光学显微镜的原理及构造

光学显微镜的原理及构造

显微镜是人类认识物质微观世界的重要工具，是现代科学研究工作不可缺少的仪器之一。显微镜自1666年问世以来已有300多年的历史了，其间随着科学技术不断发展，显微镜的品种不断增加，结构和性能逐步得到完善和提高。 根据不同的使用用途，光学显微镜可分为普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜、倒置显微镜、体视显微镜、偏光显微镜等10多种。目前，世界上许多国家都可以生产光学显微镜，牌名、种类繁杂，其中德国、日本等国制造的显微镜品质、数量占优势，但价格昂贵。 对于现代的光学显微镜，包括各种简单的常规检验用显微镜、万能研究以及万能照相显微镜等，首先要认识其构造及各部件的功能，同时要掌握正确的调试、使用和保养方法，才能在实际应用中面对各种要求时以不同的显微镜检方法，充分发挥显微镜应有的功能，提高常规检验工作效率. 光学显微镜的原理和构造

随着科学技术的发展，显微镜检方法由最传统的明视野、暗视野发展出了相差法、偏光方法；荧光方法也由透射光激发进展为落射光激发，使荧光效率大为提高；微分干涉相衬方法基于偏光方法，而巧妙地利用了微分干涉棱镜，使之能应用于医学与生物学的样品，又能应用于金相样品的分析与检验。

下面以德国ZEISS公司生产的Axioplan万能研究用显微镜，简单介绍万能显微镜的基本组成部件。

1. 显微镜主机体（stand） 显微镜的主机体设计成金字塔形，而底座的截面呈T字形，使显微镜的整体相当稳固。显微镜的光学部件和机构调节部件、光源的灯室、显微照相装置、电源变压稳压器等，都可安装在主机体上或主机体内。

2. 显微镜的底座（base） 底座和主机体通常组成一个稳固的整体。底座内通常装有透射光照明光路系统（聚光、集光和反光）部件，光源的滤光片组，粗/微调焦机构，光源的视场光阑也安装在底座上。

3. 透射光光源（tranilluminator） 透射光光源由灯室（lamp housing）、灯座（lamp socket）、卤素灯（halogen lamp）、集光与聚光系统（lamp collector and lamp condenser）及其调整装置组成。

4. 透射光光源与反射光光源的转换开关（toggle switch） 这是新一代AXIO系列显微镜特有的装置，透射光和反射光可通用。当具有透/反两用的配置时，利用这一转换开关能方便而又迅速的使透射光 和反射光互相转换。在纯透射光的配置中，这一开关就改为电源开关。

5. 电源开关（mains switch）与亮度调节旋钮（brightness control） 电源开关用来接通或切断显微镜所需用的交流电源。电源开关旋钮也可调节照明光源的亮度，使所观察的视域可随时获得适当的亮度，可调范围 为3-12V。作显微照相时，可根据曝光以及彩色底片色温的要求来调节灯光的亮度。当准备关掉电源之前，应先将亮度调节旋钮调到最小。

6. 粗、微调焦旋钮（coaxial coarse/fine focusing controls） 调焦旋钮转动时带动燕尾导板上下移动，而导板上则装有物台托架和聚光镜托架，从而使物台趋向或远离物镜达到调焦的效果。

7. 透射光用的滤光片选择按钮（push buttons for filter magazine） 透射光显微镜检方法所需用的一组滤光片已安装在显微镜的底座内，通过底座外的按钮就可以根据不同的需要来选择适用的一块或一组滤光片。通常的滤光片配套有：

(1) 蓝色色温转换滤光片：用来把光源的色温由3200K转换成日光型彩色底片所需的5500K色温；

(2) 绿色滤光片：用来增强相差观察方法中成像的反差，或者以黑白底片作显微照相时，可以提高片成像的反差；

(3) 浅灰色滤光片：是透光率为50%的中性减光滤光片，可把视野的亮度减弱一半； (4) 灰色滤光片：是透光率为25%的中性减光滤光片，可把视野的高度减弱75%；

(5) 透光率仅为6%的中性减光滤光片，可把视野的亮度变得相当暗，95%以上的光都已被吸收掉。

8. 光源的视场光阑（luminuos field diaphragm） 视场光阑是显微镜照明光路系统中的重要部件之一，它只能按照库勒照明系统的要求来进行调节，视场光阑不可以任意开大，但要根据使用的物镜倍数来调节适当的大小。视场光阑的主要功用有： (1) 控制杂散光在成像光路系统中的影响，特别是免除杂散光对照相系统的干扰，使显微照相的底片不至于蒙上一层灰雾；

