透析袋

生 物 化 学 实 验 指 导

第一部分 常用生物化学实验技术及原理

第一章 透 析(Dialysis)

透析是利用小分子能通过,而大分子不能通过半透膜的原理把它们分开的一种重要手段。通常的做法是将小分子和大分子的混合物放进用半透膜制成的透析袋里并沉没在大量的水中。袋内的小分子就不断通过膜进入外部溶剂中待达到平衡为止。如果对流水透析或不断更换透析袋的溶剂可以做到袋内的混合物几乎不含小分子。透析的速度受一些因素的影响。下面就粗略地讨论这些因素。 一、膜

1、材料 火棉胶是最常用的透析袋材料。各种规格的火棉胶袋已做成商品出售。也可用玻璃纸代替火棉胶。

2、制备 先将一适当大小和长度的透析管放在碱性EDTA溶液中沸腾30分钟以避免待透析的分子损失活性。然后，用蒸馏水洗涤透析管。结扎管的一端并将所研究的材料充满透析管（袋），然后结扎顶部。透析最好在新制备的管中进行，因为湿的透析袋非常容易受微生物感染。如果必须保存透析袋，则应有溶液中加入痕量的苯甲酸。

3、通透性 透析袋的通透性因袋的大小和预处理的方法不同而异。但透析过夜时，半透膜大体可以允许相对分子质量（Mr）30000以下的化合物通过。实际上没有严格的界限，透析时间延长时稍大的分子也透过膜。有一系列的商品材料有更高的透析速度和更精细的通透范围可做精细分离之用。 二、溶剂

1、水溶液 一般说，透析的速度在蒸馏水中最大，虽然通常需要特定的pH和离子强度的水溶液来稳定所研究的分子。

2、大分子溶液 透析时水将进入透析袋，因此应该将透析袋装满以避免透析的材料过于稀释。如果用一种不活泼的高分子化合物如聚乙烯醇6000代替通常使用的水溶液作为溶剂，则透析时水就会由透析袋中渗出，用这种方法透析过夜，可将200mL溶液浓缩至几mL。 三、物理条件

1、温度 透析速度也受温度的影响，温度越高透析速度越快。提高温度时，溶剂的粘度降低而扩散速度增加。此外，许多大分子对温度很敏感，因此蛋白质等的透析通常在低温条件下进行。

2、压力 大分子和小分子的分离也受通过膜时的压力梯度影响。可将透析袋放在真空中（而不放在溶液中），并敞开透析袋的一端，此时水和小分子会渗出透析袋形成超滤液，而留在透析袋中的大分子被浓缩。这个过程称为超滤。 四、董南(Donnan)膜平衡

由于大分子电解质的存在，而使一般电解质不均等分配在半透膜两侧的平均状态，称为膜的平衡。

蛋白质溶液的渗透压与溶液的pH有关系。有酸性pH下，蛋白质以阳离子存在，带有正电荷；而在碱性pH下，以阴离子存在，带有负电荷。当蛋白质盐溶液透析时，带电的蛋白质分子不能透过半透膜，而溶液中对立的阴离子或阳离子就要通过半透膜以平衡电荷，这就导致离子的膜两边不均等的分布，同时关系到pH的变化。这种现象有就称为董南效应，又称分布，同时产生pH的变化。这种现象就称为董南效应，又称董南平衡。如带负电荷的蛋白质盐溶液对水透析时，蛋白质不能透过透析袋，而它的反离子可以通过，结果造成环境介质中阳离子过多。为了保持中性，水就分解出氢离子移进透析袋内，蛋白质部分的pH因此下降而水部分的pH上升。反之，如蛋白质带正电荷，则pH的变化相反。董南效应可以导致蛋白质沉淀或变性，因而是不可取的。为减少董南效应，透析通常对具有适当浓度的盐溶液进行。

第二章 层析法(Chromatography)

层析法也称色谱法，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的（称为固定相），另一个相则流过此固定相（称为流动相）并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。

层析法是近代生物化学最常用的分析方法之一，运用这种方法可以分离性质极为相似，而用一般化学方法难以分离的各种化合物，如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。

层析法有许多种类，可以根据所用两个相的状态和操作方式不同进行分类如

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表2-1。

表2-1层析法的一般分类

固定相 固体：吸咐剂 离子交换剂 固体 液体 液体 液体 固体 液体 流动相 液体 液体 液体 液体 液体 气体 气体 操作方式 柱型 薄层 柱层 薄层 纸 柱型 柱型 名称 吸附层析 离子交换层析 吸附薄层层析 分配层析 分配薄层层析 纸层析 气体吸咐层析 气体分配层析 此外，还有凝胶层析、亲和层析和高压液相层析等方法。在讨论几种常用的层析法之前，先介绍一下柱层析法的一般技术。 一、柱层析法的一般技术

1、柱 层析柱通常是玻璃的。总的说来，长柱分辨力好，但大量物质的处理则用粗的柱比较适宜。

2、层析材料的准备许多材料都可在层析法中使用。在装柱前这些材料要用溶剂平衡，另外还需作一些预处理。例如，凝胶层析材料需要溶胀，吸附剂需要加热或酸处理来活化，离子交换树脂需要用酸碱处理来得到需的电离形式。 在用溶剂平衡时，先使材料沉淀，用倾泻法除去悬浮的细颗粒，否则由于细颗粒的堵塞，溶剂的流速将显著降低

3、装柱 层析柱的填装是先关闭出口，用溶剂灌注至1/3体积，并使支持板下的“死体积”不存有气泡，再慢慢地向溶剂中加浆状物，要小心地沿着玻棒倾注以防止气泡存留在柱内。让悬浮液沉淀，并放出过多的溶剂，为了避免分层，最好一次装完，如需分几次填装，则在二次填装前应先在已经沉淀的表面用玻棒搅拌后再倾注，重复这个过程，直至装到需要的高度。用溶液彻底洗涤层析柱后使液面降到比层析床表面略高一点。最后覆盖一张圆形滤纸或尼龙布，以免加样时扰乱床表面。

4、加样 上柱前，先将样品溶解在溶剂里或对洗脱液透析，样品溶液的浓度应该尽可能高些，以减少样品溶液体积，使区带狭窄。将样品仔细加到层析床的

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表面，打开旋塞至液面与床面齐，然后连接溶剂池，保持一定高度的液面。 5、洗脱 下一步是用适当的洗脱液把各组分依次从柱上洗脱下来。 在取代扩展法中，溶剂与层析材料的相互作用比柱上的物质与层析材料的相互作用要强，于是与柱结合的分子被取代。每一个柱能结合多少物质都有一个限度（即总柱容量）。在取代扩展的情况下，当样品上柱量差不多达到总柱容量的50%时，一般尚能完全完分离。但是为了得到更好的分辨力，洗脱法更为可取。 洗脱法是最常用的方法。使用洗脱法，上柱量不超过总柱容量的10%，溶剂与柱相互作用比溶质与柱的相互作用弱，溶剂越过结合的分子，逐渐地将它们从柱上冲洗下来。在冲洗过程中各组分因为吸附力不同而逐渐分离。在一个组分被洗脱后可以更换洗脱液，这就是所谓的分步洗脱。另外，还有一个可行的方法是逐渐改充溶剂的性质，形成一个离子强度、pH或极性的递增梯度从而使各组分依次被洗脱，这种方法称梯度洗脱，它的优点之一是能够减少拖尾现象。 6、部分收集及分析 柱的流出液可以用人工的方法收收集到一系列试管中或使用部人收集器。这种装置能使每一管按预定的时间或滴数收集流出液，然后自动移位，下一管再继续收集。洗脱完毕后可选用各种适宜的方法将已收集的许多部分流出液进行定量分析，并画出洗脱物的量对流出液体积的洗脱曲线。第一部分的蛋白质或核酸的含酸的含量可以让流出液通过一个流动小室测定其280nm或260nm的光吸收来进行连续监测。 二、几种常用的层析法 （一）吸附层析

这是首次由Tswett用来分离色素的层析方法。吸附剂的经典含义可能说成是一种表面具有吸咐分子的特性的固体（特别是当它是多孔的和分得很细的时候）。如氧化铝、硅胶、活性炭等固体物质都具有吸附性能，可以将一些物质自溶液中吸附到它的表面。它和离子交换换树脂不同，吸附剂表面和分子的吸引力，理论上不含有静电力。吸附可以是非常特异的，以致于可以从一个混合物中选择性地吸附一种物质。用这种方法所以能进行各种成分的分离是由于它们被吸附剂所吸附的程度以及它们在分离用的溶剂中的溶解度有差异。当然这些特点是由各成分的分子结构所决定的。

例如，在柱吸附层析中，混合物的分离是在装有适当吸附剂的玻璃柱中进行的。混合物加到柱上，然后用一个适当的溶剂(或是混合溶剂)通过这个柱。混合

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物就随着溶剂的流动而逐渐分开。最初溶剂刚倒在吸附柱上时，混合物被吸附剂逐渐分开。最初溶剂刚倒在吸附柱上时，混合物全被吸附剂吸附在柱的上层，当继续加入溶剂时，柱中就会连续不断地发生混合物中各物质的溶解，吸附，再溶解，再吸附的反复交替过程。如被吸附的某物质被溶剂解出来（解吸作用）后就随着溶剂向下面流动，当遇到新的吸附颗粒时，又从溶剂中吸附出来，后面继续流下来的新溶液又再把它溶解出来并被带着往下移动，又再被吸附。就这样，经过一段时间之后，混合物中各物质都会从柱顶向下移动一段距离，但是由于各物质被吸附剂吸附的程度以及它们被溶剂溶解的能力不同而向下移动的距离不同因而彼此分离。吸附性弱的，就比较容易被溶剂溶出，又因为它再被吸附的力量比较弱，所以在柱中移动的距离就大些。经过适当的时间后，混合物中各物质就可以完全分开。

现在一般最常用的方法是在各组分离以后，让柱继续展开，用溶剂把被吸附的物质由吸附柱上冲洗出来，部分地收集从柱上流出的洗脱液，随后再进行分析。 对任何一种特殊的吸附剂和溶剂洗脱系统的选择由所要完成的分离来决定。在选择吸附剂时必须小心，因为有时一些吸附剂在分离时可引起某些化合物的降解。

吸附层析的操作方式在柱型和薄层两种。具体操作技术请见本章“一、柱层析法的一般技术”和“（四）薄层层析”两部分。 （二）离子交换层析

离子交换层析利用含有能与周围介质进行离子交换的不稳定离子的不溶性基质来分离分离物质。

1、离子交换基质 Adams和Holnes有1935年通过酚、甲醛和磺酸缩聚成不溶性树脂，制成了第一个人工合成的离子交换材料。从此以后，人工合成的离子交换树脂日见增多（多数是从芳香族化合物合成的），由苯乙烯及交联剂二乙烯苯聚合得到的物质是一种常用的树脂基质。

通过适当的反应再将可电离基团引入到芳香环上，二乙烯苯和苯乙烯的相对含量决定了聚苯乙烯链之间的交联度。交联度是指这种树脂骨架中含有二乙烯苯的重量百分率。国产树脂的交联度一般为4%~14%。树脂的交联度小时，则水溶性强，加水后树脂的膨胀性大，网状结构的网眼大，交换反应快，交换选择性低。相反，树脂的交联度大时，则水溶性弱，加水后树脂的膨胀性小，网眼小，交换

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慢，具有一定的选择性。

离子交换树脂适合分离小分子物质，如氨基酸，但对于大分子，如蛋白质是不适合的，因为大分子不能进入树脂紧密交联结构的内部。因此大分子可以用取代的纤维素和葡聚糖来分离，这些物质的分子是纤维状的，它们的大部分功能基团在表面。

2、可电离基团 按照离子交换树脂对阴离子或阳离子的亲合特性可以分为阴离子交换树脂和阳离子交换树脂。例如，阳离子交换树脂交换周围介质的阳离子，也就是说，决定树脂究竟是阴离子的还是阳离子树脂的可交换离子所带的电荷，而不是基质上所带的电荷。

