常见血液肿瘤FISH检测小册

常见血液肿瘤FISH检测小册

一.FISH是什么

FISH即荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization），是在细胞遗传学水平上检测染色体及基因数目和结构异常的一种分子病理检测技术。其基本原理是利用标记了荧光素的核酸作为探针，按照碱基互补原则，与待检样本中与之互补的核酸经过变性-退火而形成杂交双链核酸，然后通过荧光显微镜进行检测和分析。

FISH技术具有直观、快速、敏感性高和方便灵活等特点，目前已经广泛应用于临床的肿瘤遗传学及各种基因相关疾病的分型与个体化治疗等多个领域。

二.血液肿瘤的诊断分型

MICM：血液肿瘤诊断的精确分型是临床选择正确治疗方案的前提，目前国际上通用的是结合细胞形态学（Morphology）、免疫学（Immunology）、细胞遗传学（Cytogenetics）和分子生物学（Molecular）的MICM分型。 ?

形态学诊断(Morphology)

细胞学：外周血、骨髓涂片，淋巴结穿刺 组织学：骨髓、淋巴结活检 ? ? ?

免疫学检查(Immunology)

免疫组化（IHC），流式细胞（FCM） 细胞遗传学检查(Cytogenetics) 核型分析，荧光原位杂交（FISH） 分子生物学检查(Molecular) PCR，DNA测序

三.FISH技术的作用及优势

FISH作为一项很重要的分子遗传学检测技术，在血液肿瘤的诊断中有很大的作用，得到了NCCN等国内外各大血液肿瘤诊疗指南的认可和建议。

目前与血液肿瘤相关的FISH探针有接近100种，常用的就有60种左右，包括急慢性白血病、骨髓增生异常综合症（MDS）、多发性骨髓瘤（MM）、淋巴瘤等多种血液肿瘤。

FISH技术的相对优势： ? ? ?

FISH技术更敏感，可检测出核型分析检测不出的细微缺失或易位，如MDS中的5q缺失综合征； FISH技术不需要中期分裂相细胞，而核型分析需要培养时间较长且需要较高的操作要求；

FISH技术是在细胞形态的基础上进行结果判读，可有效地降低假阴性或假阳性的风险，而PCR技术经过倍增扩增，不能在形态的基础上判读，对实验要求高，易产生假阴性或假阳性。

四.常用的血液FISH检测探针

1 急性粒细胞白血病（AML）：样本建议骨髓 因断裂、□5q缺失、□7q缺失、□EVI基因断裂 □ AML1/ETO融合基因（M2b分型） □ PML/RARA融合基因（M3分型） □ CBFB基因断裂（M4分型） □ KMT2A（MLL）基因断裂（预后差，治疗失败风险高） □ 其他：□8号染色体、□CBFB/MYH11基因融合、□RARA基2 慢性粒细胞白血病（CML）：样本优先骨髓 裂、□PDGFRB基因断裂、□FGFR1基因断裂 □ 其他：□BCR/ABL（ES）、□BCR/ABL（SF）、□i（17q）、□ASS 基因缺失 □ BCR/ABL（DF）融合基因检测（指导格列卫用药） □ 嗜酸性粒细胞增多症（格列卫作用靶标）：□PDGFRA基因断3 急性淋巴细胞白血病（ALL）：样本建议骨髓 □ ETV6（TEL）/AML1融合基因（预后较好，但易复发） □ TCF3（E2A）基因断裂（标准化疗后易早期复发） □ BCR/ABL融合基因（易迅速复发，对挽救性化疗反应不佳） □ 儿童急性淋巴细胞白血病染色体及基因异常（4、10、17、