(2) 控制照明光束的大小，使所观察的视域能受到均匀的照明； (3) 在荧光显微镜检方法中，可以把激发光限制在所需激发样品的视域范围内，以防止视域外的样品过早受到激发。

9. 聚光镜系统（condenser system） 聚光镜系统是照明光路系统中的重要部件之一，它也只能按照库勒照明系统的调整要求来进行调节。聚光镜系统调整的好坏，可以直接影响显微镜 视域中照明的均匀性，也可影响显微镜的分辨力，还可以直接控制显微照相底片上的反差。聚光镜系统通常由以下几个部件组成：

(1) 聚光镜本体（condenser） 可以是简单的阿贝聚光镜，也可以是消球差-消色差的优质聚光镜，另外还有一种是消除了内应力的偏光聚光镜。聚光镜的重要参数之一是数值孔径（NA），通常为0.32；这样的数值孔径太小，只能与以下的物镜配合使用，因此需配用前端透镜来提高数值孔径，以便与不同倍数的物 镜灵活配合使用； (2) 前端透镜（front lens） 前端透镜本身的数值孔径通常为0.63、0.90、1.30或1.40，它要附装在聚光镜本体上，可以方便地摆进或摆出光路。最常用的前端透 镜数值孔径为0.90，当它摆入光路时，可以和10×及以上的物镜配用，摆出光路时可以和10×以下的物镜如6.3×、5×及2.5×等物镜配用； (3) 聚光镜的孔径光阑（aperture diaphragm） 孔径光阑实际上是一个可变光圈，它是显微镜照明光路系统中的又一个重要部件，在透射光明视野法、微分干涉相衬法以及偏光法所使用的聚光镜中，都装有孔径光阑。它可以影响显微镜在作观察时的分辨力；直接控制显微照相底片上的反差；可用来调节聚光镜的数值孔径，配合所用物镜的数值孔径， 以取得最佳的分辨本领，或最大的分辨本领；还可以使光源的发光体成像于孔径光阑所在的平面上，从而满足库勒照明系统的前提条件。

在实际操作中，调节聚光镜孔径光阑可以改变显微镜中所观察到的视野亮度，这是由于历史上对聚光镜孔径光阑的误解所造成的错误用法。这里要特别强调：不应该用聚光镜的孔径光阑来调节视野中的亮度、更不应该用调节聚光镜位置高低的方法来调节视野中的亮度！以往的错误用法希望能在实际操作中纠正过来。

(4) 转盘（turret） 在多用途聚光镜系统中，为方便才把明视野的孔径光阑、暗视野的中央光挡、相差法所需用的各种不同直径的环状光圈、微分干涉相衬法用 的DIC棱镜及其孔经光阑等部件装在转盘上再嵌入到聚光镜本体的座子内，使用时转动转盘就可以选用不同显微镜检法所适用的聚光镜，方便而又快捷。

聚光镜系统有两个调节装置：

a. 聚光镜的调中螺丝（centering screws） 调中螺丝通常为1对，位于聚光镜托架前方的左右测。和环形燕尾槽中的调中螺丝成三足鼎立之势，可以聚光镜前后、左右调整，使聚光镜的光轴 与照明光路、成像光路合轴；

b. 聚光镜托架的上下调节装置（vertical adjustment of condenser carrier）： 利用这个调节装置，可使聚光镜的位置作上下调动，使视场光阑经过聚光镜在样品视野中的成像调到最为清晰，光阑像的位置也可利用托架上的调中螺丝来进行调 中，从而满足库勒照明系统调整的要求。

10. 机械移动式载物台（specimen stage） 载物台可以承载样品，装有可在水平方向上作前后、左右移动的调节装置，有的还可以在水平方向上作大约100度的旋转，以便使样品能更好地与显微照相的取景框相适配。

11. 物镜转换器（nosepiece） 物镜转换器安装在滑插式燕尾槽座上，已作了准确的对中。可迅速更换物镜。常用的有6个、5个及4个孔位的物镜转换器。

12. 物镜（objectives） 物镜是显微镜的核心光学部件，显微镜的放大倍数、分辨本领、色差与像差的校正状况、工作距离等，都有直接由物镜来决定。衡量物镜质量的基本参数主要有：a. 色差消正的程度（或级别）；b. 像场平坦的程度；c. 所使用的玻璃材料。数值孔径（NA）是物镜最重要的参数，数值孔径越大，分辨率越高。目前物镜的数值孔径最大只有1.30。按照物镜色差和像差校正的程度，物镜可以分为以下类别：

