蒸发光散射检测器在中药成分分析中的应用4

很有用

第28卷第10期

2003年10月

October,

2003ChinaJournalofChineseMateriaMedica

　中国中药杂志

Vol.28,Issue　10

[Abstract]　Higenamine(HG)isapotentcardioactivebenzylisoquinolinealkaloidisolatedfromAconitituberwhichhaslongbeenusedasacardiotonicintraditionalChinesemedicine.HGexertsvariouseffectsonthecardio2circulatorysysteminotropicandchronotropicinisolatedratatria.Italsorelaxesisolatedrataorta.Itinhibitsepinephrine,ADPorcollagen2inducedplateletaggrega2tioninplateletrichplasma.　HGinhibitsLPS2inducednitrateaccumulationandtheexpressionofiNOSmRNAin　RAW264.7cells.HGlowersbloodpressureinratsandincreasestherecoveryratesinacutethrombosismodelofmice,andlowertheweightofthrombusformedinthearterio2venousshuntmodelofrats.HigenaminealsohasameliorativeeffectsintheLPS2inducedDICmodel.

[Keywords]　Aconitumspp.;higenamine;cardio2circulatorysystem

[责任编辑　方文贤]

蒸发光散射检测器在中药成分分析中的应用

赵宇新,李曼玲

(中国中医研究院中药研究所,北京　100700)

[摘要]　目的:总结蒸发光散射检测器在中药成分分析中的优势和应用情况。方法:收集有关高效液相色谱2

蒸发光散射检测器法测定中药成分的文章,并进行综述。结果:端有吸收的成分上有较大的优势和广泛的应用。结论:。

[关键词]　蒸发光散射检测法;高效液相色谱法2;[中图分类号]R284.1　[A　[])205

light,

ELSD)。它可以在很大程

型的通用型检测器,它具有许多优点:首先,ESLD检测不依赖于样品的光学性质,只要挥发性小于流动相的物质,都可以在ELSD上产生响应。其次,ELSD可以很好的支持梯度洗脱,蒸发光散射检测可以消除流动相配比变化对基线产生的影响。另外,与示差检测器及紫外低波长检测相比,ELSD具有较好的灵敏度。

但是,相对于UV检测器,ELSD检测也有一定的特殊性。ELSD检测要求流动相及流动相中加入的修饰剂必须有良好的挥发性,这样就使非挥发性的缓冲盐的应用受到了限制。另外,与UV检测器相比,ELSD检测的灵敏度不是足够的理想[325]。

3

度上克服HPLC2UV检测方法的不足,还可以用作超临界流体色谱和逆流色谱的检测器。并已经被广泛应用于医药、化工、食品等行业。本文主要简介蒸发光散射检测器的原理和特点并对其在中药成分分析中的应用进行综述。

1

　ELSD的工作原理

ELSD利用流动相与被检测物质之间蒸气压的相对差

异,在流动相挥发除去的基础上,不挥发性的组分粒子可以使从激光光源中发出的光受到散射,受到散射之后的光信号被硅光二极管记录并通过信号输出。

蒸发光散射检测器运行分为3个过程:雾化过程,即用惰性气体或纯净空气将色谱柱的流出物雾化。蒸发过程,在加热的漂移管中将色谱柱流出物中的流动相挥发,只剩下挥发性较小的被检物质的粒子。检测过程,测定不挥发性粒子对光的散射,记录其光散射信号[1,2]。

2

　ELSD在中药分析中的应用

中药的化学成分复杂,有一部分成分不存在紫外吸收或

仅在紫外末端有吸收。加上色谱分离的困难以及流动相带来的干扰,使用传统的紫外检测器对其进行定性定量分析十分困难。ELSD在某种程度上弥补了这方面的不足,被广泛的应用于皂苷类成分、糖类成分、内酯类成分、部分生物碱类成分以及其他一些成分的分析,取得了满意的结果。