这两种类型又可进一步分成含有强电离基团的，如强酸型和强碱型；及弱电离基团的，如弱酸型和弱碱型。强离子交换树脂是完全电离的，并以带电形式存在（在极端pH值时例外）。弱离子交换树脂所含基团的电离程度依pH一个狭窄的pH范围有最大交换容量方能使用。一般含羟基的树脂在pH6左右有最大容量，而带有氨基的那些树脂在pH低于6时才有效。

离子交换纤维素含有取代了纤维素一OH的弱电离基团，这些基团的密度比较低，因为取代太多时就会使纤维素变得可溶。

对于分离结合较弱的大分子时，用弱电离部位密度较低的交换剂适合，而且在温和条件下容易解析。

3、离子交换平衡 典型的离子交换反应过程说明，在这里用含有氨基的阴离子交换树脂分离两个负电性离子。树脂可电离基团的浓度几乎可以达到6~10mol/L，因此有很高的交换容量。

虽然一般以为离子交换树脂的作用仅仅是通过离子交换过程来分离物质，但实际上也可能存在吸附作用和分子筛作用。

4、结合离子的洗脱 结合离子可以通过改变缓冲的pH来洗脱。例如，当pH靠近一种蛋白质分子的等电点时，这种蛋白质分子的净电荷就减少，与树脂的结合就减弱而被洗脱，别的带电的蛋白质仍然结合在柱上，这样就达到了分离的目的。另外，溶剂中的离子要与结合离子对离子交换剂的可电离基团发生竞争，溶剂中的离子浓度高时，就会取代结合离子，所以增加离子强度也可将结合离子洗脱。

pH或离子强度可以通过更换洗脱缓冲液陡然地改变，可用前面介绍的梯度方

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法逐渐地改变。

离子与树脂的结合是一种动态平衡，其结合程度取决于树脂的性质、温度、离子强度和溶剂成分。同时还与树脂的电离度和被分离的物质有关。高价离子最容易结合而不易洗脱，所以在用一种高价离子取代结合离子时应使用稀溶液，而如果要导入一种低价离子时则需用浓溶液。

5、离子交换材料的准备 树脂和取代多糖（取代纤维素、取代葡聚糖）首先要在蒸馏水中吸胀，并去掉过细的颗粒。商品树脂，特别是阳离子交换剂会含有铁或其他重金属，可以用2~4mol/L的盐酸洗涤去除。

通过用适当的溶液洗涤可获得所需要的离子形式的离子交换材料。例如，氢型的阳离子交换树脂是先用盐酸洗涤，然后用水洗涤直至流出液呈中性为止。同样制备钠型是用氯化钠或氢氧化钠溶液洗涤树脂，再用水洗涤至中性。 装柱前的最后一步是用洗脱缓冲液平衡树脂，显然缓冲离子必须是不与树脂结合的。

6、离子交换层析的操作技术 详见本书第三篇演示实验二。 （三）分配层析

常用吸附层析分离法易溶于有机溶剂而难于水的混合物。可电离的水溶性混合物最适宜用离子交换层析法分离。分配层析法界于二者之间，在水和有机溶剂中都可溶的混合物用分配层析法易分离。

当把一种物质在两种不混溶的溶剂中振荡时，它将在这两相中不均匀的分配。达到平衡时，这种物质在两种溶剂中的浓度之比是一个常数，也就是所谓的分配系数（a）。

分配层析法实际上是一种连续抽提法。在这里，一种溶剂通常是被结合在固定的惰性支持物（柱或膜）上的水，另外一相由流动的被水饱和的有机溶剂构成，它流过固定相，如果某一混合物的各组分在这两相中的分配系数有足够的差异，它们就可以被分离。

1、纸层分析的理论 Consden，Gordom和Martin首先用滤纸作支持物并以茚三酮为灵敏显色剂，建立了微量而简便的分离蛋白质水解液中氨基酸的方法。不久又发现除了氨基酸外，糖、核苷酸、甾体激素、维生素、抗生素等很多物质都能用纸上层析法分离，因而纸层析成为生物化学工作中一种常用的分离分析方法。

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滤纸是理想的支持介质。在纸上，水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。由于纤维素上的羟基具有亲水性，和水以氢键相连，使这部分水不易扩散，所以能与跟水混合的溶剂仍然形成类似不相混合的两相。当有机相沿纸流动经过层析点时，层析点上溶剂就在水相和有机相之间进行分配，且部分溶质离开原点随有机相移动而进入水相。当有机相不断流动时，溶质就沿着有机相流动的方向移动，不断进行分配。溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。

纸上层析法的一般操作是将混合物点到纸上，干后让溶剂从样品的一端经毛细作用流到纸的另一端。等纸干后，可用适当的显色方法使混合物中各组分在纸上的位置显示出来，物质移动的距离与溶剂移动距离之比就是Rf值。某一种物质在特定的溶剂系统、纸、展层方式、温度、pH等条件下的Rf值基本上是常数。 如果固定相不完全是惰性的，那么既发生分配，又有吸附作用和可能的离子交换，Rf和a的关系等式就会有例外。

2、样品的制备和点样 在研究生物材料时，做层析以前样品要脱盐（用离子交换或电渗析），过量的盐会使层析谱扩散和Rf值改变，同时还会影响辨认分离组分的化学反应。在层析前还可用超滤或葡聚糖来除掉蛋白质。然后用微量点样管将样品溶液（2~20μL）点于纸上，点的直径不超过0.3~0.5cm，如样品太稀需重复点几次时，每次点之前均应吹干，点间距离约2~3cm。

3、纸的选择 滤纸的质地必须均一、平整及厚薄均匀，要有一定的强度。一般分析工作可采用新华1号滤纸（或Whatman1号），若有较多的样品需要在纸上分离提纯时则适合采用新华3号（或whatman3号）厚纸，可是其分辨力比1号滤纸差。

溶剂顺着纸的纹道扩展速度快，否则速度慢。

必要时，使用前可将滤纸用缓冲液浸泡或经乙酰化作用进行化学修饰。 4、溶剂的选择 溶剂的选择与纸的选择一样，主要是根据经验，同时也取决于所要分析的物质。如果在溶剂A中样品物质移动离溶剂A的前沿近，那就是溶解度太大；如果在溶剂B中它们靠近原点周围，那就是溶解度不够大，因而合适的溶剂应该是A和B的适当的混合物，以使样品各组分的Rf值能在整个纸的长度上散布开，在某些分离中pH是一个重要因素，很多溶剂含有乙酸或氨以形成一个酸性或碱性的环境。

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5、展层 虽然展层的方式可以不同，但其共同点都是将点好样品的滤纸固定，使其一边与溶剂槽接触，让溶剂扩展，整个装置扣在密闭的容器内，槽壁衬垫浸透溶剂的滤纸以保持恒定的蒸气压并且放在恒温室里，温度的波动全使溶剂走得不均匀，并改变Rf值。 展层方式有上行、下行和环行。

上行层析是比较常用的方法，它的优点是可以在两个方向上进行（即双向层析）。混合物先在第一种溶剂中被分离（溶剂应是挥发性的），干燥后将纸转900，再在第二种溶剂中进行层析。显色或用其他方法定位后得到的层析图谱与在相同条件下已知物的层析图谱比较就能鉴定混合物的各组分。 下行层析适用于一些Rf值接近的混合物。

因为溶剂滴离纸的底部，这就能使各组分较充分地分离。当然在这种情况下不能测定Rf值，而只能与标准参考物，如葡萄糖相比较。

6、显色 大部分化合物是无色的，可以用特殊的显色剂使其显色，配制显色剂时最好使用与水不混溶且挥发性较大的溶剂。显色剂可用喷雾器喷雾或迅速将纸在显色剂中浸渍。

如果被分离物质本身具有紫外吸收性质，可在紫外线照射下与纸的荧光背景对照显出暗的斑点。另外，有些化合物在紫外线下发出特殊的荧光。 （四）薄层层析

и3Ma?JIOB和IIIpa?бep在1938年叙述了植物萃取物在氧化铝薄层上的分离，但是直到1956年以后薄层层析才逐渐引起各方面的注意和重视。 薄层层析法是将支持物在玻璃板上均匀地铺成薄层，把待分析的混合物加到薄层上，然后选择合适的溶剂进行展开，而达到分离鉴定的目的。薄层层析兼有柱层析和纸层析的优点。它操作方便，设备简单，展开时间短，一般只需几分钟到几十分钟。它灵敏度高，适用于微量样品的分析（小到0.01mg），但是加大薄层的厚度则又能分离较多（大到500mg）的样品。薄层层析还有一个优点是除了可用一般显色剂外，对某些薄层材料还可用腐蚀性显色剂，另外，还可以在支持物中加荧光染料以有助于点的鉴别。

薄层层析法分离物质的原理依所用不同支持物的性质而不同，可以是吸附层析、离子交换层析、分配层析或是凝胶过滤。

1、薄层的制作 在玻璃板上涂铺一层薄层，最简单的方法是在一根玻棒的

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两端绕几圈胶布，用玻棒压在玻板上，把支持物向一个方向推动，即成薄层。 有时用上述方法制得薄层不太均匀，可能用有机玻璃自制一个涂铺器即能取得满意的结果。

薄层厚度小于200um时将影响Rf值，一般情况下厚度为250um比较合适。 可做薄层材料的物质很多，如硅胶、氧化铝、纤维素粉、DEAE纤维素、葡聚糖等，具体选择哪一种依所研究的问题而定。硅胶对大多数的物质分离都是适宜的。

有时在硅胶中加入煅石膏作为粘合剂，这时一旦与水调合就需快速操作。 2、展开 薄层层析的加样与纸层析基本相同。薄层的展开需在密闭的器皿中进行，溶剂必须达到饱和，可以在器皿内部贴上浸湿了溶剂的滤纸条。薄层层析的展开方式与纸层析一样，可以是上行、下行、单向或双向。

3、定位 和纸层析一样，可用适当的显色剂喷雾或根据组分的紫外线吸收或荧光来定位。在有放射性物质时用扫描来定位。 （五）凝胶层析

1、凝胶层析也称凝胶过滤法，是20世纪60年代发展起来的一种简便有效的生物化学分离分析方法。这种方法的基本原理是用一般的柱层析方法使相对分子质量不同的溶质通过具有分子筛性质的固定相（凝胶），从而使物质分离。 用作凝胶的材料有多种，如交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、聚苯乙烯和多孔玻璃珠等。现以利用交联葡聚糖分离物质和测定相对分子质量为例说明凝胶层析法的基本原理和应用。

交联葡聚糖（商品名Sephadex）是由细菌葡聚糖（以右旋葡萄糖为残基的多糖）用交联剂环氧氯丙烷交联形式的有三维空间的网状结构物。控制葡聚糖和交联剂的配比及反应条件就可决定其交联度的大小（交联度大，“网眼”就小），从而得到各种规格的交联葡聚糖，即不同型号的凝胶。“G”表示交联度，G越小，交联度越大，吸水量也就越小。

把经过充分溶胀凝胶装入层析柱中，在加入样品以后，由于交联葡聚糖的三维空间网状结构，小分子能够进入凝胶，较大的分子则被排阻在交联网状物之外，因此各组分在层析床中移动的速度因分子的大小而不同。相对分子质量（Mr）大的物质只是沿着凝胶颗粒间的孔隙随溶剂流动，其流程短，移动速度快，先流出层析床。相对分子质量小的物质可以透入凝胶颗粒，流程长，移动速度慢，比

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相对分子质量大的物质迟流出层析柱。经过分部收集流出液，相对分子质量（Mr）不同的物质便互相分离。SpladexG-10到G-50通常用于分离肽或脱盐。G-10到G-50通常用于分离肽或脱盐。G-75到G-200可用于分离相对分子质量大于10000的蛋白质。

交联葡聚糖分子含有大量的羟基，极性很强，易吸水，所以使用前必须用水充分溶胀。1g干重凝胶充分溶胀时所需的水量（mL）称为凝胶的得水值（Wr）。因为得水值不易测定，故常用溶胀度即床体积来表示凝胶的得水性，其定义是每克干重凝胶颗粒在水中充分溶胀后所具有的凝胶总体积。

