固相微萃取-HPLC联用检测孔雀石绿

材料科学与化学工程学院毕业(设计)论文

摘 要

【摘要】本实验采用聚丙烯酸酯（PA）为萃取纤维,用固相微萃取法对孔雀石绿溶液进

行了萃取。固相微萃取集进样、萃取、浓缩功能于一体，减少了溶剂使用量，操作简便，对样品有很强的富集作用,可以大大提高分析灵敏度。高效液相色谱的检测波长为595nm。实验结果表明，吸附时间为15min，解吸5min，在595m检测波长下，检测线性范围为0.1-2μg/mL，检出限为0.003μg/mL，此外，本实验还考察了pH值等条件对测定孔雀石绿的影响。采用SPME为萃取手段，是对孔雀石绿检测方法的一种创新，鲜有报道，为建立新的分析方法提供了一定的依据。

【关键词】孔雀石绿；固相微萃取；高效液相色谱

Abstract

【ABSTRACT】In this paper,malachite green solution is extracted in solid phase

micro-extraction method with polyacrylate (PA)which is extraction fiber.SPME brings sample collection, extraction, concentration functions into one procss, reducing solvent consumption and is easy operation.It has a very strong enrichment for samples and significantly improve the analytical sensitivity. HPLC detection wavelength is 595nm. The experimental results show that, extracted for 15min, desorpted for 5min, detected with 595nm wavelength, the linear range is from 0.1 to 2μg/mL, the detection limit is 0.003μg / ml. In addition, this study also examines impact on the determination of malachite green in experimental conditions such as PH value .Adoption of SPME for the extraction is an innovative detection of malachite green, which is rarely reported and provides a certain basis for the establishment of the new method.

【KEYWORDS】Malachite Green；SPME；HPLC

I

材料科学与化学工程学院毕业(设计)论文

目 录

摘 要 ............................................................................................................................................... I Abstract ............................................................................................................................................. I 目 录 .................................................................................................................................... II 1. 前 言 ........................................................................................................................................ 0 2．实 验 部 分 .............................................................................................................................. 3 3. 结果与讨论 ................................................................................................................................. 5 4．结论 ............................................................................................................................................ 9 参考文献 .......................................................................................................................................... 9 致 谢 .............................................................................................................. 错误！未定义书签。

II

1. 前 言

孔雀石绿[C23H26N2]是一种带有金属光泽的绿色结晶体，属三苯甲烷类染料，又名严基块绿、孔雀绿、碱性绿，极易溶于水和乙醇[1]，以往仅在制陶业、纺织业、皮革业、食品着色剂、细胞化学染色剂和指示剂等方面有所使用。自1933年起孔雀石绿开始作为驱虫剂、杀菌剂、防腐剂在水产养殖中出现，许多国家曾经采用孔雀石绿杀灭鱼类体内外寄生虫和鱼卵中的霉菌，对鱼类水霉病、原虫病等的控制[2]非常有效，而且操作方便，价格低廉。但研究发现：孔雀石绿是一种高毒素物质，其化学官能团三苯甲烷是一种致癌物质，并有高残留的作用，能在鱼体内长时间残留，通过食物链对哺乳动物和人类产生致畸、致癌、致突变[3-6]等作用，同时含孔雀石绿的养殖废水排放会污染水环境，其在鱼体内可迅速代谢为毒性更强的隐色孔雀石绿[7],孔雀石绿和隐色孔雀石绿的分子结构如图1。为了有效地监控禁用药物孔雀石绿的使用，某些国家还规定了严格的检出限[8]。为预防孔雀石绿造成的严重影响，采用何种方法能够快速、简便、准确地检测水产品中的孔雀石绿含量已经迫在眉睫，更是当前学术界研究讨论的热点问题[9]。

图1. 孔雀石绿（MG）和隐色孔雀石绿（LMG）的分子结构

目前孔雀石绿、结晶紫及其代谢物的检测方法有高效液相色谱法[10-15]、高效液相色谱一串联质谱法 [16-21]、共振瑞利散射法[22]。我国于2006年发布有关的水产行业标准（SN/T1768-2006）[23]及国家标准（GB/T20361-2006）[24]。

