酵母双杂总结

酵母双杂原理：酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型

的真核生长转录因子， 如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游， 转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开， 仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。

酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时， 测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达， 其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)， 而GAL4-ad没有。因此， 在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。目前研究中常用binding-domain基因有： GAL4(1-147); LexA (E coli转录抑制因子)的DNA-bd编码序列。常用的activating-domain基因有： GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。

双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞， 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉 易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物(mammal;mammalian)的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd， LexA-bd)； 另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad， VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中， 蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)， 从而可分析蛋白间的结合作用。

酵母双杂交文库构建基本实验流程

一 第一链cDNA合成

1. 准备高质量的Poly A 或总RNA 2. 在微量离心管中混匀以下试剂

RNA 样本 (0.025–1.0 μg poly A+或0.10–2.0 μg 总RNA) 1.0 μl CDS III 去离子水

注: 对照实验时，请使用1μg的对照RNA。 CDSIII = Oligo-dT； CDSIII/6 =随机引物 3. 72°C ，孵育2 min。

4. 冰上冷却2 min，然后14000rpm，10s，瞬时离心。

5. 混合以下试剂，将混合液加入Step4中的经过变性且结合有引物的RNA样本中，轻拍混匀。 5X First-Strand 缓冲液 DTT (100 mM)

2.0 μl 1.0 μl 1.0 μl 1.0 μl

1–2 μl 1–2 μl

补齐体系到4.0 μl

dNTP 混合物(10 mM ) SMART MMLV 反转录酶

6. 42°C，孵育10 min。

7. 加入 1 μl SMART III-modified oligo，混匀，42°C，孵育1 h。 8. 75°C ，10 min终止第一链合成反应。 9. 室温冷却，加入1 μl RNA酶H (2U)。

10. 37°C，孵育20 min。 11. 继续进行 LD-PCR 扩增。

二 第二链cDNA合成（LD-PCR）

1. 建立两管100ul的扩增体系，一个是实验组，另一个是对照组，往实验组离心管中加入以下试剂并混合： 第一链cDNA 蒸馏水

10X Advantage. 2 PCR缓冲液 50X dNTP 混合物 5’PCR 引物 3’PCR引物 10X溶解液

50X Advantage 2聚合酶混合物 总体积 2. 扩增程序： 95°C x Cycles

30 sec

2 μl 70 μl 10 μl 2 μl 2 μl 2 μl 10 μl 2 μl 100 μl

95°C 10s 68°C 6 min 5min

68°C

3. 对每个样品取7 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

三 CHROMA SPIN.+TE-400纯化柱纯化ds cDNA

1. 将剩余的93ul的cDNA样品加入CHROMA SPIN TE-400 纯化柱中，颠倒纯化柱数次，重悬胶基质，直至均匀。移除顶端帽子，掰断柱底部的break away,将柱放置在2ml 的收集管中。 2. 700 rpm，5 min离心，丢弃收集管和平衡液，之后让matrix半干。

3. 将将离心柱放在另第二个收集管中，然后，向胶基质平坦的表面上方加入93ul的样本。4. 700 rpm，5 min离心，样本便流到了收集管中。

5. 将两次的纯化样本收集到一个离心管中，并用乙醇进行沉淀cDNA：

加入 1/10体积的3 M 醋酸钠。 加入2.5倍体积的冰乙醇 (95–100%)。 –20°C ，1 hr放置沉淀。 14,000 ，室温离心20 min。

弃上清，14,000 rpm瞬时离心，去除残留的上清液。 空气干燥10 min。

6. 20 μl 去离子水重悬cDNA，用于酵母文库构建。

四 建立Mate & Plate 文库

1. 遵循酵母转化系统文库规模酵母转化操作，向0.5ml Y187感受态中共转化下列组份： 已纯化的ds cDNA pGADT7-Rec (0.5 μg/μl)

2. 按照转化操作的第二步，将酵母重悬于15ml 0.9% (w/v) NaCl中。

3.将100 μl 的 1/10 、1/100稀释液分别铺板于 SD/–Leu 100 mm 固体培养基上， 30°C，孵育 3–4d，确定文库的库容。

2–5 μg 6 μl

4. 将剩下的悬浮液铺板于150 mm SD/–Leu选择培养基上，每板100 μl 悬浮液，约使用150板，30°C 孵育3-4d

5. 收获Step4中的转化子： a. 4°C ，3–4 h冷却培养板。

b. 加入5 ml 的冻存液（YPDA/25%甘油）。

c. 使用无菌的玻璃珠分离菌落（缓缓地摇晃培养板，玻璃珠均匀地滚动于培养基表面将分离菌落，分离后的菌落溶于冻融液中）。

d. 将所有的液体收集于无菌的单管中(收集后的体积要达到0.5 L)。

e.用血球计数板来计算细胞密度，若细胞密度小于<2 x 107/ml，离心来减少悬浮液的体积。 f. 将文库分装到2ml的离心管中（1ml/管）， -80℃贮存。 6. 取1ml单管文库进行筛选。

酵母细胞感受态的制备及转化

小样转化

文库转化

1 在转化实验的两天前，于YPD培养基的平皿上活化酵母菌株(Y2H/Y187)。 2. 转化前一天，挑取活化的酵母细胞（单克隆）于YPDA液体培养基中，30°C， 200rpm培养8-12h。

3. 取5μl上述酵母细胞液于50ml的YPDA培养基中， 30°C，200rpm培养 8-12h至OD600>1.5。

4.将上述酵母细胞液离心后转接到新的YPDA液体培养基中，使OD600=0.2，

50ml 150ml

300ml 1L

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/jtit.html