2、凝胶柱的总体积（总床体积）Vt是干胶体积Vg，在凝胶颗粒内部的水的体积Vi及凝胶颗粒外部的水的体积Vo之和。 Vt也可从柱的直径及高度计算。

Vo也称外水体积。常常用洗脱一个已知完全被排阻的物质（如蓝葡聚糖2000）的方法来测定，此时其洗脱体积就等于Vo。

Vi称为内部体积或内水体积，可以从凝胶干重（mg）和得水值Wr计算： Vi = mg. Wr

Vi也可以从洗脱一个小于凝胶工作范围下限的小分子化合物，如铬酸钾来测定，其洗脱体积等于Vi+Vo。

某一物质的洗脱体积Ve为：Ve=Vo + KdVi

Kd为溶质在流动相和固定相之间的分配比例（分配系数），每一溶质都有特定的Kd值，它与层析柱的几何形状无关。

如果分子完全被排阻，则Kd=0，Ve=Vo。如果分子可以完全进入凝胶，那么Kd=1，Ve=Vo+Vi。在通常的工作范围内Kd是一个常数（0〈Kd〈1），有时Kd可能大于，则说明发生了凝胶对溶质的吸附。

溶质的洗脱特征的有关参数（Ve/Vo，Ve/Vt，Kd，Kav）都与溶质相对分子质量（Mr）对数成线性关系，先洗脱几个已知相对分子质量（Mr）的球蛋白，用Ve/Vo对logMr对作图，然后在同样条件下洗脱未知样品，从其Ve/Vo值，在图上即可找出相对应的logMr，从而进一步算出其相对分子质量（Mr）。 不同规格的凝胶都有一定的工作范围。一般说，在工作范围之内所得的曲线是线性的，超出工作范围曲线就不成线性。 （六）亲和层析

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亲和层析法是分离蛋白质酶等生物大分子的一种极为有效的方法。它在蛋白质分离技术中占有特殊的地位。前面讨论的各种分离方法是根据混合物中蛋白质之间的物理性质和化学性质(如蛋白质的溶解度、电荷、分子大小或疏水作用等)的差别来纯化的。这些方法的主要缺点是具有相似性质的蛋白质，由于性质差别微小而难于分离，而亲和层析是根据某种蛋白蛋对于某种配体的生物专一性。因此，如果能利用这种不同的生物专一性作为分离的基础，就会产生一种有效的纯化蛋白质的方法。早在1910年，就有人发现淀粉能吸附淀粉水解酶，在1951年，有人以“免疫吸附剂”的形式来分离抗体；1967年，Werle等人开始用胰蛋白酶的不溶酶提纯胰蛋白酶抑制剂，等等。经过几十年的研究，逐渐发展成一种新型的分离技术——亲和层析。细胞内任何一种蛋白质都有专一作用的对象。因此，从原则上讲，所有的蛋白质都能通过亲和层析来分离和纯化。与蛋白质发生亲和作用的基团称为配体（ligand）。配体是指能被生物大分子所识别并与之结合的原子、原子基团和分子。例如，酶的作用底物、辅酶、调节效应物、激素的受体、抗原与抗体互为配体。

1、亲和层析的基本原理 蛋白质与配体之间有一种特殊的亲和力，在一定的条件下，它们都紧密结合成复合物，如果将复合物的某一方固定在不溶性载体上，就可以从溶液中专一性地分离和提纯另一方。与其他方法相比，亲和层析能产生绝对的纯化作用，因此，可达到较高的纯度。采用一般的方法是提纯酶、抑制剂等生物制剂，操作十分复杂，而采用亲和层析，只需一步就能提纯百倍，甚至千倍，从而得到纯的产品，产率可达到75%~95%。

2、亲和层析的基本方法 先将提纯的某种蛋白质的配体通过适当的化学反应，共价的连接在载体颗粒表面的功能团上。这种载体材料在其他性能方面，允许蛋白质自由通过，当含有待提纯的蛋白质则与其特异的配体结合，因而被吸附在配体的载体的颗粒表面，而其他的蛋白质因对这个配体不具有特异性的结合位点，将通过柱子而流出。被特异地结合在柱子上的蛋白质，可用自由配体的溶液洗脱下来，或通过改变溶液的pH、离子强度，或采用一些弱的变性试剂减弱其结合，或采用某种更强的结合物质与其竞争，使其从柱中分离出来，达到纯化的目的。

3、固相载体介质 一般用作凝胶过滤的介质，大都适用于亲和层析的介质。它们具有稳定的物理和化学性质，具有均匀、多孔的网状结构，允许大分子物质

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自由通过，流动性好，非特异性吸附少。这些固相载体首先要用化学方法进行活化，使其具备与特定的配体相结合的化学活性基团。最常用的活化方法是用溴化氰（CNBr）活化琼脂糖，目前已有商品出售。

载体中的邻位羟基和溴化氰反应形成亚氨碳酸基因。此基因通常可以和含氨基或羟基的配体反应，使配体结合在固相载体上。用溴化氰活化直接把配体结合在载体上，能使配体和载体偶联紧密，但是在生物大分子特异结合时，由于空间位阻的效应，会影响大分子结合的效率。改进的方法是在载体上连接一个臂（一般含6个碳原子），臂的未端为一活性基团，如氨基、羧基、活化的酯基等，靠这些活化的基团和配体结合在一起。如CH-Sepharose 4B带有一个6碳长的臂及活性的末端羧基；环氧活化的Sepharose6B，臂上带有一个活化的酯基；AH-Sepharose4B，其臂末端带一氨基；CDI-agarose含有N-氨基甲酸烷基酯。亲和层析的载体多为凝胶，可分成两类：一类是大孔型的凝胶，如琼脂糖凝胶其网状结构的孔径较大，容许大分子自由进出凝胶。另一类为微孔型的凝胶，如交联葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺基，它们是小孔径的网状结构的凝胶，使分子被排阻在凝胶颗粒之外。琼脂糖凝胶最为常见但缺点是当用变性剂溶液洗脱时易于收缩。今年来出现的，由有机亲水聚合物组成的凝胶，如乙烯聚合物，可抗压、抗酶降解，化学稳定性好，适于中等压力下进行大规模分离提纯。聚丙烯酰胺含有大量的羰酰胺基，可以作为支持物载体，其缺点是孔径太小。表面修饰的硅胶也可以作为亲和层析的介质，而且已应用于高效液相色谱中，这就是高效液相亲和层，它正成为生物工程的一种新工具。

4、配体的选择 配体是亲和层析中最重要的成分。首先，配体必须和被分离的大分子物质能形成适当亲和力的、特异的和可逆的结合。亲和力过低，大分子物质不能和配体有效结合，但过高的亲和力，需要在较强的条件下才能解析下来，而且有可能使某些被分离的大分子物质变性。所以一般要求配合和大分子物质的解离常数为5*0.001~5*0.00000001mol/L。

选择好的配体有3个原则。一是能和欲分离的生物大分子专一性结合，而且亲和力越大越好；二是结合后又能解离，而且无损于生物大分子的生物活性；三是配体上必须含有适当的化学基团，通过这些基团可以用化学方法把配体偶联到载体介质上去，而且这种偶联不损害配体与生物大分子的专一性结合。用于亲和层析的配体大体分为3类：一是对特定蛋白质具有亲和力的小分子配体，如酶的

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底物（或底物类似物）、调节配体、效应物、酶的辅助因子等；二是对特定蛋白质有亲和力的大分子，如抗体、伴刀豆球蛋白A、蛋白质类抑制剂、维生素或激素的结合蛋白或受体等；三是共价亲和层析中的配体，它含有能与目的蛋白质共价可逆作用部分。

小分子配体与目的蛋白质的结合专一性往往较差。如用固定化NAD纯化脱氢酶时，很多脱氢酶和其他蛋白质都能以类似的亲和力结合NAD，在缓冲液中加入共配体（coligand）和寻找最佳实验条件可增强目的蛋白质对配体的亲和力。 大分子配体有3类：一类是凝集类蛋白质，能结合蛋白质上的糖，可用于纯化糖蛋白，如伴刀豆球蛋白A、抗生物素蛋白能共价结合许多生物素的酶。蛋白质A能结合IgG分子的Fc部分，且亲和力很强；二类是抗体，使用抗体作配体的亲和层析称为免疫亲和层析；三类是对某种蛋白质有很强亲和力的蛋白质，如a-乳清蛋白，它在糖配体（N-乙酰葡萄糖胺）存在下，能与半乳糖转移酶发生强烈的亲和作用。

第三章 电泳技术(Electrophoresis)

带电质点在电场子中移动的现象称为电泳。电泳现象早在19世纪初期就被人们发现了，并用于胶体化学中，但是电泳技术的广泛应用则在20世纪40年代左右。近年来各种类型的电泳技术发展十分迅速。例如，纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、纤维素或淀粉粉末电泳、琼脂糖凝胶电电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、线丝电泳等。在电泳形式上更是丰富多样，有在溶液中进行的，有将支持物做成薄膜或薄层的，也有做成平板的或柱状的。由于与光学系统和自动分部收集器相结合，又组成了等电聚焦仪，等速电泳仪等等，大大地发展和扩大了电泳技术的应用范围。

各种类型的电泳技术概括如下表3-1：

表3-1电泳技术的种类

类别 名称 型式 属自由电泳 不用支持物的电泳1、Tiselleus式微量电泳 技术 2、显微电泳 3、等电聚焦电泳 13

4、等速电泳 5、密度梯度电泳 1、纸上电泳 2、醋酸纤维薄膜电泳 3、薄层电泳 包括常压、高压电泳（水平式或垂直式） 4、非凝胶支持物区带电水平式或垂直式泳支持物有：淀粉、（平板法、柱状纤维素粉、玻璃粉、法及线丝法） 硅胶、合成树脂粉末 5、凝胶支持物区带电泳 （1）淀粉凝胶 （2）聚丙烯酰胺凝胶 1）圆盘电泳 2）平板电泳 3）SDS-圆盘电泳 （3）琼脂糖凝胶电泳（4）琼脂凝胶电泳 用法 1、双向电泳 2、电泳-层析相结合技术 3、交叉电泳法 4、连续纸电泳 垂直式（柱状法） 垂直式或水平式 垂直式（测相对分子质量） 平板法或柱状法（如免疫电泳） 一、电泳技术基本原理

任何一种物质的质点，由于基本身在溶液中的解离或由于其表面对其他带电质点的吸附，会在电场中向一定的电极移动。倒如，氨基酸、蛋白质、酶、激素、核酸及其衍生物等物质都具有许多可解离的酸性和碱性基因，它们在溶液中会解离而带电。一般说来，在碱性溶液中（即溶液的pH值大于等电点pI），分子带负电荷，在电场中向正极移动。而在酸性溶液中，分子带正电荷，在电场中分子向负极移动。移动的速度取决于带电的多少和分子的大小。

不同的质点在同一电场中泳动速度不同，常用泳动度（或迁移率）来表示。

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泳动度的定义是带电质点在单位电场强度下的泳动速度。

泳动度首先取决于带电质点的性质，即质点所带净电荷的量、质点的大小和质点的形状。一般来说，质点所带净电荷越多，质点直径越小，越接近于球形，则在电场中的泳动速度越快；反之，则越慢。泳动度除受质点本身性质的影响外，还受其他外界因素的影响，如溶液的粘度等。影响泳动速度的主要外界因素还有下列几种：

（一）电场强度（电势梯度）

电场强度是指cm的电压降，它对泳动速度起着十分重要的作用。例如，纸上电泳的支持物滤纸两端相距20cm，如电压降为200V，则电场强度为200V/20cm=10V/cm。电场强度越高，带电质点移动速度越快，根据电场强度的大小，可将电泳分为常压（100~500V）电泳和高压（500~10000V）电泳。常压电泳的电场强度一般为2~10V/cm，电泳分离时间较长，有时需要几小时至几天；高压电泳的电场强度为20~200V/cm，电泳分离时间较短，有时仅需几分钟。常压电泳多用于分离蛋白质等大分子物质，而高压电泳则用来分离氨基酸、小肽、核苷酸等小分子物质。在生产中有时需要进行快速的中间分析，如果没有高压电泳设备，可以把常压电泳小型化，缩短滤纸两端距离，也可达到高压快速的目的。如将原来两端相距20cm的滤纸改为5cm，外加电压仍为200v，电场强度则变为40v/cm，这样就加快了电泳速度。 （二）溶液的pH值

溶液的pH值决定带电质点解离的程度，也决定物质质点所带净电荷的多少。对蛋白质、氨基酸等两性电解质而言，pH值距等电点越远，质点所带净电荷越多，泳动速度也越快；反之，则越慢。因此，当分离某一蛋白质混合物时,应选择一个合适的pH值，使各种蛋白质所带净电荷的量差异较大，以利于分离。为了使电泳过程中溶液的pH值恒定，必须采用缓冲溶液。

（三）溶液的离子强度

离子强度代表所有类型的离子所产生的静电力，也就是全部的离子效应，它取决于离子电荷的总数，而与溶液中盐类的性质无关。溶液的离子强度越高，带电质点的泳动速度越慢；离子强越低，质点泳动的速度越快。一般最适合的离子强度在0.02~0.2之间.