TEL/AML1、KMT2A基因断裂、BCR/ABL（DF），预后评估及治疗方案的选择） □ 其他：□ TCF3（E2A）/PBX1、□4、10、17；□MYC基因断 裂、□IGH基因断裂、□KMT2A基因断裂、□CDKN2A（P16）基因缺失 4 慢性淋巴细胞白血病（CLL）：样本优先外周血或骨髓 □ 慢性淋巴细胞白血病染色体及基因异常（P53、RB1（13q14）、 ATM（11q22）、D13S25（13q14）、12，预后评估及治疗方案的选择） □ 其他：□DLEU1（13q14）、□P53、□ATM（11q22）、□MYC 基因扩增、□6q、□TERC、□GLI、□12、□BCL2/IGH、□CCND3/IGH 5 骨髓增生异常综合症（MDS）：样本建议骨髓 □ 骨髓增生异常综合症染色体及基因异常（5q、7q、20q、8、 X/Y，预后评估及治疗方案的选择） □ 其他：□5q、□7q、□20q、□EGR1、□EVI1基因断裂、□X/Y 6 多发性骨髓瘤（MM）：样本建议骨髓 □ 多发性骨髓瘤染色体及基因异常（P53、1q21、RB1（13q14）、D13S319（13q14）、IGH，预后评估及治疗方案的选择） □ 其他：□CCND1（BCL1）/IGH、□MAF/IGH、□FGFR3/IGH、 □MAFB/IGH、□CCND3/IGH、□11q23及DLEU1、□P53、□15q22及6q21、□1q21及1p36、□IGH基因断裂 7 淋巴瘤：样本建议骨髓或淋巴结穿刺 □ MYC/IGH融合基因（辅助诊断伯基特淋巴瘤、高分级B细胞淋巴瘤的治疗） □ BCL2/IGH融合基因（辅助诊断滤泡性淋巴瘤） □ ALK基因断裂（辅助诊断间变性大细胞淋巴瘤，指导克唑替尼用药） □ CCND1（BCL1）/IGH融合基因（辅助诊断套细胞淋巴瘤，鉴别诊断MCL和CLL） □ IGH基因断裂（发生于多种类型的淋巴瘤中，与超过50种基因融合） □ MALT1基因断裂（辅助诊断粘膜相关淋巴组织淋巴瘤，指导HP化疗方案） □ BCL6基因断裂（DLBCL中预后较佳，指导治疗方案） 8 骨髓移植后嵌合状态监测（X、Y） □ X和Y染色体检测

五.常见血液肿瘤FISH探针介绍

血液肿瘤中常见FISH探针有四种类型，应用于基因融合、断裂、扩增和缺失检测。 检测类型 基因融合 BCR/ABL（DF）融合基因检测探针 GSP BCR GSP ABL 探针举例 所含靶标 正常信号 典型异常信号 1 基因断裂 IGH基因断裂检测探针 GSP IGH 基因扩增 MYC基因扩增检测探针 GSP MYC CSP 8 基因缺失 P53基因缺失检测探针 GSP P53 CSP 17 注： *红色标记表示该基因探针标记红色荧光素（R），荧光显微镜相应滤块下观察为红色信号点（某些参数滤块下显示

为橙色信号）；

*绿色标记表示该基因探针标记了绿色荧光素（G），荧光显微镜相应滤块下观察为绿点信号点；

*黄色标记表示该基因探针包含一组分别标记了红、绿两种荧光素的探针组合，荧光显微镜单通道滤块下可观察到相应颜色信号点（绿色或红色信号点），双通道滤块下可观察到红绿相邻或重叠信号（融合，F）。

1.急性粒细胞白血病（AML）

常用FISH检测靶标：AML1/ETO基因融合、

PML/RARA基因融合、CBFB基因断裂、MLL基因断裂 ?

AML1/ETO融合基因检测—M2b分型的标志 1）辅助诊断：AML1/ETO融合基因在M2患者中的发生率20%-40%，在M2b亚型中发生率高达90%，是M2b分型的标志，在M1和M4中少见。

2）判断预后：AML1/ETO融合基因阳性是预后好的标志，患者对治疗反应佳，完全缓解率可达90%，5年无病生存可达50%-70%。 ?

PML/RARA融合基因检测—M3分型的标志 1）辅助诊断：PML/RARA融合基因可见于95%以上的APL中，成为M3的一个特异标志，预后好，约占全部AML的9%。

2）指导用药：全反式维甲酸（ATRA）和三氧化二砷能靶向降解PML/RARA融合蛋白，恢复野生型PML和RARA基因功能，解除其对基因转录的抑制，诱导细胞发生分化和凋亡，使APL得到有效治疗。ATRA与化疗联合使用可使APL的完全缓解率达90%-95%，并可使70%以上的患

者得到长期生存。 ?