其中，付钰洁等[25]采用显微结晶方法，直接观察孔雀石绿及孔雀石绿分别与Zn2 +、C2O42 - 混合形成的特殊晶形,实现了简便、快速、直观的孔雀石绿定性检

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测。结合紫外分光光度法，对孔雀石绿溶液及孔雀石绿与Zn2 +、C2O42 -混合后的溶液作光谱扫描，通过对比孔雀石绿、Zn2 +、C2O42 - 和孔雀石绿与Zn2 +、C2O42-混合物的光谱扫描图,分析孔雀石绿与Zn2 +、C2O42-生成的新物质,验证了孔雀石绿的存在，此法可对孔雀石绿作定性定量的研究。张海琪等[26]建立了液相色谱—串联质谱测定水产品中孔雀石绿及其代谢物残留的检测方法，能同时分离鉴定水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿残留，且重复性和准确性好，检出限为0.10μg/kg，该法满足欧盟对水产品中孔雀石绿残留不得检出的要求。高效液相色谱法是当前测定孔雀石绿的公认方法，具有准确、灵敏等特点。本方法较目前现有的测定方法作了部分改进, 实现了无溶剂化，克服了传统的液-液萃取法需使用大量溶剂和样品、处理时间长、操作步骤多的缺点。吴仕辉等[27]将样品中的孔雀石绿、结晶紫经试剂盒提取，浓缩后用经固相萃取柱净化、硼氢化钾还原、反向色谱柱分离，使用高效液相色谱－荧光检测器检测，成功地进行了水产品中孔雀石绿、结晶紫残留量的检测孔雀石绿、结晶紫的加标回收率在76.1%～92.5%之间，相对标准偏差1.9%～5.8%，检出限均为0.5μg/kg。结果表明：该方法检测孔雀石绿（MG）、结晶紫（GV）处理简单，灵敏度高，节省时间，可用于大量样品的快速分析。该方法主要综合了各个方法标准中快速和灵敏这两个优点，相对于SN/T1768- 2006及文献[13，14]来说，检测限从2.0μg/kg提高到了0.5μg/kg，灵敏度与国标[24]及液质联用方法[17]相当（均为0.5μg/kg），是水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿残留总量、结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留总量快速而准确的检测方法。

目前，应用SPME—HPLC联用测定孔雀石绿无文献报道，但关于其他物质的报道较多，如冯峰等[28]测定了除草剂苯噻草胺，胡彦学等[29]测定了番茄中氨基甲酸酯类农药残留，高常安等[30]测定了水中二苯并噻吩，杜新贞等[31]测定了水样中邻苯二羧酸脂化合物。

本文采用聚丙烯酸酯（PA）为萃取纤维，用固相微萃取法对孔雀石绿溶液进行了萃取。固相微萃取集进样、萃取、浓缩功能于一体，减少了溶剂使用量，操作简便，对样品有很强的富集作用，可以大大提高分析灵敏度。实验结果表明，在15min萃取时间下，解析5min,在595nm检测波长下，检测线性范围为0.1-2μg/mL，检出限为0.003μg/mL。采用SPME为萃取手段，是对孔雀石绿检测

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方法的一种创新，鲜有报道，为建立新的分析方法提供了一定的依据。

