鲜切莲藕组织中多酚氧化酶的分离纯化

第２７卷第２期食品与生物技术学报

Ｖ０１．２７Ｎｏ．２

２００８年３月

Ｊｏｕｒｎａｌ‘ｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

Ｍａｒ．２００８

文章编号：１６７３—１６８９（２００８）０２—００５５—０６

鲜切莲藕组织中多酚氧化酶的分离纯化

潘永贵１’２，

陈维信２

（１．海南大学食品学院，海南儋州５７１７３７；２．华南农业大学园艺学院，广东省果蔬保鲜重点实

验室，广东广州５１０６４２）

摘

要：酶促褐变是影响鲜切莲藕加工贮藏的主要问题，多酚氧化酶（ＰＰＯ）是引起酶促褐变的重

要酶类。用磷酸缓冲液提取鲜切莲藕组织中的多酚氧化酶，并通过硫酸铵沉淀，ＤＥＡＥ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换柱层析以及Ｐｈｅｎｙｌ

Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｆａｓｔ

Ｆｌｏｗ疏水柱层析进行纯化。该酶被纯化了９５．６６

倍，产率为２．４％。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳确定为单一条带。同时研究表明，鲜切莲藕组织中ＰＰＯ相

对分子质量在６５９００－－一６６１００之间。

关键词：鲜切莲藕；多酚氧化酶；纯化中图分类号：Ｓ

６０９．３

文献标识码：Ａ

ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰｏｌｙｐｈｅｎｏｌＯｘｉｄａｓｅｆｒｏｍＦｒｅｓｈ—ＣｕｔＬｏｔｕｓＲｏｏｔ

ＰＡＮＹｏｎｇ—ｇｕｉｌ”．

ＣＨＥＮ

Ｗｅｉ—ｘｉｎ２

（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｏｄ，ＨａｉｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｉｎａｎ５７１７３７，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ。ＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌ—ｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＰｏｓｔｈａｒｖｅｓｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＦｒｕｉｔｓａｎｄ

Ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ

５１０６４２，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｎｚｙｍｅｂｒｏｗｎｉｎｇｉｓｏｎｅ

ｏｆｔｈｅｍｏｓｔｒｅａｃｔｉｏｎｓｉｍｐａｃｔｉｎｇｑｕａｌｉｔｙｏｆｆｒｅｓｈ—ｃｕｔｌｏｔｕｓｒｏｏｔ．

Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅｉｓ

ａ

ｋｅｙｅｎｚｙｍｅｉｎｄｕｉｎｇｅｎｚｙｍｅｂｒｏｗｎｉｎｇ．ＰｏｌｙｐｈｅｎｏｌＯｘｉｄａｓｅｉｎｆｒｅｓｈ—ｃｕｔ

ｌｏｔｕｓｒｏｏｔｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙａｍｍｏｎｉｕｍｓｕｌｆａｔｅｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｕｓｉｎｇＤＥＡＥ

Ｓｅｐｈａｒｏｓｅｃｏｌｕｍｎ，ａｎｄＰｈｅｎｙｌ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦａｓｔＦｌｏｗ

ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ。ＰＰ０ｆｒｏｍｆｒｅｓｈ－ｃｕｔｌｏｔｕｓｒｏｏｔｗａｓｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙ９５．６６一ｆｏｌｄａｎｄ

ａ

２．４％ｙｉｅｌｄ．Ｔｈｅｅｎｚｙｍｅｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ

ｔｏ

ｂｅ

ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓｂｙ

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ．Ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒ

ｗｅｉｇｈｔｏｆｔｈｅｆｒｅｓｈ—ｃｕｔｌｏｔｕｓ

ｒｏｏｔ

ＰＰｏｗａｓｅｓｔｉｍａｔｅｄｂｙ

ＳＤＳ－ＰＡＧＥｒａｎｇｅｄｆｒｏｍ６５９００

ｔｏ

６６１００ａｃｃｏｒｄｉｎｇ

ｔＯ

ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００ｇｅｌｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｆｒｅｓｈ—ｃｕｔｌｏｔｕｓｒｏｏｔ；ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ