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在稀溶液中，离子强度的计算方法，是将每一离子浓度乘以其价数的平方，再将所有乘积相加，以2除和。计算公式如下： 离子强度（I）=0.5ΣCZZ

式中：C为离子的摩尔浓度（mol/L）； Z为离子的价数。 （四）电渗现象

液体在电场中对于一个固体支持物的相对移动，称为电渗现象。例如，在纸电泳时，由于纸上带有负电荷，而与纸接触的水溶液因为静电感应带有正电荷，在电场的作用下溶液便向负极移动并带动着质点向负极移动。假如这时进行电泳，则质点移动的表面速度是质点移动速度和由于溶液移动而产生的电渗速度的加和。若质点原来向负极移动，则其表面速度比电泳速度快。若质点原来向正极移动，则其表面速度比电泳速度慢。因此，在电泳时应尽量避免使用具有高电渗作用的支持物。 二、纸电泳

纸电泳是用滤纸作为支持物的电泳技术。它包括电泳槽和电泳仪两大部分。电泳槽是进行电泳的装置，其中包括电极、缓冲液槽，电泳介质的支架和不一个透明的罩。常见的电泳槽有水平式和悬驾式等。电泳仪是提供直流电源的装置，它能控制电压和电流的输出。纸电泳可分为低压电泳和高压电泳两类。低压电泳仪的电压一般为100~500V，电流为0~150mA。高压电泳仪的电压主为500~10000V，电流为50~400mA。电泳仪既能输出稳定的电压，又能输出稳定的电流。

纸电泳的设备简单，应用广泛，是最早使用的一种电泳技术。在早期的生物化学研究中，曾发挥重要作用。由于纸电泳时间长，分辨率较差，近年来逐渐为其他快速、简便、分辨率高的电泳技术所代替。 三、醋酸纤维薄膜电泳

采用醋酸纤维薄膜作业支持物的电泳方法，称为醋酸纤维薄膜电泳。醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。将它溶于有机溶剂（如丙酮、氯信、氯乙烯、乙酸、乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜，干燥后就成为醋酸纤维薄膜。现有国产醋酸纤维薄膜成品出售。醋酸纤维薄膜具有泡沫状的结构，厚度约为120μm，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。

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醋酸纤维膜电泳是近年来推广的一种新技术。目前已广泛应用于科学实验、生化产品分析和临床化验，如血清蛋白、血红蛋白，球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白，类固醇、同工酶等的分离和鉴定，这种方法具有简单、快速、样品量少、区带清晰、灵敏度高、便于照相和保存等特点。它的分辨力虽然比不上淀粉和聚丙烯酰胺凝胶电泳，但是比纸电泳要强得多，所以现在趋向用醋酸纤维薄膜电泳代替纸电泳。 四、琼脂凝胶电泳

在凝胶电泳中，琼脂凝胶电泳是最早得到广泛应用的。因为它具有下列优点：①在琼脂凝胶中含有琼脂1%~1.5%，其余都是水，在这种凝胶中电泳，近似自由界面电泳，可是样品扩散又比自由界面电泳小；②琼脂凝胶电泳支持物均匀，电泳区带整齐，分辨率高，重复性好；③液相与固相界面无明显界限，电泳速度快；④琼脂凝胶透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪测定；⑤区带容易染色，样品容易洗脱，利于制备；⑥干膜可以长期保存。

除以上的优点外，琼脂凝胶电泳也有它的不足之处，因为琼脂是一种强酸性物质，能造成严重的电渗现象，影响电泳的速度，而且琼脂所含可溶性杂质难于除去。

琼脂凝胶电泳肺痨板式和柱式两种，一般采用平板式。其实验步骤如下： 1、配置缓冲溶液 琼脂凝胶电泳常用缓冲溶液的pH值多在6~9之间，离子强度为0.02~0.05。离子强度过高时，由于大量电流通过琼脂板将产生热量，使板中水分大量蒸发而析出盐的结晶，甚至使用琼脂板断裂，电流中断。常用的缓冲溶液，有硼酸盐缓冲液和巴比妥缓冲液。

2、制板 制板常用的琼脂浓度为1%~1.5%。因为用这个浓度制成的凝胶富有弹性、坚固不脆。将一定两的琼脂用水浴加热熔化，趁热与等体积预热至60℃的缓冲液混合，使其浓度为1%~1.5%，继续加热至表面无气泡，迅速将凝胶倒在水平玻璃板上，使其厚度约为3mm，冷却后即成琼脂板（注意这里所用缓冲液的离子强度必须比电泳时的离子强度高1倍）。

3、点样 加样方法二：一是挖槽法，在琼脂板的中央挖一长方形小槽，将在水浴上熔化至42~45℃的琼脂与样品等量混合，倒入小槽中，也可直接将样品倒入小槽中；另一种是滤纸插入法，在琼脂板上适当的位置用刀片切一裂缝，插入蘸有样品的厚滤纸片，纸片的宽度与琼脂板厚度一致。样品浓度一般以4%~5%

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为宜。

4、电泳 加样完毕后，将琼脂板轻轻放在电泳槽上，两端用几层滤纸与电极槽缓冲液连接。接通电源，调节电压。一般电场强度为6V/cm。

5、固定和染色 将电泳后的琼脂板浸入70%酒精配制的2%醋酸溶液中15~20分钟进行固定。固定后的琼脂板，需用自上而下为水漂洗数次，然后放在40℃左右的烘箱中烘干，这时琼脂板成一薄膜，附于玻璃板上，再以适当的显色剂显色。

五、聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰凝胶电泳（PAGE）是根据被分离物质所带来的电荷多少及其分子大小、形状的不同，在电场的作用下，产生不同的移动速度而分离的方法。它具有电泳和分子筛的双重作用。

1、聚丙烯酰胺的聚合 丙烯酰胺单体和交联剂N1N′-亚甲基双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合成含有酰胺基侧键的脂肪族长链。相邻的两个链通过亚甲基桥交联起来就形成三维网状结构的聚丙烯酰胺凝胶。 常用的催化剂（包括催化剂和加速剂）有以下两种：

（1）过硫酸铵-TEMED（四甲基乙二胺）系统 在Acr和Bis的溶液中放入这个催化系统后，过硫酸铵产生出游离氧原子使单体成为具有游离基的状态，从而发生聚合作用。聚合的初速度和过硫酸铵浓度的平方根成正比。这种催化系统需要在碱性条件下进行。例如，在pH8.8条件下7%的丙烯酰胺溶液30分钟就能聚合完毕；在pH4.3时聚合很慢，要90分钟才能完成。温度与聚合的快慢成正比。通常在室温下就很快聚合，温度升高聚合更快。如将混合后的凝胶溶液放在0℃的地方，就能延缓聚合。一般来讲，温度过低，有氧分子或不纯物质存在时都能延缓凝胶的聚合。为了防止溶液中气泡含有氧分子而妨碍聚合，在聚合前须将溶液分别抽气，然后再混后。

（2）核黄素-TEMED系统 这是一个光激发的催化反应。核黄素在光照下分解，黄素被还原成无色型，但在有氧条件下，无色型又被氧化成有游离基的黄素环，使聚合作用开始。核黄素催化系统的优点是：①用量少（1mg/100mL），对所分析的样品没有任何影响；②聚合作用所用的时间可以自由控制，变化光照时间、强度，可使聚合延缓或加速。而过硫酸铵-TEMED系统的聚合作用所需的时间除了取决于温度、pH及有氧分子或不纯物质的存在外，还取决于它们的浓

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度。为了使分析的结果重复性高，核黄素催化系统的光照时间和强度最好标准化。 凝胶的机械强度和弹性是很重要的。凝胶的软硬、透明度、粘着度都会直接影响分离的效果。凝胶的机械性能、弹性、透明度和粘着度都取决于凝胶总浓度和Acr与Bis两者之比。

其中a：b（W/W）是很关键的。当a：b〈10时，凝胶变脆、变硬、呈乳白色时，a：b〉100时，5%的凝胶呈糊状，也易断裂。欲制备完全透明而又有弹性的凝胶，应控制a：b=30左右。不同浓度的单体对凝胶性质也有影响，发现Acr低于2%，Bis在0.5%以下就不能聚合了。当增加Acr浓度时要适当降低Bis的浓度。通常T为2%~5%时，a:b=20左右；T为15%~20%时， a:b=125~200。 用于研究大分子核酸的凝胶多为T=2.4%的大孔径凝胶，因为太软不易操作，最好加入0.5%琼脂糖。有的在3%凝胶中加入20%蔗糖也可增加其机械强度而不影响其孔径大小。至于粘着度，一般来说只要容器内壁干净，单体浓度适中，凝胶与器壁粘着附着力较大，随存放时间的延长附着力降低,有时在电泳结束时一部分胶柱就可能从管壁上滑脱出来。

2、聚丙烯酰胺凝胶的孔径 聚丙烧酰胺凝胶在电泳中不仅有防止对流，减低扩散的能力，而且还具有分子筛的作用，这是因为聚丙烯酰胺凝胶是一个三维空间网状结构。某一个分子通过这种网孔的能力显然取决于凝胶孔径的大小和形状，也取决于被分离物质的大小和形状。因此，当所分离的物质不时，凝胶越浓，孔径越小，所受阻力也就越大。 推算凝胶孔径的几种方法： （1）p=Kd/√c

式中：p为孔径的平均直径； c为多聚体浓度；

d为多聚体分子直径，若不是卷曲的分子应为0.5nm

K为常数,取决于凝胶的几何构型。假若多聚体的链是以近直角交联的，则约为1.5。

以5%凝胶为例可计算出其孔径平均直径为3.8nm.这样的计算是粗略的,与实际情况尚有一定的距离.

(2)有人计算7.5%凝胶孔径的平均直径为5nm,30%的为2mn左右.