此外,本文中创新是将固相微萃取-高效液相色谱联用以及洗脱方法的选取。而通常固相微萃取与气相色谱的联用最普遍[40-41]。固相微萃取的装置类似于一个微型注射器，主要由手柄和萃取纤维头两部分构成，纤维头是一根1cm长、涂有不同高分子聚合物功能层的熔融石英纤维，装在类似于微量注射器的针管内，针管可以保护纤维头不易折断。平时萃取头收在针管内，萃取时针头穿过样品瓶中，压下管芯，使纤维头从针管中伸出，直接浸入溶液中(直接浸入方式)或置于易挥发样品的上部空间(顶空方式)，使萃取纤维暴露在样品中进行萃取，萃取吸附时间平均大约20～30min，达到吸附平衡（常辅以磁力搅拌、超声波或微波等措施），再将萃取头收回到针管内，针管从样品瓶中退出。固相微萃取的选择性主要取决于高分子功能层材料的性能，不同的涂层对分析物的亲合力不同，按照―相似相溶‖的原则，分析物容易被极性相似的固相萃取剂所萃取来选择合适的固相微萃取涂层。固相微萃取集进样、萃取、浓缩功能于一体，对样品有很强的富集作用，可以大大提高分析灵敏度。主要优点在于不用或少用溶剂，操作简便，携带方便。

固相微萃取-高效液相色谱联用技术，除用于环境样品分析，应用范围已逐步发展到食品、医药卫生、生物化学、临床化学、生理及毒理学、法医学等领域，在国内也受到越来越多人士的重视，应用范围越来越广。

固相微萃取-高效液相色谱联用目前主要有两种设计，一种是由Chen等人[32]提出的、采用传统的外表涂有涂层的纤维头，其固相微萃取-高效液相色谱联用界面包括一个六通进样阀和一个解吸池，样品萃取后，SPME纤维头浸入解吸池中用适当溶剂解吸，之后将阀切换至进样位置，用HPLC分析检测。另一种设计是由Eisert等人[33]提出的―in—tube-SPME‖ 这种设汁是将涂层涂在石英管的内表面，因此可采取气相色谱毛细管柱涂层的方法，并将气相色谱毛细管萃取柱放于HPLC自动进样阀和取样针之间用注射器吸入样品，当样品待测组分分配到毛细管内壁固定相上时，将阀切换至取样位置，以适当溶剂解吸后将解吸溶液转移到样品管中，再切换至进样位置，样品管内溶液随流动相进人高效液相色谱柱。这种设计的优点是涂层方便易得，种类多样；易于实现自动化，节省分析时间；比手动分析有更好的精密度。但是，这两种方式都需要一种特殊的解吸池或是固相微萃取-高效液相色谱联用接口，这就提高了对实验仪器的要求。

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图5. 不同pH条件下的峰高 3.2 流动相组成的选择

相关文献[27]中有报道，分别采用（1）乙腈+乙酸钠缓冲液（pH=4.5）=80+20；（2）乙腈+乙酸铵缓冲液（pH=4.5）=80+20为流动相进行检测，实验结果表明，用流动相（1）进行检测时基线噪音大，对检测结果有干扰，而用流动相（2）进行检测时基线噪音小，对检测基本无干扰。文献[38]中有报道，选择乙腈0.125 mol /L(pH=4.5)乙酸胺溶液作为流动相，实验结果表明，当乙腈含量超过80%时，峰形出现拖尾现象，当乙腈含量低于60%以下时，出峰保留时间太长[39]。因此选择乙腈+乙酸铵缓冲液（pH=4.5）=80+20为流动相进行检测，在此分离条件下，孔雀石绿峰形对称，柱效高。 3.3 线性范围、检出限

将10μg/mL的MG溶液稀释至0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL，在优化的实验条件下，即萃取时间15min,解吸时间5min,在595nm处检测，用峰面积对浓度绘制标准曲线，得出本实验的定量线性范围和检出限、灵敏度。

表3 不同浓度溶液出峰的峰高 浓度/μg/mL 峰高 0.1 323 0.5 961.7 1 1656.1 2 2616.7

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以HPLC测得的峰高y为纵坐标，相应的浓度x为横坐标绘制标准曲线，其线性关系为：y=319.66708+1188.56436x,该方法在孔雀石绿浓度范围在0.1一2.0μg /mL时，R=0.99239，根据3倍信噪比计算，最低检测限为0.003μg/mL。

4．结论

根据色谱分析结果，选择极性较强的PA作为萃取头。在15min萃取时间下，解吸5min,在595nm检测波长下，检测线性范围为0.1-2μg/mL，检出限为0.003μg/mL。

