同期科技期刊平均值0 300高0 350。 中国期刊引证报告 在与国际评价体系保持一致基础上,结合中国期刊实际情况,选择总被引频次、影响因子等18项计量指标,主要显示该期刊被读者使用和重视程度,以及在学术交流中的地位和作用,是评价期刊质量优劣的客观标准。

表1 2010年版 中国烟草学报 引证数据

文献被引指标年度20092010增加值

文献来源指标年度20092010增加值

总被引频次733910177来源文献量8410016

影响因子0 9721 1950 223文献选出率0 9330 9500 020

即年指标0 0830 0900 007平均引文数14 8116 061 26

他引率0 8720 9100 038平均作者数4 9174 730-0 187

引用期刊数14518944地区分布数1617

1

学科扩散指标0 0810 1600 079机构分布数44517

学科影响指标2 3393 3801 041海外论文比0 0240 000-0 024

被引半衰期

5 8656 3100 445基金论文比0 5600 6500 09

H指数880引用半衰期7 5907 480-0 110

表2 中国期刊主要计量指标平均值统计(6063种期刊)指标

平均值

统计数字

1000次以上的期刊为1281种 1的期刊共380种441种期刊为0 000524种期刊无基金论文

0 2的期刊共70种(英文版55种)3346种期刊无海外论文

中国学术期刊 中国知网 数据库发布的科技期刊统计报告显示: 中国烟草学报 各项引证数据较2009年版有较大提高,总被引频次1947次,影响因子为1 847,学科排名第一,Web(是管理并与其他网页进行联系的网络服务平台)下载量2 57万次。

2010年度 中国知网 引证数据高于 万方数据 发布的相关数据,原因是 中国知网 的统计源中新增了博士和硕士论文对本刊的引用。

总被引频次756次/刊影响因子即年指标基金论文比海外论文比

0 4220 0610 3000 013

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/jxb1.html