(3)有人利用颗粒状聚丙烯酰胺凝胶做色层分析,测定了总浓度(T)为

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6.5%~20%的丙烯酰胺凝胶液在6种不同比例的双丙烯酰胺存在时聚合后的孔径大小。孔径的大小很大程度上取决于两者的总浓度(T)。T值增大，孔径相应变小，机械强度增强。值得注意的是当T值不变时，Bis浓度在5%时孔径最小，高于或低于5%孔径却相应变大，因此就可能有这样的现象出现：当Bis浓度在5%以上或以下时，尽管T值很大，但却比T值小而Bis为5%时的孔径要大。 分离蛋白质的实践证明，胶的孔径大约是蛋白质分子平均大小的一半时分析结果较好。例如，肌红蛋白和细胞色素分子的半径为2nm，那么可选择平均胶孔半径为1nm的凝胶度。因此，在实用中常按样品的相对分子质量(Mr)大小来选择适宜的凝胶孔径,如下表。

不同相对分子质量（Mr）范围所选用的凝胶浓度百分率

物质 蛋白质 相对分子质量 ＜104 1~4×104 4×104~1×105 1~5×105 ＞5×105 核酸（RNA） ＜104 104~105 105~2×106 适用的凝胶浓度% 20~30 15~20 10~15 5~10 2~5 15~20 5~10 2~2.6 常用的所谓标准胶是指浓度为7.5%的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此胶中电泳都能得到满意的结果。当分析一个未知样品时，常常先用7.5%的标准凝胶或用4%~10%的凝胶梯度来试测，选出适宜的凝胶浓度。

3、缓冲系统的选择 在选择缓冲系统时主要从以下两方面来考虑： （1）、pH范围、离子种类和离子强度 对蛋白质来说，选择pH值应能使样品中各种蛋白质分子泳动率的差别最大。酸性蛋白质在高pH条件下，碱性蛋白质在低pH条件下常得到较好的分离效果。如果蛋白质样品经电泳分离后，还希望测定其生物活性，则缓冲系统的pH值不应过大或过小（大于pH9左右或小于pH4），否则会引起蛋白质活性的钝化。目前常用的分离胶缓冲系统有高pH（pH9左右）、低pH（Ph4左右）和中性三大类。此外，通常选用离子强度较低的缓冲溶液（0.01~0.1mol/L）。因为离子强度低，电泳分离过程短，产生的热量也较小,

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分离效果好。

（2）、连续和不连续系统 所谓连续系统是指电泳槽中的缓冲系统和pH值与凝胶中的相同，不连续系统是槽中与凝胶中的缓冲系统的分辨率较高。 4、不连续盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳 不连续盘状电泳往往包含两种以上的缓冲溶液，pH和凝胶孔径。多用于分析浓度较稀的样品。一般是在内径为0.7cm,长10cm的小玻璃管内，把3种性质不完全一样的聚丙烯酰胺凝胶重叠起来。包括①样品胶(其中含有样品)；②浓缩胶(又名成层胶)，这两种胶的缓冲液，pH和孔径大小完全一样，③分离胶(又称电泳胶)，其孔径一般比浓缩胶小，pH值也不同；样品胶和浓缩胶是T=3%,C=20%的单体溶液在Tris-HCI缓冲液中由核黄素催化合成的大孔胶,Ph6.7.而分离胶是由T=7%,C=2.5%的单体溶液在Tris-HCI缓冲液(pH8.9)中通过过硫酸铵催化聚合成的小孔胶。将含有这3种凝胶的玻璃管放在含有Tris-甘氨酸(pH8.3)缓冲液的电泳槽内进行电泳，就是不连续的盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳。它之所以有很高的分辨率是因为有3种效应：即浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。

浓缩效应：样品通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层，甚至有的能浓缩几百倍。为什么样品会在浓缩胶中中被压挤成层呢？这是因为样品胶和浓缩胶是用pH6.7的Tris-HCI缓冲液制成；电泳时,由于HCI解离度大,几乎全部释放出CI离子，而在电泳槽中的Tris-甘氨酸缓冲液是pH8.3,因为甘氨酸的等电点为6.0，在电泳过程中，它只有极少数分子(1%~0.1%)解离成H2N-CH-COO离子。一般酸性蛋白质在此pH值下也解离为带负电荷的离子,但其解离度比HCI小，比甘氨酸大。这3种离子带有同性电荷,在一定的电场作用下，它们的泳动率是不一样的。而且它们的有效泳动率是按下列次序排列的，即:mCLaCL>m蛋a蛋〉m甘a甘。 m为泳动率；a为解离度；ma为有效泳动率。

根据有效泳动率的大小，最大称为快离子(或先行离子，这里是CI离子)，最小的称为慢离子(或随后离子,这里是H2N-CH-COO离子)。电泳开始时3种凝胶中都含有快离子,只有电泳槽中的缓冲液含有慢离子。电泳开始后，由于快离子的泳动率最大,在快离子后面就形成一个离子浓度低的区域，即低电导区。电导与电势梯度是成的比的: E=（I/η）（V/cm）

E为电势梯度；I为电流密度；n为电导率。

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所以低电导区就产生了较高的电势梯度。这种高电势梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。因而在高电势梯度区和低电势梯度区和代电势梯度区之间形成一个迅速移动的界面。由于样品中蛋白质的有效泳动率恰好介于快、快离子之间，所以也就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩成一狭小的样品薄层。 电荷效应：蛋白质混合物在界面处被高度浓缩，堆积成层，形成一狭小的高浓度的蛋白质区带，但由于每种蛋白质分子所带的电荷不同，因而泳动率不同，各种蛋白质就以一定的顺序排列成一个一个的圆盘状蛋白质区带。

分子筛效应：当蛋白质通过浓缩胶进入分离胶时，由于pH和凝胶孔径突然改变（选择分离胶的pH为8.9,电泳时经实际测量为pH9.5）,使甘氨酸的解离度增大,因而它的有效泳动率也增加,此时甘氨酸很快就赶上并超过了蛋白质分子，这样高电势梯度不存在了，使蛋白质样品进入一个均一的电势度和pH条件的分离胶中。分离胶的孔径较小，相对分子质量(Mr)或构型不同的蛋白质通过分离胶，所受摩擦力不同，受阻滞的程度不同，因此表现出不同的泳动率，即所谓的分子筛效应在分离胶中被分开。

聚丙烯酰胺凝胶电泳除具有分子筛作用以外,还具有下面一些优点: (1)聚丙烯酰胺凝胶是人工合成的凝胶，可以通过调节控制单体浓度或单体和交联剂的比例，形成不同程度的交联结构，很容易得到孔径大小，范围广泛的凝胶，所以实验重复性很高。

(2)聚丙烯酰胺形成的凝胶，机械强度好，弹性大，便于电泳后的一切处理。 (3)聚丙烯酰胺凝胶是碳-碳的多聚体，只带有不活泼的酰胺基侧链，没有其他离子基团，因而几乎没有电渗作用。并且不与样品相互作用。

(4)在一定范围内，聚丙烯酰胺对热是稳定的，凝胶无色透明，易于观察，可用检测仪直接测定。

(5)设备简单，所需样品量小(1~100ug),而分辨率高.在超微量分析中,能检出含量在10-9~10-12g的样品。

(6)用途广泛,对生物高分子化合物(如蛋白质、酶、核酸)能进行分离鉴定。又可用于毫克水平的制备。

目前广泛应用于分子生物学、生物化学、细胞学、微生物学、植物学、动物学、免疫学等学科的研究以及临床化验。

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第二部分 学 生 实 验

实验一 氨基酸的分离鉴定——纸层析法

【实验目的】

1.学习氨基酸纸层析法的基本原理 2.掌握氨基酸纸层析的操作技术 【实验原理】

纸层析法（paper chromatography）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。在层析时，将样品点在距滤纸一端约2～3cm的某一处，该点称为原点；然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基酸在两相中不断分配，由于分配系数（Kd）不同，结果它们分布在滤纸的不同位置上。物质被分离后在纸层析图谱上的位置可用比移值（rate of flow, Rf）来表示。所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸停留点（又称为层析点）中心的距离（X）与原点至溶剂前沿的距离（Y）的比值：

在一定条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。 【器材与试剂】 （一）器材

1.层析缸 2.点样毛细管 3.小烧杯

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4.培养皿 5.量筒 6.喷雾器

7.吹风机（或烘箱） 8.层析滤纸（新华一号） 9.直尺及铅笔 (二) 试剂

1. 扩展剂(水饱和的正丁醇和乙酸混合液)

将正丁醇和乙酸以体积比4∶1在分液漏斗中进行混合，所得混合液再按体积比5∶3与蒸馏水混合；充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗内即为扩展剂。 2. 氨基酸溶液

0.5%赖氨酸、脯氨酸、亮氨酸以及它们的混合液（各组份均为0.5%）。 3. 显色剂

0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。

【实验步骤】 （一）准备滤纸

取层析滤纸（长22㎝、宽14㎝）一张，在纸的一端距边缘2～3㎝处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔3㎝作一记号，如右图所示。 （二）点样

用毛细管将各氨基酸样品分别点在这4个位置上，干后重复点样2～3次。每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。 （三）扩展

用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20ml扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1㎝）。待溶剂上升15～20㎝时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。 （四）显色

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用喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后用吹风机吹干或者置烘箱中（100℃）烘烤5min即可显出各层析斑点。 （五）计算

计算各种氨基酸的Rf值。 【要点提示】

1.取滤纸前，要将手洗净，这是因为手上的汗渍会污染滤纸，并尽可能少接触滤纸；如条件许可，也可戴上一次性手套拿滤纸。要将滤纸平放在洁净的纸上，不可放在实验台上，以防止污染。

2.点样点的直径不能大于0.5㎝，否则分离效果不好，并且样品用量大会造成“拖尾巴”现象。

3.在滤纸的一端用点样器点上样品，点样点要高于培养皿中扩展剂液面约1cm。由于各氨基酸在流动相（有机溶剂）和固定相（滤纸吸附的水）的分配系数不同，当扩展剂从滤纸一端向另一端展开时，对样品中各组分进行了连续的抽提，从而使混合物中的各组分分离。 【思考题】

1.纸层析法的原理是什么？

2.何谓Rf值？影响Rf值的主要因素是什么？ 【参考文献】

1. 王秀奇 等．基础生物化学实验(第二版)．高等教育出版社．1999 2. Blocd R.J.A., Manual of paper chromatograhy and paper electrophoresis. 1956

实验二 考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量

【实验目的】

1.掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质的原理与方法 2.熟练分光光度计的使用和操作方法 【实验原理】

考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G250在酸性溶液中呈棕红色，最大吸收峰在465nm；当它与蛋白质通过范德华键结合成复合物时变为蓝色，其最大吸收峰移至595nm，而且消光系数更大。在一定蛋白质浓度范围内（1～1000μg/ml），蛋白质－染料复合物在595nm处的光吸收与

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蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。

蛋白质与考马斯亮蓝G250的结合十分迅速，约2min即可反应完全，其复合物在1h内保持稳定。由于蛋白质－染料复合物具有很高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度（最低检出量为1μg）。由于染色法简单迅速，抗干扰性强，灵敏度高，线性关系好，近年来在某些方面有取代经典的Lowry法的趋势，是一种较好的蛋白质快速微量测定方法。 【器材与试剂】 （一）器材

1.可见光分光光度计 2.刻度移液管 3.移液枪

4.新鲜小麦叶片或绿豆芽下胚轴等 （二）试剂

1. 0.9%生理盐水 2. 考马斯亮蓝试剂

称取考马斯亮蓝G250 100mg，加95％乙醇50ml，溶解后加入85％H3PO4（W/V）100ml，加水稀释至1000ml，保存于棕色瓶中。 3. 蛋白质标准液

准确称取凯氏定量法校正的结晶牛血清蛋白，配制1000μg /ml的标准溶液。

【实验步骤】 （一）标准曲线的制作

取试管6支，按下表进行编号并加入试剂。

试 剂

1

1000μg/ml标准蛋白溶液（ml）

0.9%生理盐水（ml） 蛋白质含量（μg/0.1ml）

26

试管编号

2 0.2 0.8 20

3 0.4 0.6 40

4 0.6 0.4 60

5 0.8 0.2 80

6 1.0 0 100

0 1.0 0

另取试管6支，准确吸取所配各管蛋白质溶液0.1ml，然后加入5.0ml考马斯亮蓝G250试剂，充分振荡混合，放置5min后，于595nm测定光吸收值（以1号试管为空白对照）。以A595为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。

（二）样品提取液中蛋白质含量的测定

准确称取小麦叶片（或绿豆芽下胚轴）约200mg，加入蒸馏水5ml，于研钵中研成匀浆，转移至离心管中，4000rpm离心10min，将上清液倒入10ml容量瓶中，残渣以2.0ml蒸馏水悬浮后，4000rpm再离心10min，合并上清液，定容至刻度。

取3支试管，各吸取上述样品提取液0.1ml，分别加入考马斯亮蓝G250试剂5.0ml，充分振荡混合，放置5min后，以制作标准曲线的1号试管为空白对照，于595nm测定光吸收值。根据所测定的A595值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，取3个重复样品中蛋白含量的平均值。 （三）结果计算

样品蛋白质含量（μg/g鲜重）＝a (μg) × 提取液总体积 (ml) / [测定所取提取液体积（ml）×样品鲜重（g）]