鲜切果蔬由于其新鲜、方便等特点，市场需求前的研究热点之一。其中，莲藕组织脆嫩，容易切量日益增加。与此相对应，鲜切果蔬已经成为了目

分，适合鲜切生产，但莲藕切分后极易发生褐变，严

收稿日期：２００７－０９—１０．

基金项目：华南热带农业大学科技基金项目（Ｒｎｄ０６１８）；海南省热带园艺重点实验室开放课题资助项目（ｃｈ００２）．作者简介：潘永贵（１９７０。），男，山西阳泉人，工学博士，副教授，主要从事果蔬采后生理及贮运保鲜教学科研工作．

Ｅ—ｍａｉｌ：ｙｏｎｇｕｉｌ２３＠１２６．ｃｏｒｎ

５６

食品与生物技术学报

第２７卷

重影响了产品的感官质量和商品价值。多酚氧化酶（ＰＰＯ）是引起果蔬发生酶褐变的重要酶类。虽．然，已经有多位研究者对莲藕组织中ＰＰＯ的性质进行了研究，但是他们都是对莲藕组织中的ＰＰＯ进行了简单的提取，而并没有进行纯化［１－４］，因此这必然会影响到ＰＰＯ的性质的准确性。同时，对酶的分离纯化是了解该酶性质及各组分间的协同关系及对其进行控制的前提［５］。

目前ＰＰＯ粗提物的纯化最常使用的方法是采用不同饱和度的硫酸铵沉淀、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５、Ｇ－１００或Ｇ－２００凝胶色谱以及ＤＥＡＥ一纤维素或ＤＥＡＥ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换色谱，这个过程中可使用透析、超滤、丙酮沉淀或ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２５色谱除去低分子杂质［６－１０｜。此外，在一些果蔬中还使用了疏水色谱层析［１１－１引。例如在荔枝果实上，蒋跃明［１４］采用

Ｓｅｐｈａｄｅｘ

Ｇ－１００、Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ和等３步柱层析，纯

化倍数达到１０８倍；段玉权等［１朝采用Ｐｈｅｎｙｌ

Ｔｏｙｏ－

ｐｅａｒｌ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ

Ｇ－２５和ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ等柱层

析对中华寿桃果肉中ＰＰＯ进行分离纯化，纯化倍数达到１１０倍。虽然目前对果蔬组织中多酚氧化酶分离纯化的研究报道较多，从目前报道来看，尚未见有关对莲藕组织中的多酚氧化酶进行分离纯化的研究报道。此外，对鲜切莲藕组织中的ＰＰＯ的研究也未见报道。因此，作者将重点对鲜切莲藕组织中的ＰＰＯ进行分离纯化，从而为最终对鲜切莲藕组织中ＰＰＯ性质的研究奠定基础。

１材料与方法

１．１材料处理

直接从广东省番禺采摘运抵实验室后，挑选新鲜、无病害、无损伤、完整的莲藕果实，于１０℃冷库中预冷过夜，于第２天进行去皮、切片处理，然后贮存于１０℃下待组织出现褐变时进行多酚氧化酶的分离纯化。

１．２ＰＰＯ的分离纯化

１．２．１

酶的提取取１０℃下贮藏到第８天的鲜

切莲藕片组织２５０ｇ，首先采用液氮速冻，按１：２质量比例加入经过预冷（４℃）的０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ６．８的磷酸缓冲液（内含５ｏＡ的ＰＶＰ），在高速组织捣碎机上捣碎，然后于４℃下浸提２ｈ，用４层脱脂纱布过滤，滤液于１０