3.1

　ELSD的优点及特殊性

ELSD可作为高效液相色谱(HPLC)、高速逆流色谱

(HSCCC)、超临界流体色谱(SFC)等色谱的检测器。作为新

[收稿日期]　2003205209

[通讯作者]　赵宇新　Tel:(010)6401441122939　E2mail:zyxmymail@http://www.77cn.com.cn

皂苷类成分的分析　

皂苷类成分大多没有紫外吸收,或仅在紫外末端有吸

收,容易受到试剂的干扰,使用紫外检测法存在一定的不足。就目前情况看,ELSD应用于皂苷类成分的分析的例子比较多。具体如表1。

913

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表1　ELSD在皂苷类成分分析中的应用

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Vol.28,Issue　10

被分析样品西洋参

　西洋参　人参　红参　三七　

湖北麦冬　麦冬　

知母及其制剂　酸枣仁　

黄芪及其注射液　

黄芪提取物　升麻　

总状升麻　

被分析成分

24(R)2pseudoginsenosideF11ginsenosides

Rg1,Re,Rd,Rb2,Rb1ginsenosidesF4,

Rg3,Rg5,Rg6,Rk1,Rk3,Rs3,Rs4,Rs5ginsenosideRg1,Re

色谱条件

WatersSpherisorbODS22,C18柱

ELSD参数　文献

[6]

乙腈2水梯度洗脱

LiChrosorbNH2柱乙腈2水2异丙醇梯度洗脱ODS柱

乙腈2水2甲酸梯度洗脱Nova2pakC18柱乙腈2水(18∶82)

Shim2packCLC2ODS柱乙腈2水(30∶70)

AlltechVerspapackC18柱

乙晴2四氢呋喃2水(45.6∶2.9∶51.5)AlltechVersapaprkC18柱甲醇2水(88∶12)

MightysilRP218GP柱甲醇

LUNAC18柱甲醇

AllspereODS22柱

漂移管温度35氮气压力0.34漂移管温度95载气压力0.20漂移管温度40氮气压力0.18漂移管温度40

℃

MPa

[7]

℃

MPa

[8]

℃

MPa

[9]

℃

三七皂苷R1

山麦冬皂苷B　

鲁斯可皂苷元薯蓣皂苷元薯蓣皂苷元　

菝葜皂苷元　

酸枣仁皂苷A,B　

黄芪皂苷Ⅳ,Ⅲ,Ⅰ　

黄芪甲苷,

氮气流速2.75L min21漂移管温度90℃载气压力0.20MPa漂移管温度93.18℃氮气流速2.47漂移管温度40氮气压力0.20漂移管温度90

L min

-1

[10]

[11]

[12]

℃

MPa

[13]

-1

℃

升麻苷等16种成分

甲醇2水2(70∶301)Shim2packODS)柱(∶ODS柱

甲醇2水梯度洗脱

YMCODS2AQTMRP色谱柱乙腈2水梯度洗脱

氮气流速3.0L min雾化温度80℃气体流速比1.5℃MPa0.15MPa漂移管温度105℃

[14]

[15]

[16]

[17]

-1

氮气流速2.84L min漂移管温度119℃氮气流速2.30L min漂移管温度43℃氮气流速0.34MPa

[18]

-1

[19]

3.2

　糖类成分的分析

糖类成分多不存在紫外吸收,以前主要采用分光光度法

AlltechSilica柱,分别以环己烷2醋酸乙酯2二乙胺(6∶4∶1)和

环己烷2醋酸乙酯2二乙胺(6∶4∶0.12)为流动相,对不同来源的样品进行含量测定。ESD参数为:漂移管温度90

℃,氮

气流速1.87L min-1。李松林[25]对伊犁贝母中的西贝素和西贝素苷进行了定量分析,使用KromasilC18柱,流动相为乙腈2水2三乙胺(71∶29∶0.03),以ELSD为检测器,得到了较好的分离和峰形。Song[26]等人利用HPLC2ELSD方法,以含

0.006%三乙胺的乙腈2甲醇2水(66.5∶3.5∶30)为流动相在

对这类成分进行定量分析,但只能测定总糖含量,灵敏度和准确度较差。近来有许多采用HPLC2ELSD方法对糖类成分进行分析的报道,取得了比较满意的结果。梅兴国等[20]使用SugerPAKI型糖柱,以水作为流动相,采用HPLC2

ELSD方法对红豆杉细胞悬浮培养液中的蔗糖、果糖、葡萄糖

进行检测,3种糖的回收率分别为95.8%,94.4%和94.2%。张　等人[21]使用Licrospher100NH2柱,以乙腈2水作为流动相梯度洗脱,采用HPLC2ELSD方法对云芝糖肽中的葡萄糖、甘露糖、半乳糖和木糖进行了分析,分析结果显示,4种糖的摩尔比为1∶0.074∶0.067∶0.0178。魏泱等人[22]利用高效液相色谱法2蒸发光散射检测器测定了海藻糖的纯度,色谱条件是ZorbaxSB2C18柱,甲醇2水(4∶1)为流动相。周坚等人[23]使用ZorbaxRX2SLL动态修饰硅胶柱,以水2乙腈2二乙胺为流动相,采用HPLC2ELSD方法对转基因烟草中的海藻糖进行了测定,取得了较好的分离度。