式中 a为从标准曲线上查得的蛋白质含量，单位为μg。 （四）标准比较法（或称标准管法）测定样品提取液中蛋白质的含量

取试管3支，按下表操作。

试管编号

试剂

待测管（U）

样品提取液（ml） 标准蛋白溶液（ml） 0.9%生理盐水（ml） 考马斯亮蓝试剂（ml）

0.1 － － 5.0

放置5min

A595

样品提取液蛋白质含量a（μg）＝（Au/As）×100

样品蛋白质含量（μg/g鲜重）的计算方法同“（三）结果计算”。

调零

标准管（S）

－ 0.1 － 5.0

对照管（B）

－ － 0.1 5.0

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【要点提示】

1.研究表明，NaCl、KCl、MgCl2、(NH4)2SO4、乙醇等物质对测定无影响，而大量的去污剂如Triton X-100、SDS等严重干扰测定，少量的去污剂及Tris、乙酸、2-巯基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA有少量颜色干扰，可很容易地通过用适当的溶液对照而消除。同时注意，比色应在显色2min～1h内完成；如果测定很严格，可以在试剂加入后的5～20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色最稳定。

2.测定那些与标准蛋白质氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料结合量是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。

3.待测液中蛋白质浓度不可太高，应控制在100～800μg/ml为宜。否则，应用生理盐水稀释。 【思考题】

1. Bradford法测定蛋白质含量的原理是什么？应如何克服不利因素对测定的影响？

2．为什么标准蛋白质必须用凯氏定氮法测定纯度？ 【参考文献】

1. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 1976,72: 248～254

2. 李建武 等．生物化学实验原理合方法．北京大学出版社．1994 3. 王宪泽．生物化学实验技术原理和方法.中国农业大学出版社．2002 4. 张龙翔 等．生化实验方法和技术（第二版）.高等教育出版社.1997

实验三 乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白

【实验目的】 1.学习区带电泳的原理

2.掌握乙酸纤维素薄膜电泳操作技术 【实验原理】

带有电荷的颗粒在电场中向其电荷相反方向的电极移动，称为电泳

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（electrophoresis）。带电颗粒在电场中的移动方向和迁移速度取决于颗粒自身所带电荷的性质、电场强度、溶液的pH值等因素。

蛋白质分子是两性电解质，在溶液中可解离的基团除了末端的α-氨基和α-羧基外，还有侧链上的许多基团。由于解离基团的差异，不同的蛋白质具有不同的等电点。当溶液的pH值小于蛋白质的等电点时，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；当溶液的pH值大于蛋白质的等电点时，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。

一个混合的蛋白质样品，由于各蛋白质的等电点不同，在同一pH值溶液中其带电性质、电荷的数目各不同，再加上它们的分子颗粒大小、形状不一，因此在电场中各种蛋白质泳动的方向和速度也不同，从而使蛋白质混合样品得以分离。

目前应用最广泛的电泳方法是区带电泳。乙酸纤维素薄膜电泳是以乙酸纤维素薄膜为支持物的一种区带电泳。乙酸纤维素（二乙基纤维素）薄膜具有均一的泡沫状结构（厚约120μm），渗透性强，对分子移动无阻力，用它作为区带电泳的支持物，具有样品用量少、图谱清晰、电泳时间短（约45～60min）、灵敏度高（5μg/ml蛋白质即可检出）、可准确定量等优点，在各种生物分子的分离、临床检验及免疫电泳等方面已得到广泛使用。

人血清中含有数种蛋白质，其等电点（pI）大都在8.6以下，将样品点在薄膜上，在pH8.6的缓冲液中电泳，因为各蛋白质都带有负电荷，在电场中都向正极移动。电泳后，用氨基黑10B溶液染色，经脱色液处理除去背景染料，可得到背景无色的各蛋白质电泳图谱。由正极到负极依次为：白蛋白、α1-球蛋白、 α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白。各蛋白含量可用光密度计直接测定，或用洗脱法进行比色测定。 【器材与试剂】 （一）器材

1.电泳仪 2.电泳槽

3.微量注射器或微量吸管 4.载玻片（厚约1mm） 5.滤纸

29

6.竹镊子

7.可见光分光光度计或光密度计 8. 乙酸纤维素薄膜

9.人血清 （新鲜无溶血现象） （二）试剂

1.巴比妥-巴比妥钠缓冲液（pH8.6，离子强度0.075）

取巴比妥2.76g和巴比妥钠15.4g，溶于蒸馏水中，稀释定容至1000ml。 2.染色液

取氨基黑10B 0.5g，加蒸馏水40ml，甲醇50ml和冰乙酸50ml，混匀，可重复使用。 3.漂洗液

乙醇45ml，冰乙酸5ml，蒸馏水50ml混匀。 4.透明液

无水乙醇70ml，冰乙酸30ml混匀 5.浸出液

0.4mol/L的NaOH溶液

【实验步骤】 （一）薄膜的处理

1.将乙酸纤维素薄膜切成8×2cm条状（或根据需要决定薄膜的大小）。 2.把薄膜浸入pH8.6的巴比妥-巴比妥钠缓冲液中，浸泡约30min。 3.待薄膜完全浸透后，用竹镊子轻轻取出，将薄膜的无光泽面向上，平铺在滤纸上，其上再放一张干净的滤纸，轻压，吸去多余的缓冲液。 （二）点样

1.用微量注射器吸取2～3μl血清，均匀地涂在载玻片一端的截面处（玻片的宽度应小于薄膜），然后轻轻与距薄膜一端1.5cm处相接触，样品则呈直线条状被涂于薄膜上，待血清渗入膜内后，移去载玻片（见下图）。

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乙酸纤维素薄膜点样图

2.将薄膜平贴在电泳槽支架上的滤纸上，注意点样的一面朝下，薄膜中间不可出现凹面，点样端应置于阴极端（见下图）。

乙酸纤维素薄膜电泳装置图

（三）电泳

将电压调至90～110V，电流0.4～0.6mA/cm，待跑的最快的蛋白质样品（白蛋白，可观察到）距点样处4.5～5cm时，关闭电源。一般通电时间约60min。 （四）染色和漂洗

将薄膜浸于氨基黑10B染色液中染色5～10min，取出后用漂洗液漂洗4～5次，每次约5min，待背景无色为止，再浸入蒸馏水中。 （五）透明

漂洗后的薄膜用电吹风吹干，浸入透明液中约20min，取出平贴于干净的玻璃板上，自然干燥，即得到背景透明的电泳图谱（见下图），可长期保存。

乙酸纤维素薄膜血清蛋白电泳图谱

从左至右依次为：血清白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白

【要点提示】

1.有些型号的电泳槽两极之间的有机玻璃平面上在电泳时会形成一层细小

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的水珠，使电流强度加大，影响电泳效果。

2. 乙酸纤维素薄膜一定要完全浸透，如有任何斑点、污染或划痕，均不能使用。

3. 浸泡后的乙酸纤维素薄膜取出后用滤纸吸去其表面的缓冲液即可，不可吸得过干。

3. 使用血清点样器直接在薄膜上进行血清点样，同样可以获得很好的结果。 4. 搭在正负两极滤纸桥上的薄膜不能有点接触，应完全和桥接触。多个膜条进行电泳时，相邻膜条之间应留有至少1mm的间隙，不能相互接触。

5. 电泳时间的长短，应以血清各组分最佳分离效果为标准，一般是在以移动最快的血清白蛋白距正极端约1cm处停止电泳。

6. 电泳过程中可产生大量的热，一般在炎热的夏天应使用水冷却装置以降温，否则会对电泳图谱造成一定的影响。

7. 如要对血清各蛋白进行定量测定，可采取下列方法： （1）洗脱法

取试管5支，标号，分别加入0.4mol/L的NaOH溶液4.0ml。将实验步骤（四）中漂洗干净的薄膜用滤纸吸干，剪下各种蛋白质色带，分别放入各试管中，震荡约10min。待色泽完全浸出后，以0.4mol/L 的NaOH溶液为对照，于620nm处进行比色，测得各管的光吸收值（A620），分别记为：A白、Aα1、Aα2、Aβ、Aγ。各种血清蛋白的相对百分含量为：

蛋白质含量（%） =个别蛋白质的A620值∕所有蛋白质A620值总和 ×100% （2）光密度法

将步骤（五）中透明处理的薄膜用光密度计直接测定。 8.人血清各蛋白质相对含量的正常值为：

白蛋白 54.0～73.0% α1-球蛋白 2.8～5.1% α2-球蛋白 6.3～10.6% β-球蛋白 5.2～11.0% γ-球蛋白 12.5～20.0% 【思考题】

1.为什么将薄膜的点样端放在滤纸桥的负极端？

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2.用乙酸纤维素薄膜作为电泳支持物有何优点？ 【参考文献】

1. 北京大学生物化学教研室．生物化学实验指导．高等教育出版社．1979 2. 朱俭 等．生物化学实验．上海科技出版社．1981 3. 陈曾燮 等．生物化学实验．中国科技大学出版社．1994

实验四 酶的特异性

【实验目的】

1.了解酶的特异性

2.掌握检查酶特异性的方法及原理 【实验原理】

酶是生物体内一类具有催化功能的蛋白质（传统酶的概念），即生物催化剂。它与一般催化剂的最主要区别就是具有高度的特异性（专一性）。所谓特异性是指酶对所作用的底物有严格的选择性，即一种酶只能对一种化合物或一类化合物（其结构中具有相同的化学键）起一定的催化作用，而不能对别的物质起催化作用。酶的特异性是酶的特征之一，但各种酶所表现的特异性在程度上有很大差别，又可分为结构特异性和立体异构特异性。

淀粉和蔗糖都是非还原性糖，分别为唾液淀粉酶和蔗糖酶的专一底物。唾液淀粉酶可水解淀粉生成具有还原性的麦芽糖，但不能水解蔗糖；蔗糖酶可水解蔗糖生成具有还原性的葡萄糖和果糖，但不能水解淀粉。

Benedict试剂是含硫酸铜和柠檬酸钠的碳酸钠溶液，可以将还原糖氧化成相应的化合物，同时 Cu2+被还原成Cu+，即蓝色硫酸铜溶液被还原产生砖红色的氧化亚铜沉淀。因此，可用Benedict试剂检查两种酶水解各自的底物所生成产物的还原性，来加深对酶特异性的理解。 【器材及试剂】 （一）器材

1. 恒温水浴锅 2. 试管及试管架 3. 滤斗 4. 吸量管

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5. 量筒 5. 烧杯 6. 离心机 （二）试剂 1. 2%蔗糖

2. 1%淀粉 （内含0.3%的NaCl） 3. 唾液淀粉酶溶液

先用蒸馏水漱口，然后用洁净试管1支，取唾液（无泡沫）约2ml，蒸馏水20倍稀释，备用。 4. 蔗糖酶溶液

取活性干酵母1.0g，置于研钵中，加少量蒸馏水及石英砂研磨提取约10min，再加蒸馏水至总体积约为20ml，过滤或离心，取滤液或上清液备用。 5. Benedict试剂

将无水CuSO4 17.4g溶于100℃热水中，冷后稀释至150ml。另取柠檬酸钠173g及无水Na2CO3 100g放入600ml水中，加热溶解，溶液如有浑浊，过滤，冷后稀释至850ml。最后将CuSO4溶液倾入柠檬酸- Na2CO3溶液中，混匀（此溶液可长期保存）。 【实验步骤】 （一）淀粉酶的特异性

取试管5支，标号，按下表所列的次序操作：

试管编号

试剂

1%淀粉溶液（ml） 2%蔗糖溶液（ml） 唾液淀粉酶（ml） 蒸馏水（ml）

1

1.0 — — 1.0

2

— 1.0 — 1.0

3

1.0 — 1.0 —

4

— 1.0 1.0 —

5

— — 1.0 1.0

各管加完试剂后，放37℃恒温水浴保温10min，然后每管加入Benedict

34

试剂2ml，再放沸水浴5min。

观察各管颜色变化，并解释实验结果。 （二）蔗糖酶的特异性

取试管5支，标号，按下表所列的次序操作：

试管编号

试剂

1%淀粉溶液（ml） 2%蔗糖溶液（ml） 蔗糖酶（ml） 蒸馏水（ml）

1

1.0 — — 1.0

2

— 1.0 — 1.0

3

1.0 — 1.0 —

4

— 1.0 1.0 —

5

— — 1.0 1.0

各管加完试剂后，放37℃恒温水浴保温10min，然后每管加入Benedict试剂2ml，再放沸水浴5min。

观察各管颜色变化，并解释实验结果。 【要点提示】

1.蔗糖是典型的非还原糖，若商品中还原糖的含量超过一定的标准，则呈现还原性，这种蔗糖不能使用。一般在实验前要对所用的蔗糖进行检查，至少要用分析纯试剂。

2.由于不同的人或同一个人不同时间采集的唾液内淀粉酶的活性并不相同，有时差别很大，所以唾液的稀释倍数可根据各人的唾液淀粉酶的活性进行调整，一般为20～200倍。

3.制备的蔗糖酶液一般情况下含有少量的还原糖杂质，所以可出现轻度的阳性反应。另外，不纯净的淀粉及加热过程中淀粉的部分降解，也可出现轻度的阳性反应。

4.除了含有淀粉酶外，唾液中还含有少量的麦芽糖酶，可使麦芽糖水解为葡萄糖。 【思考题】

1.什么是酶的特异性？本实验如何验证了酶的特异性？

2.若将淀粉酶和蔗糖酶煮沸1min，其实验结果会发生什么样的变化？ 【参考文献】

1.北京大学生物系生物化学教研室．生物化学实验指导．人民教育出版社 . 1979

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2.王秀奇 等．基础生物化学实验（第二版）．高等教育出版社．1999