０００

ｒ／ｍｉｎ、４℃下离心１５

ｒａｉｎ，上清液即为多酚氧化酶粗酶液。

向粗酶液中边搅拌边加入固体硫酸铵至３０％饱和度，４℃下静置２ｈ，于１０

０００

ｒ／ｒａｉｎ、４℃下离心１０ｍｉｎ，弃沉淀，继续向上清液中加入硫酸铵至

７０％饱和度，４℃下静置过夜，然后于１０

０００ｒ／

ｍｉｎ、４℃下离心１５ｍｉｎ，弃上清液，将沉淀用尽量

少的０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值为６．８的磷酸缓冲液溶解，

得到酶的提取液。然后将酶提取液用０．１ｍｏｌ／Ｌ、

ｐＨ

６．８的磷酸缓冲液透析过夜，中间换透析液２

次，然后用ａｍｉｃｏｎ超滤杯浓缩至１０

ｍＬ。

１．２．２

ＤＥＡＥ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ柱层析ＤＥＡＥ—Ｓｅｐｈａ—

ｒｏｓｅ层析柱（２．５ｃｍ×２０

ｃｍ）首先用碱、酸和氯化

钠分别清洗以后，用０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值为６．８的磷酸缓冲液平衡，将１．２．１步骤所得的多酚氧化酶提取液上柱，首先用０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值为６．８的磷酸缓冲液洗脱至Ａ：。。保持不变时，然后换用含Ｏ～Ｏ．５

ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的上述缓冲液从低浓度到高浓度进行

离子强度线形梯度洗脱（３．５ｍＬ／管，７０ｍＬ／ｈ），然后收集有活性峰的洗脱液。

１．２．３

ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｆａｓｔ

Ｆｌｏｗ疏水柱层析

将１．２．２步骤收集的洗脱液首先加固体硫酸铵

至１．５ｍｏｌ／Ｌ的饱和度，然后于１００００ｒ／ｍｉｎ、４℃下离心１０ｍｉｎ，弃沉淀，上清液准备过柱。Ｐｈｅｎｙｌ

Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｆａｓｔ

Ｆｌｏｗ疏水柱（２

ｅｍ×１５

ｃｍ）首先

用含１．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸铵的０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ６．８的磷

酸缓冲液平衡，然后将上述上清液上柱，首先用含

１．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸铵的０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ６．８的磷酸缓

冲液洗脱至Ａ：。。保持不变时，然后换用含０～１．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸铵的上述缓冲液从高浓度到低浓度进行离子强度线形梯度洗脱（３．５ｍＥ／管，７０ｍＬ／ｈ），然后收集有活性峰的洗脱液，得到纯化的酶液。一部分用于凝胶电泳，一部分用于酶学性质研究。１．２．４纯化酶液的处理将１．２．３步骤得到的纯化酶液首先用０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值６．８的磷酸缓冲液透析过夜，中间换透析液２次，然后用聚乙二醇

６０００浓缩。

１．２．５

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ垂直板电泳将１．２．４步骤得到的酶液进一步浓缩至固体，然后加入适量的裂解液（质量分数１０％的ＳＤＳ

