FAK-ERK信号传导通路
更新时间:2024-01-14 17:19:01 阅读量: 教育文库 文档下载
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咖啡酸苯乙酯靶向调控人结肠癌HT-29细胞FAK-ERK信号通路的研究
梁路昌1 唐志晗1 李珍发2 万剑2 薛文1 王军1 涂宏2 何 葵2*
(1.南华大学 湖南 衡阳 421001;2.衡阳市中心医院 湖南 衡阳 421001)
[摘要] 目的:探讨咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester,CAPE)对结肠癌HT-29细胞FAK-ERK信号传导通路中相关蛋白表达的作用,寻找其作用靶点,试图阐明CAPE抗肿瘤作用的分子机制。方法:用不同浓度CAPE处理HT-29细胞,利用Hoechst33258染色法和流式细胞术,检测细胞凋亡的发生。应用Western-blot法分析不同浓度CAPE对HT-29细胞中FAK、ERK蛋白表达的影响。结果:Hoechst33258染色发现CAPE作用后凋亡细胞数量增加。流式细胞仪细胞凋亡率分析显示,0、2.5、5.0、7.5、10μg/ml处理HT-29 细胞24h后,细胞凋亡率上升,呈剂量依赖性。Western印迹结果显示:在(0-10)μg/ml范围内不同浓度CAPE作用于HT-29细胞24h后,FAK、ERK蛋白表达随CAPE浓度的增加而下调。结论:CAPE可诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡,其作用机制可能与CAPE抑制FAK-ERK信号转导通路的激活有关。
[关键词] 咖啡酸苯乙酯;结肠癌细胞HT-29;细胞凋亡;黏着斑激酶;细胞外信号调节激
酶;免疫蛋白印迹
Caffeic acid phenethyl ester induces growth arrest and apoptosis of HT-29 colon cancer cells by inhibition FAK /ERK signal transduction
pathway
LIANG Lu-chang1 ,TANG Zhi-han1, LI Zhen-fa2, WAN Jian2, XUE Wen1, WANG Jun1, TU Hong2, HE
Kui 2*
(1. Nan-hua University; Hengyang 421001,China;2.The Central Hospital of Hengyang,
Hengyang 421001)
[Abstract]Objective: To explore the effects of caffeic acid phenethyl ester (CAPE) on expression of the related proteins in FAK-ERK signal transduction pathway in colorectal carcinoma cell line HT-29, to find out the targets CAPE targeted and to elucidate furtherly the anti-tumor mechanism of CAPE. Methods: The cells of human colorectal carcinoma cell line HT-29 were treated with CAPE at different concentration. Flow cytometry(FCM)and Hoechst33258 staining were used to detect apoptosis. Western blotting analysis was used to
evaluate the protein level of FAK-ERK in HT-29 cell treated by CAPE. Results: Hoechst33258 staining showed that apoptosis cells increased after the treatment of CAPE; The results of FCM analysis showed that cell apoptosis rate increased after exposed to CAPE in a dose dependent manner (0, 2.5, 5.0, 7.5 and 10μg/ml ) after 24 h. Western blot analysis showed that the expression of FAK-ERK protein in HT-29 cells was down-regulated with the increase of CAPE concentrations from 0 to10 μg/ml. Conclusions: CAPE can induces the colorectal carcinoma cell line HT-29 apoptosis. The mechanism of the role of CAPE may be suppress FAK-ERK signal transduction pathway activation.