实验五 酶促反应动力学

—— pH、温度、激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响

一 pH值对酶活力的影响

【实验目的】

1.了解pH值对酶活力的影响 2.学习测定酶最适pH值的方法 【实验原理】

对环境酸碱度敏感是酶的特点之一。对每一种酶来说，只能在一定pH值范围内才表现其活力，否则酶即失活。另外，在这个有限pH值范围内，酶的活力也随着环境pH值的改变而有所不同。酶通常在某一pH值时，才表现最大活力。酶表现最大活力时的pH值称为酶的最适pH值。一般酶的最适pH值在4～8之间。 淀粉遇碘呈蓝色。糊精按其分子大小，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色。最简单的糊精和麦芽糖遇碘不呈色。在不同条件下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。

本实验观察pH值对唾液淀粉酶活力的影响，唾液淀粉酶的最适pH值约为6.8。 【器材与试剂】 （一）器材

1.恒温水浴锅 2.试管 3.试管架

4.锥形瓶（50 ml或100ml） 5.吸量管（1、2、5、10ml） 6.秒表 7.白瓷板 8.pH试纸

9.稀释200倍的新鲜唾液

在漏斗内塞入少量脱脂棉，下接洁净试管。漱口后收集过滤唾液。取滤液

最适pH值 pH 反应速度v 36

0.5m1放入锥形瓶内，加蒸馏水稀释至100m1，充分混匀。 （二）试剂

1.新配制的溶于0.3％NaCl的0.5％淀粉溶液

称取可溶性淀粉0.5g，先用少量0.3％NaCl溶液加热调成糊状，再用热的0.3％NaCl溶液稀释至100ml。

2. 0.2mol／L Na2HPO4溶液

称取Na2HPO4·7H2O 53.65g(或Na2HPO4·12H20 71.7g)，溶于少量蒸馏水中，移入1000ml容量瓶，加蒸馏水稀释到刻度。 。

3. 0.1mol／L柠檬酸溶液

称取含一个水分子的柠檬酸21.01g，溶于少量蒸馏水中，移入1000m1容量瓶，加蒸馏水至刻度。

4.KI－碘溶液:将KI 20g及I2 10g溶于100ml水中。使用前稀释10倍。 【实验步骤】 （一）

取50ml锥形瓶5个，编号。按下表中的比例，用吸量管准确添加

0.2mol/L Na2HPO4溶液和0.1mol/L柠檬酸溶液，制备pH5.0～8.0的5种缓冲溶液。

试剂

锥形瓶号

0.2mol/L Na2HPO4（ml） 0.1mol/L柠檬酸（ml）

1 2 3 4 5

5.15 6.31 7.72 9.36 9.72

4.85 3.69 2.28 0.64 0.28

缓冲液pH 5.0 6.0 6.8 7.6 8.0

（二）取干燥试管6支，编号。将5个锥形瓶中不同pH值的缓冲液各取3ml，分别加入相应号码的试管中。然后，再向每个试管中添加0.5％淀粉溶液2ml。第6号试管与第3号试管的内容物相同

（三）向第6号试管中加入稀释200倍的唾液2ml，摇匀后放入37℃恒温水浴锅

37

中保温。每隔1min由第6号试管中取出一滴混合液，置于白瓷盘上，加1滴KI－碘溶液，检验淀粉的水解程度。待结果呈橙黄色时，取出试管，记录保温时间。 （四）以1min的间隔，依次向第1至第5号试管中加入稀释200倍的唾液2ml，摇匀，并以1min的间隔依次将5支试管放入37℃恒温水浴锅中保温。然后，按照第6号试管的保温时间，依次将各管迅速取出，并立即加入KI－碘溶液2滴，充分摇匀。观察各管呈现的颜色，判断在不同pH值下淀粉被水解的程度，可以看出pH对唾液淀粉酶活力的影响，并确定其最适pH。 【要点提示】

1.掌握第6号试管的水解程度是本实验成败的关键之一。 2.淀粉溶液需新鲜配制，并注意配制方法。

3.严格控制温度。在保温期间，水浴温度不能波动，否则影响结果。 4.严格控制反应时间，保证每管的反应时间相同。

二 温度对酶活力的影响

【实验目的】

了解温度对酶活力的影响 【实验原理】

酶的催化作用受温度的影响很大，与一般化学反应一样，提高温度可以增加酶促反应的速

度。另一方面，大多数酶是蛋白质，温度过高可引起蛋白质变性，导致酶的失活。因此，反应速度达到最大值以后，随着温度的升高，反应速度反而逐渐下降，以至完全停止反应。反应速度达到最大值时的温度称为酶的最适温度。大多数动物酶的最适温度为37～40℃，大多数植物酶的最适温度为50～60℃。

最适温度不是酶的特征性物理常数。酶对温度的稳定性与其存在形式有关。低温能降低或抑制酶的活力，但不使酶失活。

淀粉与各级糊精遇碘呈现不同的颜色。最简单的糊精和麦芽糖遇碘不呈色。在不同温度下，唾液淀粉酶对淀粉水解活力的高低可通过水解混合物遇碘呈现颜色的不同来判断。 【器材与试剂】

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反应速度v 温度t℃ 酶的最适温度 （一）器材

1.试管 2.试管架 3.恒温水浴锅 4.冰箱 5.漏斗 6.量筒

7.稀释200倍的新鲜唾液 （二）试剂

1.新配制的溶于0.3％NaCl的0.5％淀粉溶液

称取可溶性淀粉0.5g，先用少量0.3％NaCl溶液加热调成糊状，再用热的0.3％NaCl溶液稀释至100ml。

2.KI－碘溶液：将KI 20g及I2 10g溶于100ml水中。使用前稀释10倍。 【实验步骤】

（一）取试管3支，编号后按下表加入试剂：

试剂 淀粉溶液(ml) 稀释唾液(ml) 煮沸过的稀释唾液(ml)

(二)摇匀后，将1、3号试管放入37℃恒温水浴中，2号试管放入冰水中。10min后取出（将2号管内液体分为两半），用KI－碘溶液来检验1、2、3号管内淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。记录并解释结果。将2号管剩下的一半溶液放入37℃水浴中继续保温10min，再用KI－碘溶液检验，结果如何？ 【要点提示】

1.唾液的稀释倍数应根据各人唾液淀粉酶活力进行调整。 2.严格控制恒温水浴锅的温度。

试管编号

1 1.5 1.0 -

2 1.5 1.0 -

3 1.5 - 1.0

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三 激活剂和抑制剂对酶活力的影响

【实验目的】

了解激活剂、抑制剂对酶活力的影响 【实验原理】

酶的活力常受某些物质的影响，有些物质能增加酶的活力，称为酶的激活剂；有些物质则会降低酶的活力，称为酶的抑制剂。例如Cl-为唾液淀粉酶的激活剂，Cu2+ 则为该酶的抑制剂。

本实验以NaCl和CuSO4对唾液淀粉酶活力的影响，观察酶的激活和抑制，并用NaSO4 作对照。

将淀粉与酶液相混，作用一定时间后，淀粉被水解，遇碘不产生蓝色。酶活力强，需时短；酶的活力弱，需时长，故可用时间长短表示酶的活力强弱。 【器材与试剂】 （一）器材

1.恒温水浴锅 2.白瓷板 3.试管 4.试管架 5滴管 6.吸量管

7.稀释20倍的新鲜唾液 （二）试剂

1.0.1％淀粉液

称取可溶性淀粉0.1g，先用少量水加热调成糊状，再加热水稀释至100ml。 2.1％NaCl溶液 3.1％CuSO4溶液 4.1％NaSO4溶液 5.稀碘液

于2％KI溶液中加入碘至淡黄色。 【实验步骤】

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（一） 取试管4支，按下表编号加入相应试剂：

试剂

试管编号 0.1％淀粉

(ml)

1 2 3 4

2 2 2 2

1％NaCl (ml) 1 － － －

1%CuSO4 (ml) － 1 － －

1％Na2SO4

(ml) － － 1 －

H2O (ml) － － － 1

1:20唾液 (ml)

1 1 1 1

（二）加毕，摇匀，同时置37℃水浴中保温，每隔2min取液体1滴置白瓷板上用碘液试之，观察哪支试管内液体最先不呈现蓝色，哪一管次之，说明原因。 【要点提示】

1.每管中加入的底物应是不含NaCl的1％淀粉溶液。

2.从各管取反应液时，应依次从第一管开始，每次取液前应将滴管用蒸馏水洗净。 【思考题】

1.在pH值对酶活力的影响实验中需要准确地控制酶与底物的作用时间和温度，你准备用怎样的手段来进行控制？ 2.酶的作用为什么会有最适温度？

3.在激活剂和抑制剂对酶活力影响的实验中NaCl和CuSO4各起什么作用？ 【参考文献】

1.袁玉荪 等.生物化学实验. 高等教育出版社.1985

2.北大生化教研室.生物化学实验指导.高等教育出版社.1984 3.王秀奇 等.基础生物化学实验(第二版).高等教育出版社.1999

实验六 酵母RNA的分离及组分鉴定

【实验目的】

1．学习稀碱法提取RNA的原理和操作方法 2. 掌握RNA组分的鉴定方法 【实验原理】

酵母中含有丰富的RNA(可达酵母干重的2.62％～10％)，是工业上大规模制

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备核酸和核苷酸的原料。稀碱法是工业上常用的RNA提取方法，是用稀碱溶液使细胞裂解，使RNA释放到碱液中,然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA；或用酸调整pH至2.5，利用等电点沉淀RNA。

RNA用H2SO4水解时，可以生成磷酸、戊糖和碱基，各种成分以下列反应鉴定：①磷酸：用强酸使RNA中的有机磷消化成无机磷，后者与定磷试剂中的钼酸铵结合成磷钼酸铵（黄色沉淀），当有还原剂存在时磷钼酸铵立即转变成蓝色的还原产物—钼蓝。②核糖：RNA与浓盐酸共热时，发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与苔黑酚反应，在Fe3+或Cu2+催化下生成鲜绿色复合物。③嘌呤碱与AgNO3能产生白色的嘌呤银化合物沉淀。 【器材与试剂、】 (一) 器材 1. 150ml锥形瓶 2. 沸水浴 3. 量筒 4. 移液管 5. 吸管及滴管

6. 布氏漏斗和抽滤装置 7. 试管、试管夹及试管架 8. 离心机 9. 滤纸 10. pH试纸 11. 烧杯 12. 天平 13. 酵母粉 (二) 试剂

1. 0.2% NaOH溶液 2. 95％乙醇 3. 冰乙酸 4. 无水乙醚 5. 1.5mol/L H2SO4

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6. 浓氨水 7. 5％AgNO3溶液 8. 苔黑酚乙醇溶液

称取苔黑酚6g，溶解于95％乙醇100ml (冰箱中可保存1个月)。 9. FeCl3的浓盐酸溶液

取10％FeCl3 2ml，与浓盐酸400ml混合。 10. 定磷试剂

（1）17％H2SO4溶液 （2）2.5％钼酸铵溶液

（3）10％抗坏血酸溶液(贮存于棕色瓶中，溶液在冰箱放置可用1个月。溶

液呈淡黄色时可用，如呈深黄色或棕色则已失效。)