CBFB基因断裂—M4E0特征性的遗传学改变 1）辅助诊断：CBFB基因断裂重组是AML的特征性染色体异常，占总AML患者的5%-10%和23%的M4患者，通常见于AML-M4E0亚型，在M2，M5及M4（无嗜酸性粒细胞增多）中较少。现在认为CBFB基因断裂重组是M4E0特征性的遗传学改变。

2）判断预后：大多数CBFB基因断裂重组的AML患者对化疗敏感、预后较好。 ?

MLL基因断裂

1）辅助诊断：在成人急性髓细胞白血病(AML)中，则主要见于M4/M5亚型。

2）判断预后：除t(9；11)，t(10；11)以外，大部分MLL重排白血病缓解率低，并且第一次缓解后极易复发，生存期短，预后很差。在AML中单纯MLL断裂提示预后中等。

2.慢性粒细胞白血病（CML）

常用FISH检测靶标：BCR/ABL基因融合

?

BCR/ABL融合基因检测—CML诊断的“金标准” 1）辅助诊断：t(9；22)(q34；q11)易位形成的BCR/ABL融合基因是CML的标志物，95%CML患者可检测出典型的t(9；22)(q34；q11)易位，约5%的CML患者通过核型分析难以检测到Ph染色体，但可检测出融合基因存在，仍被归为Ph+ CML分类。

2）指导用药：对初诊患者进行BCR/ABL检测，可以进行酪氨酸激酶抑制剂受益人群筛查。格列卫可用于治疗费城染色体阳性的慢性髓性白血病(Ph+ CML)的慢性期、加速期或急变期。

3）疗效监测：Ph染色体存在于CML的整个病程中，治疗缓解后，仍持续存在，只有消除Ph阳性克隆，才能达到最终治愈。FISH可用于治疗期间患者体内BCR/ABL融合基因细胞量动态变化的检测，用于后续的治疗方案选择及药物使用效果评估。

3.嗜酸粒细胞增多症（HE）

常用FISH检测靶标：PDGFRA基因断裂、PDGFRB

基因断裂和FGFR1基因断裂

2008年WHO将具有PDGFRA、PDGFRB或FGFR1基因断裂异常，伴嗜酸性粒细胞增多的髓系和淋巴系肿瘤独立成一个新类“Myeloid/lymphoid neoplasms with eosinophilia associated with rearrangements of PDGFRA, PDGFRB, or FGFR1”。这类患者具有PDGFRA基因重排、PDGFRB基因重排或FGFR1基因重排，即使不伴有BCR/ABL融合基因，依然对酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼（imatinib）治疗敏感，治疗后完全缓解率高。

4.急性淋巴细胞白血病（ALL）

常用FISH检测靶标：ETV6（TEL）/AML1基因融合，

TCF3（E2A）基因断裂，BCR/ABL基因融合，KMT2A（MLL）基因断裂及4、10、17号染色体数目异常

ALL中遗传学改变发生的频率可达80%-90%，遗传学变异较大，但大部分是特异性改变，与特定的形态学和免疫学表型有关。ALL中遗传学改变主要是两种形式，一是染色体结构异常，二是染色体数目的异常。 ?

ETV6（TEL）/AML1基因融合

ETV6（TEL）/AML1融合基因在儿童ALL中的发生率高达20%-25%，是目前儿童ALL最常见的染色体重排。大多数研究发现ETV6（TEL）/AML1阳性的儿童ALL治疗效果很好，5年EFS和总生存率达到89%和97%，是预后良好的指标之一。 ?

TCF3（E2A）基因断裂

约3%-5%的儿童ALL携带E2A基因断裂。早期研究认为TCF3（E2A）/PBX1阳性的ALL患儿易发生早期复发，预后不佳，故曾将其作为高危因素之一。核型分析容易导致20%-25%漏诊，而FISH可克服这一缺点。

?

BCR/ABL基因融合

t(9；22)易位形成的BCR/ABL融合基因，约25%成人ALL及2-10%儿童ALL出现t（9；22）易位，但已被认为是最重要的预后不良的因素之一。一旦检测出BCR/ABL融合基因，患儿即被划分为高危，接受更为强烈的化疗或造血干细胞移植。但大多数患儿仍会治疗失败，5年EFS只有28.6%。 ?