3.3

反相C8柱上,实现了贝母类药材中6种异甾族生物碱的分离和测定,得到了良好的重现性和准确度。

3.4

内酯类成分分析　

有的内酯类化合物不能在UV检测器上产生响应,使用

ELSD作为检测手段可以取得较好的效果。颜玉贞[27]等人

分别使用C18色谱柱,以甲醇2水作为流动相,梯度洗脱,对银杏叶中的银杏内酯A,B,C以及白果内酯进行了定量分析。

WenkuiLi[28]取在甲醇2水系统流动相中加入少量的三氟醋

酸,梯度洗脱,也对市售银杏制剂中所含的上述4种成分进行测定。对于穿心莲制剂中的穿心莲内酯,WenkuiLi[29]也采用ELSD作为检测手段,进行定量分析。

除此之外,ELSD也被应用于对于未衍生化氨基酸[30]、

生物碱类成分的分析　

朱丹妮[24]等人采用HPLC2ELSD方法对贝母类药材中

的贝母甲素、贝母乙素和西贝素的含量进行了测定。使用

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胆酸类成分[31]、甾醇类成分[32]等其他成分的分析测定中。

些特定的优势。ELSD可以对几乎所有的物质产生响应,可以用做标准物质纯度的检查。可以全面的反映样品的内在特征,用于中药样品的定性鉴别[36]。所以,ELSD在中药成分分析中具有自己特定的优势,会有比较广泛的应用前景。当前存在的问题　

4.2.1　对ELSD检测性能的研究不够全面　ELSD在中药

4.2

　ELSD的应用前景及当前存在的问题

4.1　ELSD在中药成分分析中的应用前景展望4.1.1　应用于建立和提高中药质量标准　目前,有相当大

4

的一部分中药,其中所含的主要成分、活性成分或者质量控制的目标成分均没有紫外吸收或仅在紫外末端有吸收,给质量控制工作带来了一定的难度。所以至今为止,尚有许多中药虽然有标准品,却未建立质量控制方法。比如中药板蓝根、知母、伊贝母等,均有标准品用于定性鉴别,但没有理想的方法进行质量控制。采用HPLC2ELSD方法,针对于那些没有紫外吸收或末端吸收的目标成分,可以对中成药、中药饮片及配方颗粒建立科学准确的质量控制方法。目前《中,国药典》2000年版收载的许多中药多采用薄层扫描法进行质量控制,如黄芪、女贞子、湖北贝母等,如果采用HPLC2ELSD方法,将会克服薄层扫描法准确度不高等缺点,提高质量标准水平。

4.1.2

成分分析中已经发挥了比较重要的作用。但是,目前也存在一些应用上的问题。由于ELSD特有的工作原理,对其检测性能的深入研究将会在很大程度上指导在实际中的应用。国内外已有一些关于ELSD检测性能方面的研究报道。主要是关于影响ELSD检测各种参数的选择,以及流动相中修饰剂的加对物质响应值的改变。但是,还没有系统的研究,也没有得到比较规律性的结论。冯埃生[37]等人对仪器参数对ELSD检测性能的影响作了研究,结果发现漂移管温度对基线的影响没有明显的规律;气体流速的增大会相应的使响应值减小;流动相中缓冲盐的加入会使基线的水平较高,并发生漂移。关于流动相中加入不同的挥发性的酸碱修饰剂例如甲酸、三乙胺、三氟醋酸[38241][42]等对ELSD检,,ELSD,导致响应。但是具体的机理和修饰,比如如何增加检测能力而不影响到噪音,如何克服基线漂移等问题,还需要进一步的研究。

4.2.2

　应用于中药指纹图谱研究　中药指纹图谱的研究,

目前应用比较多的是HPLC2UV/DAD系统。可以比较全面的反映中药所含内在化学成分的种类和数量,但是,中药是一个复杂作用体系,是各种不同成分综合作用于人体的结果,使用HPLC2UV/DAD系统,测器,,,可以全,真实反映中药内在的化学成分,更符合于中药指纹图谱的要求。

4.1.3

　ELSD结果的重现有待于进一步提高　HPLC2ELSD

的准确性虽然优于示差折光检测器和传统的分光光度法,但是与UV检测相比较,结果的准确度和重现性有待于进一步的提高。主要的原因可能是出在气源的纯度、气体流速控制的精度、流动相配比的准确性以及仪器参数等设置其它问题上。实际操作中,如果使用高纯氮气代替压缩空气,采用更精确的装置控制气体的流速,可能会使实验结果更加令人满意。采用随行标准曲线法进行含量测定,也会减少每天实验条件差别带来的系统误差,使实验结果更准确。