[Key words] Caffeic acid phenethyl ester; colorectal cell HT-29; Cell apoptosis; Focal adhesion kinase; Extracellular signal-regulated kinase; western-blot
[基金项目] 湖南省科技厅课题项目(S2009F1023) [作者简介] 梁路昌(1985-),男,硕士研究生,研究方向为大肠癌的预防和治疗 *通讯作者:何葵,博士,主任医师,E-mail: hekui@medmail.com.cn
CAPE是一种酚类抗氧化剂,是存在于蜂胶中的一种主要活性组份,具有广泛的生物学活性,抗炎、抗肿瘤、免疫调节以及抗氧化等作用[1]。研究发现,CAPE能诱导白血病、胆管癌、大肠癌细胞、神经胶质瘤细胞株U251、胰腺癌等多种肿瘤细胞凋亡[2-6]。我们前期研究发现CAPE能抑制HT-29细胞增殖、诱导其凋亡[7]。但是,CAPE抑制结肠癌细胞增殖、凋亡的分子机制复杂。近年研究发现,FAK-ERK信号转导通路参与了细胞增殖、分化、生存、迁移、凋亡和恶变等多种生物学反应,此通路的异常活化可能是肿瘤发生的机制之一[8-11]。CAPE是否通过调节细胞内FAK-ERK信号转导通路来诱导结肠癌的增殖、凋亡尚不清楚。因此,我们用不同浓度的CAPE处理HT-29细胞,采用Hoechst33258染色法和流式细胞术等方法检测细胞凋亡的发生,并观察HT-29细胞内的FAK和ERK的蛋白表达变化情况,试图探讨CAPE抑制HT-29细胞增殖、诱导凋亡的分子机制。 1 材料与方法 1.1 材料
1.1.1 细胞来源与细胞培养 HT-29细胞系购自中南大学湘雅医学院细胞中心,用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640 培养基,置37℃ 5%CO2培养箱中贴壁培养,隔日换液,待细胞75%融合时,按1:2或1:3传代1次,取对数生长期细胞用于实验。 1.1.2 药品与试剂 CAPE为ALEXIS公司产品;RPMI1640培养基为GIBCO公司产品;胎
牛血清为杭州四季青生物工程公司产品,细胞胰酶消化液、DMSO购自天津灏洋生物公司;Hoechst33258染色试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、Western印迹及IP细胞裂解液、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒、BeyoECL Plus (超敏ECL化学发光试剂盒)为碧云天生物技术研究所产品;PVDF膜、FAK、ERK(均为鼠抗人)为MILLIPORE公司产品;鼠抗人β-Actin一抗购自Auragene公司,HRP标记的羊抗小鼠二抗为Jackson公司产品。 1.2 方法
1.2.1 Hoechst33258染色荧光显微镜观察 Hoechst33258染色观察HT-29 细胞凋亡核形态学变化。取对数生长期HT-29细胞以1×105个/ml接种于六孔板中进行细胞爬片。培养24h后,实验组加入CAPE(10μg/ml),对照组加相同体积的培养基,继续培养24h。弃上清,PBS漂洗2次,每次3min,加入固定液0.5 ml,4℃固定10 min,弃固定液,PBS洗2次,每次3min,滴加Hoechst33258工作液0.5ml,室温染色10min,PBS洗2次,滴一滴抗荧光淬灭封片液于6孔板板中的盖玻片上,置于倒置荧光显微镜下观察并拍照。 1.2.2 细胞凋亡率分析 取对数生长期的HT-29以1×106个/瓶板接种于75ml培养瓶培养,24h后吸除原培养液,加入不同浓度的CAPE;培养液中不加药物(加相同浓度的DMSO)的为对照组,继续培养24h后分别收集细胞,1000r/min,4℃离心5min后,冷PBS重悬,离心,弃上清,再次重悬离心,加5μl Annexin-V-FITC溶液和2.5μl PI到100μl细胞悬浮液中,混匀后避光反应10min,加150μl样品稀释液到样品中,混匀后上机检测。
1.2.3 Western印迹检测各蛋白表达 将HT-29细胞经浓度分别为2.5、5.0、7.5、10μg/ml的CAPE处理后,继续培养24h后收集细胞,常规提取细胞总蛋白。取等量蛋白样品进行SDS-PAGE电泳(分离胶浓度为8%和10%,积层胶浓度为5% )。电泳后转移至PVDF膜,5%脱脂奶粉封闭4h后,加入一抗FAK(1:1000)、ERK(1:500),4℃孵育过夜,洗膜后加入HRP标记的羊抗小鼠二抗(1:2000),室温下摇床孵育2h。以ECL试剂盒显色。X光片感光,显影。ImagerJ软件分析条带灰度值。 1.3 统计学处理
本实验数据以x?s表示。采用SPSS 13.0软件进行统计分析,多组间比较采用单因素方差分析(One Way ANOVA),组间比较采用LSD检验,P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果
2.1 Hoechst33258染色荧光显微镜观察凋亡细胞