(1) 消色差物镜（achomats） 通常对红光与蓝光两种色光作了色差校正，但视域中像场的平坦程度并未作过完善的校正，因此只能作一般的观察应用。在偏光显微镜中，由于需要消除物镜内各个镜片的内应力，反而需要利用这种镜片数目不多的物镜来做偏光物镜。 (2) 有限平像场消色差物镜（flat-field achromats） 这也是对两种色光作了校正的消色差物镜，但视域范围内像场的平坦程度只作了有限范围内的校正，通常在显微照相取景框范围内像场是平坦的，以确保显微照相对焦的清晰，取景框范围以外，往往不一定能保证同样的清晰度。适用于常规检验而又需要作显微照相的工作中。 (3) 完善平像场消色差物镜（plan-achromats） 这也是对两种色光作了校正的高级消色差物镜，主要特点是像场在整个视域中作了完善的校正，适合于作要求较高的显微镜检工作，特别是作显微照相效果更好。由于这种物镜仍采用常用的光学玻璃，不适宜作荧光等这一类弱光的观察和照相。

(4) 萤石玻璃消色差物镜（neofluar） 这也是对两种色光作了色差校正的消色差物镜，其中全部或部分镜片则采用了可透过近紫外光（波长约为365nm）的萤石玻璃（即氟化钙晶体）来制造。因此特别适合于作荧光与相差方法的观察与显微照相，也可用在偏光显微镜中。 (5) 完善平像场复消色差物镜（plan-opo-chromats） 这是最高一级的消色差物镜，对红、绿、蓝3种颜色都作了很好的色差校正，而视域中的像也 作了完善的校正，数值孔径比萤

石物镜大，可应用于要求极高的显微观察与显微照相中，但价格十分昂贵，由于所使用的镜片数目多达12片，光能损失较大，不宜 用作荧光观察与照相。 (6) 已消除内应力又可以调节中心的物镜（pol Z objectives） 这是一种适用于作偏光观察的物镜，是从以上所介绍的几种物镜中挑选出来的，在装配时特别注意消除了其中的内应力，以免内应力所引起的干涉条纹干扰了偏光样品中真正的干涉条纹。

(7) 完善平像场萤石消色差多种介质浸没式物镜（ plan-neofluar imm.） 这是一种新型物镜，采用萤石玻璃制造其中全部或部分镜片，成像质量特别明亮，反差十分好，色差接近于复消色差，因此又属于半复消色差物镜。数值孔径特别大，透光能力强，而且分辨率十分好。最大的特点是可用好几种浸没介质，如常用的浸没油、甘油、蒸馏水等，既可使用权盖玻片也可以不使用。这种物镜制成干式物镜时，可加上校正环，用来校正盖玻片的厚度不均匀性，以消除盖玻片厚度不规则造成的成像失真，对于厚度在0.12-0.22mm之间的盖玻片都可以作相应的校正。

1986年以来，德国蔡司公司推出的新一代光学显微镜，其中的物镜突破了传统光学显微镜的概念，采用了无限远色差校正的 光学系统（infinity color-corrected system，简称ICS物镜），其特点是：由物镜射出的成像光束是一束平行光，可在成像光路中按需要插入任意多的光学部件而不影响成像质量。在显微镜镜 体内有一特制的镜筒透镜（tube lens）与物镜相配，两者结合起来把物镜的色差与像差都作了十分完善的校正，而且物镜的视域相当宽阔，比传统物镜的视域扩大约40% 。

13. 荧光滤光片组插板的插口（slot for the fluorescence slider） 这是为作荧光观察时插入荧光滤光片组插板预留的插口。

14. 勃氏镜插板的插口（slot for Bertcand-lens slider） 这是为作偏光观察时插入勃氏镜插板预留的插口，勃氏镜是偏光显微镜中用作锥光干涉图试验的重要部件。 15. 补色器插板的插口（slot for auxiliary objects） 这是当作微分干涉相衬观察和偏光需加入的各种补色器预留的插口。

16. 双目镜筒或带照像镜筒的双目镜筒（binocular tubes or binocular phototubes） 用来安放目镜及照像装置。为便于观察，镜筒制成具有一定倾斜角度（30°或45°），设有瞳距调节装置，可在55°至75°范围内调节，以适合不同使用者两眼瞳孔距离。双目镜筒内装有一些折光和分光棱镜，能把从物镜出来的一束成像光束等分成两部分，分别由两个目镜作观察。带照像镜筒的双目筒一般在右测装有光束分配棱镜的拉杆，把它全部推入时只作观察，拉出来则一边观察一边照像，或全部作显微照像。