１．２５

ｍＬ，浓缩胶缓冲液

５０弘Ｌ，体积分数４０％的甘油０．６２５ｍＬ，水２５弘Ｌ，质量分数０．５％的溴酚蓝０．４ｍＬ）溶解，并用移液枪反复吸冲壁，稍微加热溶解，５

０００

ｒ／ｒａｉｎ离心，吸

取上层转入小拇指管中，稍微加热（９５℃，２

ｍｉｎ），

离心收集，得电泳样品液，贮于－－２０℃下备用。

ＳＤＳ．ＰＡＧＥ垂直板电泳：参照张龙翔［１６］的方法。采用浓缩胶为５ｇ／ｄＬ，电流１０ｍＡ；分离胶为

１２．５

ｇ／ｄＬ，电流为１５ｍＡ。电极缓冲液为：质量分

数０．１％的ＳＤＳ，ＰＨ８．３的Ｔｒｉｓ（０．０５ｔｏｏｌ／Ｌ）一甘

氨酸（ｏ．３８４ｍｏｌ／Ｌ），每孔上样量均为２０肛Ｌ。当溴

第２期潘永贵等：鲜切莲藕组织中多酚氧化酶的分离纯化

５７

酚蓝指示剂居前沿为１ｃｍ时停止电泳。取出凝胶平板（从尾部撬出），割去浓缩胶部分，于蒸馏水中

浸摇３ｍｉｎ，如此２～３次，用０．１％考马斯亮蓝

Ｒ２５０—４５％甲醇一１０％冰乙酸溶液染色２ｈ，然后于７．５％冰乙酸一５％甲醇溶液中不断振荡４～５ｈ，脱色，０．５ｈ换一次脱色液。

１．２．６

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ垂直板电泳测定纯酶相对分子

质量按１．２．５的方法进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ垂直板电泳，以溴酚蓝在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳凝胶片上的前沿位置作为参数，计算各种标准相对分子质量蛋白与样品的相对迁移率Ｒｔ值，以标准蛋白相对分子质量的常用对数值（１９Ｍｒ）对Ｒｔ值制作标准曲线，根据ＰＰＯ的Ｒｔ值求出其相对分子质量。标准相对分子质量蛋白质分别为：鸡蛋清溶菌酶（１４４００）、胰蛋白

酶抑制剂（２０１００）、牛碳酸酐酶（３１０００）、兔肌动蛋

白（４３０００）、牛血清蛋白（６６２００）和兔磷酸化酶Ｂ

（９７４００）。

１．２．７

葡聚糖Ｇ－１００凝胶过滤测定ＰＰＯ相对分

子质量葡聚糖凝胶柱Ｇ－１５０（２

ｃｍ×５０ｃｍ）用蒸

馏水洗涤后，用２０ｍｍｏｌ／ＬｐＨ值７．０磷酸缓冲液平衡，将纯酶浓缩，取２ｍＬ过柱，以相同缓冲液洗脱，分部收集，体积流量为２．８ｍＬ／管，６ｍｉｎ／管。同时，取标准相对分子质量的蛋白质溶液（２ｍｇ／

ｍＬ）２

ｍＬ，按照上述方法，分别得到相应的洗脱体

积（Ｕ），以各标准相对分子质量蛋白的洗脱体积（Ｖ。）对其相对分子质量的常用对数（１９ＭＷ）作标准曲线，依据木糖苷酶的洗脱体积（Ｕ）求得木糖苷酶的相对分子质量。标准相对分子质量蛋白如下：Ｂ－半乳糖苷酶（１３００００）、牛血清白蛋白（６７０００）、辣

根过氧化物酶（４００００），胰凝乳蛋白酶（２５０００）。

１．３

ＰＰＯ活性和蛋白质含量的测定

ＰＰＯ活性测定参照林植芳［１７３的方法。３

ｍＬ

反应液中含有２．９

ｍＬ

０．１％的邻苯二酚溶液（用

０．１

ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值６．８的磷酸缓冲液配制）和０．１

ｍＬ酶液。加入酶液后，测定ＯＤ螂值的变化，以每分钟△ＯＤ。。。变化０．００１表示一个酶活性单位。

蛋白质含量测定采用Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）染色法。取５０｜ｌＬ样品液加入２．５ｍＬ的考马斯亮蓝Ｇ２５０

溶液摇匀，放置５ｒａｉｎ后，于５９５ｎｍ处测定吸光度，

根据标准曲线计算蛋白质含量。牛血清蛋白作为标准蛋白。

２结果与讨论

２．１

ＰＰＯ的分离纯化

莲藕组织经过硫酸铵分步盐析后，进行ＤＥＡＥ—

Ｓｐｈａｒｏｓｅ离子交换柱层析，如图１所示，出现了两个明显的蛋白峰和活性峰。其中，第１个峰为０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值６．８的磷酸缓冲液洗脱出的峰，第２个峰为０～０．５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值６．８的磷酸缓冲液进行离子强度线形梯度洗脱出现的峰。并且第一个酶活性峰远远大于第２个酶活性峰，而其蛋白峰却小于第２个蛋白峰，表明经过ＤＥＡＥ—Ｓｐｈａｒｏｓｅ离子交换柱层析，在用磷酸缓冲液洗脱时，大部分杂蛋白被吸附，而大部分ＰＰＯ则被洗脱出来。因此，收集第１个活性峰，然后进一步