参考文献

[1] 翟毓秀，张翠，宁劲松，等．水产品中孔雀石绿残留及其研究概况[J]．海洋水产研究，2007，28(1)：101-108．

[2] CULP S J，BELAND F A．Malachite green：a toxicological review[J]．Am Coll Toxicol，1996，15：219-238．

[3] 卢迈新．美洲鳗对几种药物的敏感性研究[J]．淡水渔业，2000，30(5)：28-29． [4] Stammati Annalaura，Nebbia Carlo，Angelis Isabella De，et a1．Effects of malachite green(MG)and its major metabolite，leucomalachite green(LMG)，in two human cell lines[J]．Toxicological in Vitro，2005，19(7)：853-858．

[5] Srivastava Shivaji，Sinha Ranjana，Roy D．Toxicological effects of malachite green[J]．Aquatic Toxicology，2004，66(3)：319-329．

[6] Mittelstaedt R A，MeiNan，Webb Peggy J，et a1．Geno toxicity of malachite green

第10页

and leucomalachite green in female Big Blue mice[J]．Mutation Rese/Genetic Toxicology Environment Mutagenesis，2004，561(1—2)：127—138．

[7] Doerge D R．Mechanism for inhibition of thyroid peroxi2dase by leucomalaehite green[J]．ChemlResl Toxicol，1998，11：1098—1104．

[8] 桂英爱，王洪军，刘春林，刘中，丁勇．孔雀石绿及其代谢产物在水产动物体内的残留、危害及检测研究进展田．大连水产学院学报，2007，22(4)． [9] 林谦，林炜，叶瑞洪.紫外可见分光光度法测定水产品中孔雀石绿含量. 福建师范大学福清分校学报，2009,94(5):60-64．

[10] 李连庆，张素青，李春青．高效液相色谱(High-performance liquid chromaography)测定水产品中孔雀石绿及其代谢物的残留量的检测方法[J]．现代渔业信息，2007，22(4)：24—25、30．

[11] 叶四化，陆超华，谢海平，李娜．高效液相色谱双波长法同时测定水产品中孔雀石绿和隐性孔雀石绿[J]．分析科学学报，2007，23(1)：69-72． [12] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局、中国国家标准化管理委员会发布．水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定一高效液相色谱荧光检测[S]．中国标准出版社，2006．

[13] 任秀莲，魏琦峰，曲径，等．反相高效液相色谱法测定水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物[J]．中国卫生检验杂志, 2006,l6(8):939-940.

[14] 林洪，付晓婷，邱绪建, 等．液相色谱法测定鱼肌肉中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物[J]．中国海洋大学学报, 2006, 36(6):909-912.

[15] Kamila Mitrowska, Andrzej Posyniak，Jan Zmudzki．Determination of malachite green and leucomalachite green in carp muscle by liquid chromatography with visible and fluorescence detection[J]. Journal of Chromatography A, 2005, 1089(1-2):187- 192.

[16] Wu Xueli,Zhang Gong,Wu Yongning,et al.Simultaneous determination of malachite green, gentian violet and their leuco-metabolites in aquatic products by high-performance liquid chromatography–linear ion trap mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2007, 1172(2):121-126.

[17] 朱宽正, 王鹏, 林雁飞，等．液相色谱一串联质谱法同时测定水产品中孔雀

第11页

石绿、结晶紫以及它们的隐色代谢物残留[J]. 色谱, 2007,25(1):66-69． [18] 丁涛，徐锦忠，吴斌，陈惠兰，沈崇钰，刘飞．高效液相色谱一串联质谱（Finnigan TSQ Quantum)测定鳗鱼中孔雀石绿、隐性孔雀石绿残留量[J]．现代科学仪器，2006，27-29．