MLL基因断裂

MLL基因改变在急性白血病中的发生率约为5%-10%，但在婴儿ALL中则高达79%。t(4；11)(q21；q23)易位形成的MLL/AF4融合基因最为常见(占41%)，是预后不良的重要标志，5年EFS只有26.7%。

? 4、10、17号染色体异常

儿童ALL约25%有染色体数目的增加，以4、10、17号染色体受累较为多见。4、10和17染色体三体是独立的预后良好的指标，这类患者7年EFS大于90%。

5.慢性淋巴细胞白血病（CLL）

常用FISH检测靶标：13q-，+12，17p-，11q-

慢性淋巴细胞白血病是一种进展缓慢、惰性的肿瘤，约占所有白血病的30%，多起源于B细胞的恶性转化，淋巴细胞分化受阻于未成熟阶段，易伴发自身免疫病和低丙球蛋白血症。约90%的B细胞CLL伴有特异性染色体及基因异常。由于CLL白血病细胞增殖低下，体外培养增殖慢，进入分裂中期的细胞少，传统的核型分析有困难。常规染色体显带技术仅22%CLL可检测到克隆性染色体异常，由于加用B细胞分裂刺激剂，近50%CLL检测到克隆性染色体异常。近年来，随着间期FISH技术的应用，CLL染色体异常的检出率大大提高，可达到75%-80%。最常见的为13q-，其次为+12、11q-、17p-、14q32重排、6q-，对这些遗传学异常的检测可以预测疾病的预后和治疗反应情况。 ?

13q-（含D13S25和RB1）

13q缺失是CLL最常见的染色体异常，40%-60%的CLL出现该异常。单纯del(13q14)常于BinetA期时出现，预后较好，或与正常核型患者相似；中位生存期133个月，无治疗生存期最长达92个月。若伴有+12、11q-等其它染色体异常，则预后通常较差。

?

+12（即CSP12）

+12是最早发现的B-CLL常见染色体异常，其发生率约为15%-35%，通常伴有其它核型异常。+12患者约50%以上伴有不典型的淋巴细胞形态，SmIg和FMC7强表达，Binet分期提前，疾病进展，对嘌呤类似物的反应较差生存期短，预后差，因而需要积极的治疗。但仅有+12改变，无复杂核型异常，细胞形态正常者，预后与核型正常者基本相似。 ?

17p-（含P53/CSP17）

7%-11%的CLL患者伴有17p（P53）缺失，细胞形态多不典型，多处于疾病晚期(BinetB、C期)，对多种治疗(包括核苷类似物)反应差，生存期短。具有17p-核型异常的CLL患者多数预后不良，早期即出现疾病进展，且大多数化疗方案治疗效果较差，因为多数化疗方案中的细胞毒药物都含有嘌呤类似物，其发挥作用主要依赖完好的P53介导的促凋亡机制。因此P53基因是否缺失为临床治疗方案的选择提供指导，对于有P53基因缺失的患者，应选用不涉及P53信号传导系统的药物。 ?

11q（ATM）缺失

11q-是CLL另外一个预后较差的核型异常，常规核型分析检出率<5%，而应用FISH可以提高到20%。ATM缺失的发生率为12%-20%，一些患者即便在初诊时没有ATM缺

失，但随着疾病进展，可出现ATM的缺失，提示ATM的缺失与CLL进展密切相关。

6.骨髓髓增生异常综合征（MDS）

常用FISH检测靶标：5q-，7q-，20q-，+8，-Y

克隆性细胞遗传学异常可见于40%-70%的原发性MDS和95%左右的治疗相关性MDS(t-MDS)。晚期阶段的MDS其染色体畸变率较早期阶段MDS更高,其类型也更为复杂。MDS染色体异常检出的高低也和染色体检测的方法有关：采用CC技术只在31%-49%的原发性MDS患者中检出染色体异常，而采用FISH结果在79%的MDS中检出了染色体异常。

MDS细胞遗传学异常的类型呈现很大的异质性：包括各种染色体数目和结构异常，几乎涉及每对染色体。其中，除5q-见于5q-综合征外，绝大多数缺乏特异性。但MDS的染色体畸变主要以染色体缺失和数目异常(增加或丢失)为主，提示其发病的分子机制主要为肿瘤抑制基因丢失或失活或者与单倍基因剂量不足有关。MDS染色体异常中累及5、7、8、20号染色体的异常最为多见，其发生率分别为20.8%、19.2%、16.9%和6.4%。这些染色体异常既可以单独出现，也可以联合出现。不同类型的MDS中，染色体异常的发生情况也是不同的。染色体核型对MDS有独立的预后价值。总的倾向是：正常核型比异常核型预后好，