进行ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦａｓｔＦｌｏｗ疏水柱层析，分

离出７个蛋白峰，而只有２个具有ＰＰＯ活性，并且第２个酶活性峰远远大于第１个酶活性峰（见图２），因此收集该活性主峰进一步进行下列研究。ＰＰＯ分离纯化过程中各参数的变化见表１。

１．２１．Ｏ

０Ｏ．８

宴２

飞

已

０．６

叠

！ｉｇ

ｏ

０．４皇

Ｏ．２

Ｏ

试管号

图１莲藕组织ＰＰＯ的ＤＥＡＥ洗脱曲线

Ｆｉｇ．１

ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅｃｏｌｕｍｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ

ｏｆ

ＰＰＯｉｎｌｏｔｕｓ

ｒｏｏｔ

０．５

一

一／１２８０－．－ｐｐＯ

０．４

２

０．３

气

０．２

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ｏ

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０．１

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０

－．一“、八。／｛气

试管号

图２莲藕组织ＰＰＯ的ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦａｓｔＦｌｏｗ

洗脱曲线

Ｆｉｇ．２

ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦａｓｔＦｌｏｗｃｏｌｕｍｎｃｈｒｏｍａｔｏｇ‘

ｒａｐｈｙｏｆＰＰＯｌｏｔｕｓ

ｒｏｏｔ

作者在对莲藕组织的ＰＰ０进行分离纯化的过程中发现，ＰＰＯ经过ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５或Ｇ－ｌＯＯ后，

５８

食

品

与

生

物技

术学

报

第２７卷

活性大幅度降低，而硫酸铵对其活性有明显的保护作用，因此在莲藕组织中ＰＰＯ的分离纯化过程中不宜脱盐。此外，在过ＤＥＡＥ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ柱时通常采用ｐＨ值８．０缓冲液进行平衡和ｐＨ值８．０的洗脱液进行洗脱。采用ｐＨ值６．８的缓冲液和洗脱液进行平衡和洗脱时，在起始加入酶液用平衡液洗脱过程中，具有ＰＰＯ活性的酶大部分被洗脱出来，而大部分杂蛋白则被吸附在ＤＥＡＥ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ柱上，通过这级分离，不仅节约了时间，而且大大提高了ＰＰＯ的纯化倍数，纯化倍数达到３０．５倍。接着经

过ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦａｓｔＦｌｏｗ疏水柱层析，该柱

具有极高的分离性能，ＰＰＯ纯化液进一步经过该柱后，纯化倍数达到９５．６６倍。

段玉权等ｎ阳在对中华寿桃ＰＰＯ分离纯化的研究中认为，样品抽提液中加入Ｔｒｉｔｏｎ

Ｘ一１００、ＰＶＰ

标准蛋白从上到下：１．兔磷酸化酶Ｂ（９７４００）；２．牛血清蛋白

（６６

２００）１３．兔肌动蛋白（４３０００）Ｉ４．牛碳酸酐酶（３１０００）｝

５．胰蛋白酶抑制剂（２０１００）；６．鸡蛋清溶菌酶（１４４００）

图３莲藕组织ＰＰＯ的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ

Ｆｉｇ．３

ＳＤＳ－ＰＡＧＥｏｆｔｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄＰＰＯｏｆｌｏｔｕｓ

ｒｏｏｔ

和ＰＭＳＦ可以获得极佳的分离效果。但是本研究中在加入ＴｒｉｔｏｎＸ－１００和ＰＭＳＦ却发现ＰＰＯ活性只有轻微的提高，这可能是材料差异所致。

２．２酶纯度鉴定

将纯化的多酚氧化酶液经过浓缩透析后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳仅出现单一的蛋白带（见图３），表明该酶已被纯化到电泳均一。