4.2.3

　应用于多谱联用技术　ELSD具有检测的通用型,

可以和质谱、波谱或其它色谱进行联用,可以起到互为补充的作用。在HPLC2MS2ELSD系统中,ELSD作为补充,可以保证在每一个样品的HPLC2MS2ELSD分析中,可以得到包括保留时间,离子峰等更充分、更准确的信息,有助于已知化合物的定性鉴别[33]。ELSD可以作为流速暂停液相色谱2核磁分析系统(LC2NMR)在线检测器,在NMR记录化合物波谱数据的同时,记录下化合物保留时间、纯度状况等色谱数据[34]。此外,ELSD可以方便的和UV/DAD串联,同时记录数据信号,可以保证在每一次的分析中的得到的信息更全面更准确。所以,在联用技术的发展中,ELSD可能会起到重要的作用。

4.1.4

　并不是全部的化合物都可以用ELSD检测　ELSD

虽然是通用型质量检测器,但是对于一些挥发性比较强的成分,可能在较高的温度下会随着流动相挥发成气体状态,不适于用ELSD检测。虽然现在有带有分流阀的仪器,会使漂移管温度降到很低,在一定程度上解决了这个问题。但随之而来的问题就是,色谱柱流出液经过分流之后再进入ELSD检测,如何保证测定结果的准确性和重现性。如果采用加入内标物的方法,如何选择合适的内标物也是应该解决的问题。

另外,ELSD作为一种通用型质量检测器,同时也是一种破坏性检测器,样品无法回收。对于比较珍贵的样品无法回收再利用。不能配备制备型HPLC进行样品的纯化制备。

到目前为止,应用HPLC2ELSD方法已经对多种常用中

　应用于高通量筛选和组合化学　随着科学仪器设备

[35]

的更新和科学研究工作的不断深入,高通量的科学研究方法已经越来越成为一种发展的趋势

。ELSD在这方面已经

发挥了一定的作用,用于分析未衍生氨基酸[30]、植物甾醇[32]及系列天然产物化合物库[33]。作为一种通用型检测器,

ELSD在高通量药物筛选和组合化学研究领域中将发挥重要

的作用。

另外,由于ELSD自身特有的性质,在其他方面也有一

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(10):889.

　中国中药杂志

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药中进行了分析,有效的建立或提高了质量控制方法。在《中国药典》2000年版2002年增补本中,已经收载了HPLC2

ELSD方法作为质量控制的方法之一[43]。HPLC2ELSD方法

[15]　李会军,李　萍.高效液相色谱法蒸发光散射检测器测定酸枣

仁中酸枣仁皂苷A及B的含量.药物分析杂志,2000,20(2):

82.

[16]　汪　红,王　强.HPLC2ELSD法测定黄芪及其注射液中黄芪

已经成为一种有效的质量控制方法。虽然ELSD还有一些不足的地方,不可能完全的替代UV检测器,但是对于一些弱紫外吸收或无紫外吸收成分的分析,ELSD的确发挥了的重要作用。另外,在定性鉴别的研究中,ELSD也可以比较全面的反映样品的信息。所以随着ELSD检测技术和仪器本身的不断完善,相信会在中药成分分析中起到越来越重要的作用。

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2003年10月

October,

2003ChinaJournalofChineseMateriaMedica

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ZHAOYu2xin,LIMan2ling(InstituteofChineseMaterialMedica,(ChinaAcademeofTraditionalChineseMedicine,Beijing　100700,China)

[Abstract]　Objective:ToreviewtheapplicationofEvaporativeLight2ScatteringDetectorinanalysisoftheactiveconstituentsinChineseherbalmedicine.Method:PapersontheassayoftheactivecompoundsofChineseherbalmedicinebyHPLC2ELSDmethodwerecollected.Result:EvaporativeLight2ScatteringDetectorhasbeenwidelyusedinassayingthecompoundswhichhavenoUVab2sorptionorwhenwavelengthsformaximalUVabsorptionareunder200nminnaturalproducts.Conclusion:EvaporativeLight2Scat2teringDetectorwillhaveamorewidelyapplicationinanalysisofconstituentsinChineseherbalmedicine.

[Keywords]　evaporativelight2scatteringdetection;HPLC2ELSD;Chineseherbalmedicine

[责任编辑　李　禾]

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