17. 目镜（eyepieces） 目镜是显微镜中把物镜所成的像作再一次放大的光学部件，显微镜的总放大倍数通常就是物镜与目镜放大倍数的乘积。为方便不同视力者进行显微拍照时调焦同样清晰，一些目镜设计成可调焦式。为了使显微镜获得最大有效放大倍数和最高分辨本领，必须合理选配目镜。到目前为止，由于受光学定律的制约，光学显微镜最大的有效放大倍数为1250-1300倍。10×目镜是最常用而必须配备的目镜，观察荧光时最好选用10×以下的目镜。

显微镜的正确调试和使用

在了解了显微镜各主要部件的名称、构造和功能之后，为了更好地发挥显微镜的各种功能，提高工作效率，保证在显微观察及显微照像过程中取得最佳效果，使用人员必须了解和掌握显微镜正确的调试方法和使用方法。尤其在新一代显微镜中，具备了多种功能，能进行多种显微镜检方法观察，正确的试调方法和使用方法就显得尤为重要。下面以Axioplan万能研究显微镜为例，简述调试及使用方法。

1. 显微镜照明光路系统的调整 为了使显微镜的视野能受到均匀而又充分的照明，在显微镜初次安装和调试时，就必须把照明光路系统调整好，这是正确使用显微镜， 并获得正确、可靠结果的重要手段和最基本的要求。此外，正确掌握照明光路系统的调整，是使用显微镜过程中更换光源灯泡后所必经的步骤，也是在日常使用过程 中不时地检验显微镜性能的必要手段。显微镜照明光路系统的调整主要有以下4项内容：

(1) 照明光源灯室在显微外的初步调整

① 首先将灯室的外壳打开，压弹簧夹子将卤素灯泡装入插座中，安装时避免手指直接接触灯泡（可用柔软的布或纸隔住），以免灯泡上留有指纹等脏物，影响灯泡的使用寿命。

② 把灯室摆在桌面上，接通电源后，用专用的螺丝刀调节灯的调焦旋钮孔（标有

“←→”），使灯丝投影在1-2m外的墙上，将灯丝成像调至清晰；然后调节灯的高 低位置调节丝孔（标有“──”），使灯丝位置高低适当；再调节灯的左右位置调节螺丝孔（标有“──”），使灯丝左右位置合适。

(2) 光源发光体（灯丝）在显微镜内位置的检验和校正 目的是为了把发光体的像端端正正地调入物镜的视域范围内，从光源的角度去确保显微镜的视域受到充分而均匀的照明，这是调整库勒照明系统的前提条件。

需要的基本工具：对中望远镜购置显微镜时已配备。 ① 拔掉灯库内的毛玻璃套筒，把灯室装回显微镜上；

② 选用10×物镜，开亮光源程序找样品并调焦清晰，再换用40×物镜把样品调焦

清晰（40×物镜可以看清灯丝的全貌）； ③ 把聚光镜的孔径光阑和视场光阑均开到最大；

④ 拔掉其中一个目镜，换上对中望远镜，抓住白色部分，另一手伸缩黑色接目镜，

就可在视野中看到灯丝像；

⑤ 如灯丝位置不合适，调“──”孔，把灯丝像沿水平方向调好，调“──”孔，

把丝像沿垂直方向调好，直至将灯丝像调至刚好充满物镜孔径的光圆像； ⑥ 调整完毕后，将毛玻璃套筒插回原位，拔掉对中望远镜，换回目镜作下一步调整。

以上所述照明光源灯室在显微镜外的调整和光源发光体在显微镜内位置的校验，只需在显微镜初次安装调试及更换灯泡时进行，平时使用显微镜时不能随意乱调乱动。万一调乱时，可按上述步骤调回原状。 (3) 库勒照明（Kohler）系统的正确调整 显微镜的正确调试，主要工作之一是照明光路系统的调整，而其中的关键是库勒照明系统的调整。对于每一位使用显微镜的人员，特别是作显微照像的人员来说，应该对库勒照明系统的原理及其调整步骤有一定的了解和掌握，才能充分发挥显微镜应有的功能，拍出来的照片才能在效果上比较一致而又完善。

库勒照明系统的原理简单来说就是：光源发光体上任意一点发出的光，可以照明显微镜的视域范围，而光源发光体上每一点所发出的光汇集起来，在显微镜的视域中就实现了非常充分而又均匀的照明。

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