临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合(限当天使用)： 17%H2SO4:2.5％钼酸铵:水:10％抗坏血酸=1:1:2:1（V:V） 【实验步骤】 （一） RNA的粗提取

1. 取酵母粉7g，置于150ml锥形瓶中，加入0.2％NaOH溶液70ml，搅拌成悬

浮液。

2. 将悬浮液在沸水浴中加热30min，冷却至室温，3000rpm离心15min。 3. 将上清液缓缓倾入95%乙醇30ml中，注意边搅拌边缓缓倾入,用冰乙酸调

pH值至2.5。静置，待RNA沉淀完全后，3000rpm离心3min。

4. 弃上清，以95％乙醇20ml洗涤沉淀，3000rpm离心3min。再用95％乙醇

20ml洗涤沉淀，并移入布氏漏斗中抽滤。

5. 用无水乙醚洗涤沉淀2次，每次20ml，于布氏漏斗中抽滤至沉淀干燥。 (二) 水解RNA

将提取的RNA加入10ml 1.5mol/L H2SO4中，沸水浴加热10min,使RNA水解。 (三) RNA组分鉴定

1. 嘌呤碱：取试管1支，加入水解液1ml，浓氨水2ml，5％的AgNO3 1ml，观

察是否产生白色絮状嘌呤银化物沉淀（放置后可能变为棕黑色）。 2. 戊糖：取试管1支，加入水解液1ml，FeCI3的浓盐酸溶液2ml和苔黑酚乙

醇溶液5滴，在沸水浴中加热，观察试管中颜色变化。

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3. 磷酸：取试管1支，加入水解液1ml和定磷试剂1ml，在沸水浴中加热，

观察试管中颜色变化。 【要点提示】

1.苔黑酚(又名地衣酚,3,5-甲苯二酚) 鉴定戊糖时特异性较差，凡属戊糖均有此反应。微量DNA无影响，较多DNA存在时有干扰作用，在试剂中加入适量CUCl2·2H2O可减少DNA的干扰，甚至某些戊糖持续加热后生成的羟甲基糠醛也能与地衣酚反应，产生显色复合物。 2. 苔黑酚鉴定戊糖时也可用下列配方：

(1)苔黑酚试剂：FeCI3 0.1g溶于浓盐酸100ml，摇匀，贮存备用。使用前加入苔黑酚0.476g。

(2)苔黑酚试剂：苔黑酚0.1g溶于浓盐酸100ml中，再加FeCI3 0.1g（临用前配制）。

3．RNA中磷酸的鉴定方法有两种，原理如下： （1）钼酸铵试剂鉴定：

钼酸铵试剂：钼酸铵2g溶解于10％的硫酸100ml。

强酸使RNA分子中的有机磷消化成无机磷，使与钼酸铵试剂中的钼酸铵结合成磷钼酸铵（NH4）3PO4·12MoO3（黄色沉淀）。

PO43-+3NH4++12MOO42-+24H+=(NH4)3 PO4·12MOO3·6H2O↓+6H2O

(2)定磷试剂鉴定：上述反应当有还原剂存在时，MO6+被还原成MO4+，此Mo4+再与试剂中的其它MO42-结合成MO（MOO4）2或MO3O8,呈蓝色，称为钼蓝。在一定浓度范围内，蓝色的深浅和磷含量成正比，因此也可用分光光度法定量测定RNA。 4.用乙醇沉淀RNA时，需用酸中和稀碱，可以加冰乙酸至pH2.5，也可以直接用酸性乙醇（浓盐酸1ml加入乙醇100ml中）至溶液pH至2.5。

5.用AgNO3鉴定RNA中的嘌呤碱时，除了产生嘌呤银化物沉淀外，还会产生磷酸银沉淀，磷酸银沉淀可溶于氨水，而嘌呤银化物沉淀在浓氨水中溶解度很低，加入浓氨水可消除PO43+的干扰。 【思考题】

1.用苔黑酚鉴定RNA时加入Cu2+或Fe3+的目的是什么？ 2.用AgNO3鉴定嘌呤碱基时加入浓氨水的目的是什么？ 【参考文献】

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1．李建武．生物化学实验原理和方法．北京大学出版社．1994

2．北京大学生物系生物化学教研室．生物化学实验指导．高等教育出版社．1986 3.王秀奇 ．基础生物化学实验（第二版）．高等教育出版社．2001 4.袁玉荪 ．生物化学实验（第二版）．高等教育出版社．1990

实验七 小麦萌发前后淀粉酶活性的比较

【实验目的】

1.学习用分光光度法测定淀粉酶活力的原理与方法 2.了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化 【实验原理】

淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称。按照其水解淀粉的作用方式，可以分成α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化淀粉酶、异淀粉酶等。实验证明，在小麦、大麦、黑麦的休眠种子中只含有β-淀粉酶，α-淀粉酶是在发芽过程中形成的，所以在禾谷类萌发的种子和幼苗中，这两类淀粉酶都存在。其活性随萌发时间的延长而增高。

本实验以淀粉酶催化淀粉生成麦芽糖的速度来测定酶的活力。麦芽糖是还原性糖，能使3，5-二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基5-硝基水杨酸，后者在500nm处有最大光吸收，可用分光光度法定量测定。

OH

还原

COOH COOH

OH

O2N

【器材与试剂】 （一）器材

1. 25ml刻度试管 2.试管架和试管夹

NO2

O2N NH2

3,5-二硝基水杨酸 3-氨基5-硝基水杨酸（棕色）

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3.移液管 4.研钵 5.离心管 6.量筒

7.可见光分光光度计 8.离心机 9.恒温水浴 10.沸水浴 11.小麦种子 （二）试剂

1.标准麦芽糖溶液（1mg/ml）

精确称量麦芽糖100mg，用少量蒸馏水溶解后，移入100ml容量瓶中，定容至刻度。

2. 0.02mol/L磷酸缓冲液（pH6.9）

取0.2mol/L KH2PO4 67.5ml与0.2mol/L K2HPO4 82.5ml混合，定容至1000ml。 3. 0.2％淀粉溶液

取淀粉0.2g溶于0.02mol/L磷酸缓冲液中，用缓冲液定容至100ml。 4. 3，5-二硝基水杨酸溶液

取3，5-二硝基水杨酸1g，溶于20ml 2mol/L NaOH溶液和20ml水中；另取酒石酸钾钠30g，溶于30ml水中，溶解后与上液混匀（此时溶液会出现粘稠），继续搅拌，至完全溶解，定容至100ml，过滤备用。 5. 1％NaCl溶液 6. 石英砂 【实验步骤】 (一)标准曲线制作

取干净刻度试管7支，编号，按下表加入试剂

试管编号

试剂

1

麦芽糖标准液（ml）

0

2 0.2

3 0.6

4 1.0

5 1.4

6 1.8

7 2.0

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蒸馏水（ml） 2.0 1.8 2.0

1.4 2.0

1.0 2.0

0.6 2.0

0.2 2.0

0 2.0

3，5-二硝基水杨酸（ml） 2.0

摇匀后，置沸水浴中煮沸5min。取出后迅速冷至室温，加蒸馏水定容至25ml，测定各管的A500，以麦芽糖含量为横坐标，A500值为纵坐标，绘制标准曲线。 （二）酶液的制备 1.小麦种子萌发

小麦种子浸泡24h后，放入25℃恒温箱内或在室温下发芽。 2.酶液的提取

（1）幼苗酶的提取：取萌发的幼苗10株，放入研钵内，加石英砂0.2g，加1％NaCl溶液10ml，用力研磨成匀浆，在0～4℃下放置20min。将提取液移入离心管中， 2000rpm离心10min。将上清液倒入量筒中，测定酶提取液的总体积。取酶液1ml用pH6.9的0.02mol/L磷酸缓冲液稀释10倍，进行酶活力测定。 （2）种子酶的提取：取干燥种子10粒作对照，操作方法同上。 (三)酶活力测定

1.取25ml刻度试管3支，编号，按下表加入试剂（淀粉加入后预热5min）

试管编号

试剂

1

(种子酶稀释液)

0.2％淀粉溶液（ml） 标准麦芽糖溶液(ml) 蒸馏水（ml） 酶液（ml）

1 － － 0.5

2

(幼苗酶稀释液)

1 － － 0.5

3 (空白管)

1 － 0.5 －

各管混匀后在45℃恒温水浴中水解3min，立即向各管中加入1％3，5-二硝基水杨酸溶液2ml。

2.混匀后，放入沸水浴中准确加热5min，迅速冷至室温，加水稀释至25ml,将各管充分混匀。用空白管作为对照，测定各管的A500值。 3.计算酶活力单位：

（1） 在标准曲线上查出各管相应的麦芽糖含量。

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（2）设在45℃、pH6.9的条件下，3min内水解淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶量为1个活力单位（U）,

则10粒种子或10株幼苗的总酶活力单位=C酶×n×V酶 式中

C酶 为种子酶或幼苗酶分解淀粉产生的麦芽糖的浓度(mg/ml) n 为酶液稀释的倍数

V酶 为提取酶液的总体积（ml） 【要点提示】

1.小麦种子萌发前需充分浸泡24h，然后均匀地放在铺有滤纸的培养皿或解剖盘中，开始2～3d内需保证水分供应充足，根系发达后浇水不可过多。 2.萌发情况不同，酶活力也不同：刚萌发出胚根的小麦，酶活力增加迅速，之后随发芽天数增加继续增加，但幅度减慢，同一天发芽的幼苗高株比矮株的酶活力略高。

3.酶提取温度应控制在0～4℃,因为低温条件下易保持酶的活力。

4.几乎所有植物中都有淀粉酶，特别是萌发后的禾谷类种子淀粉酶活性最强，主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化,而β-淀粉酶不耐热，在70℃处理15min则钝化，所以在反应时要保证适宜的pH和温度。根据这一特性，还可在测定时钝化其中一种酶测出另外一种酶的活力。

鉴定酶活力也可以将酶与淀粉的混合液于37℃恒温水浴中保温后滴入2～3滴KI-碘溶液，混匀，观察颜色的变化。

5.酶液中麦芽糖含量测定也可不用标准曲线法，而采用标准比较法。 【思考题】

1.为什么提取酶的过程应在0～4℃下进行？测定淀粉酶活性时为什么要在45℃条件下水解淀粉？

2.小麦萌发过程中淀粉酶活性升高的原因和意义是什么？ 【参考文献】

1.王秀奇 ．基础生物化学实验（第2版）．高等教育出版社．2001

2.北京大学生物系生物化学教研室．生物化学实验指导．高等教育出版社．1986 3．张子健 ．生物化学实验．华东师范大学出版社．1995

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实验八 凝胶层析法测定蛋白质分子量

【实验目的】

1．学习凝胶层析的基本原理

2．掌握层析柱的装填技术 【实验原理】

凝胶层析，又称分子筛层析、排阻层析或凝胶过滤，是以凝胶为载体将物质按分子量大小进行分离的一种方法。常用的凝胶主要有琼脂糖凝胶(Sepharose)、葡聚糖凝胶(Sephadex)和聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Gel P) 。

凝胶是一类多孔介质,其内部是一些很细微的网状结构（图1）。在凝胶层析的过程中，分子量大于排阻上限（即水合直径大于凝胶颗粒的网孔）的物质不能进入凝胶颗粒的网孔，被排斥在凝胶颗粒之外（如蓝色葡聚糖2000、铁蛋白等），洗脱时，此类物质将沿凝胶颗粒间隙下移，最先流出层析柱；而分子量小的的蛋白质可扩散进入凝胶颗粒的网孔内部，蛋白质的分子量越小，越易运动到凝胶颗粒的网孔深处，在凝胶颗粒的网孔内滞留的时间越较长，结果是分子量小的蛋白质洗脱速度较慢，即洗脱体积较大。不同分子量蛋白质的洗脱体积也不相同，通过部分收集器可以将它们收集在不同的洗脱组份中。本实验使用的是葡聚糖凝胶SephadexG-75或SephadexG-100为柱层析介质，有关Sephadex的性质可以参见实验二)。

图1 凝胶颗粒的内部结构

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/jsgr.html