２．３２．３．１

ＰＰＯ的相对分子质量测定

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ垂直板电泳测定纯酶相对分子

质量采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法测定多酚氧化酶相对分子质量，结果如图４所示，从图中可以求出莲藕组织中多酚氧化酶相对分子质量约为６５

２．３．２

９００。

１．兔磷酸化酶Ｂ（９７４００）；２．牛血清蛋白（６６２００）１３．兔肌动蛋白（４３０００）；４．牛碳酸酐酶（３１０００）；５．胰蛋白酶抑制剂

（２０

１００）ｌ

葡聚糖Ｇ－１００凝胶过滤测定ＰＰＯ相对分

子质量采用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００柱层析测定多酚氧化酶的相对分子质量，结果如图５所示。所得相对分子质量和洗脱体积的回归方程：Ｙ＝一０．０８５ｘ＋

５．８９３

６．鸡蛋清溶菌酶（１４４００）．

图４

Ｆｉｇ．４

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法测定莲藕组织ＰＰＯ相对分子质量

Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ

ｒｏｏｔ

９，根据多酚氧化酶的体积１２６．３ｍＬ，计算出

１００。

ｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｓｓｏｆＰＰＯｆｒｏｍｌｏｔｕｓ

该酶的相对分子质量约为６６

ｂｙ

Ｓｎｓ－ＰＡＧＥ

第２期

５ ｌ５ Ｏ４ ９４．８

潘永贵等：鲜切莲藕组织中多酚氧化酶的分离纯化

５９

８９３

ｏ

蒋跃明［１４３研究认为，荔枝果皮中ＰＰＯ的相对分子质量为７６０００。段玉权等［１钉报道，中华寿桃果实中ＰＰＯ的相对分子质量约为６６０００。本研究表明，鲜切莲藕组织中ＰＰ０相对分子质量６５９００～６６

１００

蔷４．７１

４．６４．５４．４４．３

０

５０

１００

１５０

２００

２５０

之间，和上述报道相近。ＰＰＯ分子大小的不同可能因酚类底物氧化产物的反应或酶蛋白本身的分解

所致［１７３。

洗脱体积ｒ，／ｍＬ

３

标准相对分子质量蛋白如下：１．哥半乳糖苷酶（１３００００），２．牛血清白蛋白（６７０００）｝３．辣根过氧化物酶（４００００）＃４．胰凝乳蛋白酶（２５０００）图５

Ｓｅｐｈａｄｅｘ

结语

作者采用磷酸缓冲液提取鲜切莲藕组织中的多酚氧化酶，并通过硫酸铵盐析沉淀，ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈ－

‘

Ｇ－１００凝胶过滤法测定莲藕组织多酚

氯化酶相对分子质量

Ｆｉｇ．５

ＥｓｔｉｍａｔｉｏｎｏｆｍｏｌｅｃｎｌａｒｍａｓｓｏｆＰＰＯｆｒｏｍ

ｒｏｏｔ

ａｒｏｓｅ离子交换柱层析以及ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅ６

ｌｏｔｕｓ

ＦａｓｔＦｌｏｗ疏水柱层析进行纯化后，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ

ｂｙＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００ｇｅｌｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ

电泳确定为单一条带，表明该酶已被纯化到电泳均一。在整个过程中，该酶纯化了９５．６６倍，产率为２．４％。同时研究表明，鲜切莲藕组织中ＰＰＯ相对分子质量在６５９００～６６１００之间。

关于天然植物ＰＰＯ相对分子质量的大小，报道不一。ＰＰＯ有活性的形式主要为４００００～４５

０００、

５９０００、６５０００～６８０００［１８－－１９］以及７００００～７２０００［川。

参考文献（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）：

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ＹＡＮＧ

Ｍｉｎｇ，ＷＡＮＧＺｈｉ—Ｊｕｎ．Ｓｔｕｄｙ

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Ｌｏｔｕｓｒｏｏｔａｎｄ

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ＨＵ

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（责任编辑：杨萌）

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