荧光显微镜下,对照组中细胞形态饱满,细胞DNA分布相对均匀,核无固缩,呈现体积较大的,均匀蓝色荧光,核形态规则,为圆形或椭圆形(图1A);10μg/ml CAPE处理细胞24 h后,细胞体积变小,凋亡细胞核浓聚呈斑块状聚集致密浓染,胞内可见致密的亮蓝色强荧光(图1B)。
2.3 CAPE对HT-29细胞凋亡的影响
对照组自然凋亡率为3.5 ± 0.4%,5.0、7.5、10μg/ml CAPE作用HT-29细胞24h后的凋亡率分别为10.4 ± 0.6%、13.8 ± 0.9%、19.8 ± 1.1%,结果相比较差异有统计学意义(P<0.05、P<0.01)。表明CAPE对HT-29细胞具有诱导凋亡作用,且随着CAPE 剂量的增加,凋亡率逐渐增加,呈剂量依赖性(如图2-1、图2-2)。
25**20凋亡率(%)15*1050对照组2.55CAPE浓度(μg/ml);24h**7.510
图2-1 CAPE对HT-29细胞凋亡的影响(24h) *P<0.05,**P<0.01,与对照组比较
A
B
C
D E
图2-2 流式细胞仪检测结果
A DMSO对照组 B CAPE 2.5μg/ml C CAPE 5.0μg/ml D CAP E 7.5μg/ml E CAPE 10.0μg/ml 2.4 CAPE对HT-29细胞FAK、ERK蛋白表达的影响
HT-29细胞经不同浓度的CAPE作用24h后,western blot分析表明:细胞FAK、ERK蛋白含量均有不同程度的下降。随着 CAPE浓度的增高,各蛋白表达量逐渐下调,差异有统计学意义(表1;图3)。
表1不同剂量 CAPE对HT-29细胞FAK、ERK蛋白含量的影响n=3,x?s
CAPE浓度
(μg/ml)
0 2.5 5.0 7.5 10.0
24h
FAK ERK1
1.833±0.089 1.372±0.071 1.729±0.066 0.907±0.021* 1.529±0.088 0.525±0.024 0.951±0.051 0.377±0.019 0.611±0.013 0.298±0.014
*#
*#
ERK2
1.745±0.132 1.092±0.028* 0.836±0.017 0.520±0.016 0.356±0.026
*#*#*#
*
*#
*#
*#
*P<0.01,与对照组比较;#P<0.01,与2.5μg/ml比较
1-5(24h): 0、2.5、5.0、7.5、10μg/ml CAPE
图3 不同浓度CAPE对HT-2细胞FAK、ERK蛋白表达的影响
3 讨论
结直肠癌是常见的消化道肿瘤,其发病率和死亡率在全球仍呈上升趋势,中晚期结直肠癌5年生存率仅在50%左右。CAPE是一种从蜂胶中提取的的天然化合物,具有抗癌谱广,针对性强,毒副作用小等特点,且其对肿瘤细胞具有选择性的抑制作用, 而对正常细胞几乎没有毒性作用。因而CAPE是一种具有广泛应用前景的抗肿瘤药物,其抗肿瘤机制已成为国内外研究的热点。
Avci CB等研究发现,CAPE可通过降低线粒体膜电位,诱导人急性T淋巴细胞白血病CCRF-CEM细胞凋亡[2]。Onori P等发现CAPE可通过抑制NF-κB的转录活性,诱导胆管癌细胞凋亡,从而抑制其生长[13]。Xiang D等用CAPE处理人结肠癌细胞株HCT116和SW480,发现CAPE可能通过下调Wnt通路中的关键信号分子β-catenin和t细胞信号因子表达,呈时间和剂量依赖性的抑制其增殖,诱导凋亡[14]。Chen MJ等用10 mg/ml CAPE处理人胰腺癌细胞BxPC-3和 PANC-1,能明显诱导其凋亡,其机制可能与线粒体功能受损,caspase-3/caspase-7活化有关[15]。我们利用Hoechst33258染色荧光显微镜观察和流式细胞术检测发现CAPE能显著抑制HT-29细胞凋亡,提示CAPE对HT-29具有明显的抑制生长和诱导凋亡作用。课题组研究发现,10μg/mlCAPE作用72h后对HT-29细胞的抑制率达60.03%,作用24h其凋亡率为19.8±1.1%,呈时间和剂量依赖性。
FAK是整合素介导的信号通路中的关键酶,发挥着信号通路开关的作用。目前FAK-ERK信号通路成为科研人员研究的热点。牛志云等研究认为,整合素α5β1介导的FAK-ras-ERK信号转导通路可能参与了K562细胞的增殖调控,阻断此通路可明显抑制
K562细胞的增殖[8]。Iekushi K等发现FAK-ERK通路激活,增加基质金属蛋白酶表达,促进了肝细胞生长因子诱导成纤维肌细胞凋亡[11]。我们实验发现CAPE可诱导HT-29凋亡,通过western blot发现随CAPE浓度的增加FAK、ERK蛋白表达逐渐下调,差异具有显著性意义。因此,我们推测CAPE可抑制FAK-ERK信号转导通路的激活,从而抑制结肠癌细胞增殖,诱导其凋亡。但是CAPE对FAK-ras-MAPK信号转导通路靶向调控及其具体机制(如是否是通过调控其相关蛋白磷酸化)还有待进一步研究。
参考文献
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