单一异常比复杂异常预后好(-7例外)，核型稳定比核型演变预后好。1997年国际预后积分系统(IPSS)将MDS的染色体异常分为3种不同的预后亚型：(1)高危：7号染色体异常和复杂的染色体异常；(2)低危：单纯5q-，单纯20q-，-Y，和正常核型；(3)中危：其他异常，如+8等。 ?

5q-（含TERT/5q33和TERT/5q31）

5q缺失是AML和MDS中最为常见的重排；5q内部出现缺失（5q31-q33）出现于10-15%的MDS患者中，而5号染色体异常约占与治疗相关的MDS的40%以上。-5/5q-的患者预后较好，可用于指导临床进行预后判断和治疗方案的选择，如可采用促进造血、诱导分化和生物反应调节剂等方式进行治疗。-5/5q-的MDS患者在接受来那度胺治疗后可达到完全临床缓解和细胞遗传学缓解，但经常会出现复发。 ?

-7/7q-（含D7S486/CSP7和D7S522/CSP7） 7号染色体缺失或7q缺失与MDS的复发性异常相关，约发生于5-10%AML（M4及M6）、约15%成人MDS、40%儿童MDS及50%与治疗相关的AML/MDS。-7/7q-的患者预后较差，可用于指导临床进行预后判断和治疗方案的选择，如可采用AML联合化疗和造血干细胞移植进行治疗。 ?

20q-（即D20S108）

20q缺失见于骨髓增殖性疾病（MPD）/MDS（4%）/AM（1%）等疾病中。-20/20q-的患者预后较好，可用于指导临床进行预后判断和治疗方案的选择，如可采用促进造血、诱导分化和生物反应调节剂等方式进行治疗。 ?

+8（即CSP8）

+8是原发性MDS最常见的核型异常，国内报道+8的检出概率（21.1%）高于国外（10%），可以出现于FAB分型的每一种MDS亚型，在IPSS积分系统中属于中等预后指标。

7.多发性骨髓瘤（MM）

常用FISH检测靶标：13q-，17p-，1q21扩增，IGH基

因断裂

多发性骨髓瘤是一种最常见的恶性浆细胞病，占造血系统恶性肿瘤的10%，其特征是单克隆浆细胞恶性增生并分泌大量单克隆免疫球蛋白，引起骨痛、病理性骨折、造血异常、单克隆球蛋白血症及肾功能受损等一系列临床变化。目前通用的MM诊断标准主要是标准WHO（2001）和国际MM工作组（2003）。此种疾病容易误诊，误诊率高达60%。

临床研究发现，MM的发生发展中伴随着多种特异的细胞遗传学层次上的相关基因数目或结构的改变。细胞遗传学改变在MM发病机制中发挥重要作用，MM常涉及多种染色体异常，主要为数目异常，染色体核型异常分为超二倍体和非超二倍体两大类，其中超二倍体常见染色体改变是+3、+5、+7、+9、+11、+15、+19、+2l。非超二倍体主要累及-8、-13、-14、-17、-22等。在MM染色体异常中结构改变较少见，主要有1号染色体(1p缺失或1q扩增)、13q-、14q(多为与14q32有关的几种重排)等。

染色体分析需要有较好的中期分裂相，由于骨髓瘤细

胞为终末分化细胞，增长率较低，很难获得足够分裂相进行分析，常规细胞遗传学技术检出率低15%-20%，FISH技术可提高至38%-54%。 ?

13q-（含D13S319和RB1）

13号染色体部分或完全缺失是MM常见的染色体异常，在MM发病机制中较早发现，是该病预后及生存期预测重要指标之一。采用FISH技术检测检出率可达30%-50%。RB1缺失，中位生存期为42.3个月，预后中等；D13S319缺失，中位生存期为42.3个月，预后中等。 ?