[19] 刘海新，张农，钱卓真．水产品中孔雀石绿检测方法研究进展[J]．福建水产，2007(1)：41--45．

[20] 吴学立，吴永宁，赵云峰，袁宗辉．液相色谱一线性离子阱质谱法检测草鱼中孔雀石绿结晶紫及其代谢产物[J]．中国食品卫生杂志，2007，19(3)：209-214． [21] 刘桂华，姜杰，谢建滨，张红宇，刘红河，仲岳桐，张慧敏．同位素内标稀释高效液相色谱一质谱法测定鱼体中的孔雀石绿及其代谢物[J]．现代预防医学，2006，33(1)：124—126．

[22] 范翔，吕昌银，刘运美，何爱桃，贺元文，宁玲．共振瑞利散射法测定孔雀石绿[J]．分析化学(FENXI HUAXUE)研究简报，2007，35(8)：1207—1210． [23] 贾东芬，张顺合，张维，等. SN/T1768-2006, 水产品中孔雀石绿和结晶紫及其代谢产物的快速测定方法[S]. 北京：中国标准出版社，2006．

[24] 郑斌，赵红萍，冷凯良，等. GB/T20361-2006, 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法[S]. 北京：中国标准出版社，2006. [25] 付钰洁 ,兰玉坤 ,皮晓娟 ,刘恒成 ,王磊. 孔雀石绿检测方法.重庆工学院学 报(自然科学)，Vol.23.No.6，Jun.2009.

[26] 张海琪，何中央，郑重莺，叶累海，施礼科.液相色谱一串联质谱法测定水产品中孔雀石绿的残留量.南方水产，Vol.3.No.6，Dec.2007.

[27] 吴仕辉，朱新平，郑光明，陈昆慈，戴晓欣，潘德博. 高效液相色谱法检测水产品中的孔雀石绿和结晶紫,广东海洋大学学报，Vol.29 No.1,2009． [28] 冯峰，高松亭，韩朔睽. 农业环境科学学报,2003,22(2):242－243．

[29] 胡彦学，杨秀敏，张美月，李卫宁，王春，王志.中国食品学报, Vol.8.No.6，Dec.2009.

[30] 高常安，张爱茜，冯峰，韩朔睽，王连生.环境科学与技术, Vol.32 No.42，Feb.2009.

[31] 杜新贞,曹旭,王雪梅,詹燕燕,陈慧.介孔涂层固相微萃取2高效液相色谱法测

第12页

定水样中邻苯二羧酸酯化合物，分析试验室,Vol.28 No.8,2009． [32] Chen J，Pawtisayn J．Anal Chem，1995，67(15)：2 530. [33] Eisert R，Pawtisayn J And Chem ，1997，69(16)：314.

[34] 中华人民共和国农业行业标准．SC／T 3021--2004水产品中孔雀石绿残留量的测定—液相色谱法[s]．北京：中国标准出版社，2004．

[35] 中华人民共和国国家标准．GB／T 19857--2004水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定[S]．北京：中国标准出版社，2004．

[36] Cha Chang—Jun，Daniel R，Doerge，et a1．Biotransformation of Malachite Green by the Fungus Cunninghamella Eiegans[J]．Applied and Environmental Microbiology，2001，67(9)：4358-4360．

[37] 李立杰，张志昕，袁彦华. FI一2200Ⅱ高效液相色谱仪测定水产品中孔雀石绿, 北华大学学报(自然科学版)，Vol.10 No.4,2009．

[38] 张卫佳，蒋其斌，夏天兰.高效液相色谱法测定水产品中孔雀石绿,黑龙江水产, 2007，6:7-8．

[39] 郭德华，叶长淋.液相色谱法测定鳗鱼中的孔雀石绿(J).化学分析计量，202(2).

[40] T Barboni,F Lurob,N Chiaramonti,J-Me Desjobert,A Muselli,J Costa, Volatile characteristics of 50 peaches and nectarines evaluated by HP–SPME with GC–MS. Food Chemistry, 116 (2009) 356–364

[41] Y Wang, Ch Yang, Sh Li, L Yang, Y Wang, J Zhao, Q Jiang,Volatile composition of hybrids Citrus juices by headspace solid-phase micro extraction/gas chromatography/mass spectrometry, Food Chemistry 116 (2009) 382–390

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