P53

P53基因异常在初诊的MM检出率约5%-10%。P53缺失中位生存期为24.7个月，预后差。P53基因参与细胞的凋亡过程，它的缺失将导致化疗药物的不敏感性，临床也证实具有del（17p）异常患者无论是接受传统化疗还是大剂量化疗，甚至是ASCT，疗效和生存情况均比基因正常者差。 ?

1q21

1q21（CKS1B）是MM中最为常见的遗传学异常，CKS1B基因扩增导致细胞周期循环的上调，从而引起很多增殖性疾病。1q21扩增往往与MM的浸润表型相关，预后差，疾病进展快。

?

IGH基因断裂

大约40-60%的MM患者发生IGH基因断裂及易位，IGH基因易位的伙伴染色体，主要包括11q13(BCL1/CCND1)、4p16.3（FGFR3）、16q23(MAF)、20q11(MAFB)和6p21(CCND3)等。较常见的易位：t(11；14)(q13；q32)、t(4；14)(p16；q32)和t(14；16)(q32；q23)分别大约20%、15%和5%患者存在。t(11；14)(q13；q32)预后较好，t(4；14)(p16；q32)的患者与其他遗传亚型的患者相比具有显著较差的预后。

8.淋巴瘤

常用FISH检测靶标：CCND1/IGH基因融合、

BCL2/IGH基因融合、MYC基因断裂、BCL6基因断裂、MALT1基因断裂 ?

CCND1/IGH基因融合

t(11；14)易位后形成CCND1/IGH融合基因，IGH基因附近的增强子使CyclinD1过表达应用范围套细胞淋巴瘤的诊断性指标，95%左右的MCL患者具有t（11；14）（q13；q32）染色体易位，可用于MCL与其他淋巴瘤（CLL/SLL）鉴别诊断。 ?

BCL2/IGH基因融合

t(14；18)易位后形成的BCL2/IGH基因能编码完整蛋白，IGH基因附近的增强子使BCL2过表达；t(14；18)为FL的标志（低级别更易出现），检出率达93%。 ?

MYC基因断裂

约80%的BL病例发生t(8；14)(q24；q32)；约15%的BL病例发生t(2；8)(p11；q24)；约5%发生t(8；22)（q24；q11）。染色体易位导致MYC基因断裂重组可能是BL的一个标志，可以应用于临床上BL的辅助诊断，指导高分级B细胞淋巴瘤的治疗，预后较差。

?

BCL6基因断裂

BCL6基因的重排可见于约30%-40%的弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中。BCL6可能是DLBCL发病机制中特异的原癌基因，BCL6重排预后好于BCL2重排的DLBCL患者。 ?

MALT1基因断裂

由于MALT淋巴瘤缺乏特征性的形态学和免疫表型特点，常规采用排除性诊断；近年来的研究资料证实MALT淋巴瘤中存在几种遗传学异常，主要包括染色体易位t(11；18)(q21；q21)/API2-MALT1、t(14；18)(q32；

q21)/IGH-MALT1、t(1；14)(p22；q32)/IGH-BCL10和非整倍体(如3、7、12、18三体)。伴/不伴染色体易位的MALT淋巴瘤诊断、治疗和预后存在差别，与MALT1（18q21）基因断裂相关的探针可用于辅助诊断粘膜相关淋巴组织淋巴瘤（MALT）。 ?

IGH基因断裂

IGH基因断裂及易位发生于50%B细胞NHL中和多种其他淋巴瘤类型中，可与超过50种的基因发生相互易位，可用于辅助诊断淋巴瘤。 ?

ALK基因断裂

约60%-85%间变性大细胞淋巴瘤（ALCL）病例表达间变

性淋巴瘤激酶（ALK）融合蛋白，这是由于2号染色体上的ALK基因位点发生断裂且与其他基因融合所致。ALK基因与其他基因发生融合（ALK阳性）的患者5年生存率远好于ALK阴性患者（约70%vs30%），且总生存率远好于后者。染色体易位和ALK的表达已经被WHO规定为ALCL的临床诊断指标之一，且是药物克唑替尼的作用靶标。

六.血液肿瘤FISH标本要求

?

标本采集

骨髓（2-3ml）或外周血（3-5ml），肝素钠抗凝，标本量依病人具体情况而定，如再障的病人白细胞较少应加大采集。

? 标本保存及运输

收集后2小时内处理，标本运送及保存建议2-8℃，不超过72h。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/jlk.html