弹性蛋白酶产生菌的筛选及其发酵条件的初步研究

弹性蛋白酶产生菌的筛选及其发酵条件的初步研究

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浙江大学学报 (农业与生命科学版) 2(:9 6,0 91 5 4 2 3 )~ 0J u n lo e in ie st ( o r a fZh ja g Un v riy Agrc i.& Li c. f S i) e

文章编号： 0 89 0 ( 0 3 0—0 90 1 0— 2 9 2 0 ) 10 5— 6

弹性蛋白酶产生菌的筛选及其发酵条件的初步研究陈启和，国庆，应龙何邬(江大学食品科学与营养系，浙江杭州 3 0 2 )浙 1 0 9

摘要：从肉联厂和屠宰场附近的土壤和污水中采集到的近 1 0个样品中，富集培养分离到 1 3株 0经 2能产生弹性蛋白酶的菌株，复初筛、筛后，离到一株产胞外弹性蛋白酶活较高且稳定的细菌，初反复分经

步鉴定属芽孢杆菌属 ( a iu p L3 .同时研究了其产酶最适条件，产酶最适碳源为葡萄糖，最适 B c lss .E ) l氮源为豆饼粉 .对碳源、源和生长因子进行了正交实验，究发现碳源对产酶的影响最大，次为氮并氮研其

源 .当葡萄糖的用量为 6、饼粉为 5、米提取液为 0 2时，具有较高的产酶水平 .最适发酵初 豆 玉 .其

始 p为 7 5,2 0mL最适摇瓶装液量为 2 .在该发酵培养基中培养， 5h时达最高的产酶水平 . H . 5 0mL 3 同时还对离心后的粗酶液进行温度和 p试验，发现该酶最适作用温度和 p分别为 5℃和 7 4 H H O .,该

酶在 4 c以下保温 3 n酶活仍较高，在 6 c以上酶活全部丧失 .在 p .~ 9 0的范围内比较稳 O 0mi O¨ H7 4 .定，而在 p 7 0以下时，活下降很快 .属离子 C 、 n、 能抑制弹性蛋白酶的活性， F”、 H .酶金 u Z A1而 e

L能激活弹性蛋白酶活性，舍剂 E TA则严重抑制弹性蛋白酶活性 . i螯 D

关

键

词：弹性蛋白酶；芽孢杆菌；筛选；鉴定；产酶条件；酶性质文献标识码：A

中图分类号： Q9 5 2 T 2.

CHEN ih Q— e。HE Gu— ig。W U n l n De r.o Fo d Sce c n u rto Zh jan ie - oqn Yig—

o g( pa t f o in ea d N ti n, ei g Unv r ist,H angzho 31 iy u 002 9,C h na) i

S r e n fea ts— r du i g sr i s a d p i a iy a u is o e me t t n c n iin . J ur a f c e nig o lsa e p o cn tan n rm rr t de n f r n a i o d t s o n lo o o

Z ein ie st ( rc& Li c. h j g Un v riy Ag i. a f S i ),2 0, 9 1 5— 4 e 0 3 2 ( ): 9 6A bs r c t a t:St ansc r i apa e ofs cr i ext a e l ar e a t e w e e i ol e f om he s la w a t bl e etng r c lul l s as r s at d r t oi nd s ewat r e s pl s ha w e e e t pr e si f t y of g am e t t r n ar he oc s ng ac or pi m e . O f hem 12 s r i s at t 3 t a n pr duc d as as o e el t e. St a n N o. r i EL 3 ih t ghe t yi d el s a e w as i entfe a Bac lu s w t he hi s— el a t s d iid s il s p.. I a dii n d ton, t he expe i r— m e alr ul s r v l d t he m osts t nt es t e ea e hatt uiabl a bon a toge s ec r nd nir n our e or e a t s o c s f l s a e pr ducton w e e i r gl os 6 uc e an s d oybe l , r pe tv y. The A N O V A e uls de ons r t d ha he uc e an four 5 es c i el r s t m tae t tw n gl os

wa ,s y e n fo s6 o b a lur5% a d c r te lur0 2,i h d t e hg e tea ts r d c in W h n n o n se p f o . t a h ih s lsa e p o u to . et niilpH he m e um a

he i ta oft di w s 7.5,and 20 m L ot n 25 L l s tw a br h i 0 m fa k i s optm a orel t s r— i lf as a e p o duc i ton. T he c t e m ant i ed m axi um l s as a tviy at ulur i an m e a t e c i t 35’ or 5 hour C f 3 s under t he optm ie i z d

c n ii n . Th l s i l tc a t iy wa h i h s t p o d to s e e a to y i c i t s t e h g e t a H7 4 a d 5℃ . Th s e z m e wa t b e o e v . n 0 i n y s s a l v rt r ge ofpH he an 7.4 9. nd el - 0 a b ow 40℃, a t nd is enz m e ac i iy w a i bie u,Zn”, A 1 y tv t s nhi t d by C

a d EDTA .Fe+a d Li we e b n fca O e z me a t iy n n + r e e i il t n y c i t . v

收稿日期：2 0— 9 1 0 20— 1

基金项目：浙江省自然科学基金资助项目 ( 0 0 4 30 2 )作者简介：陈启和 ( 9 5 )男，北黄冈人，士研究生，事微生物与发酵工程研究 17,湖博从

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第2卷 9

Ke y wor ds: e a t e;Bac lussp. EL3; s ee ng;i l s as il cr ni den iia i tfc ton; e a t e pr l s as oduc i ondii ton c ton;c ude re ym e nz pr ope t e r is

弹性蛋白酶 ( lsa e是一种以水解不溶 E a ts )性弹性硬蛋白 (lsi )特征的蛋白水解酶， ea t为 n 它可由动物胰脏提取或由微生物发酵制得 .目 前，弹性蛋白酶主要作为治疗高血脂症、止防

品)酪蛋白(海生化试剂公司)酸度计：,上 . P一C型，海雷磁仪器厂；7 1 HS 3上 5 Gw分光光度计，普上海分析仪

器有限公司；转式摇惠旋

床；精密恒温仪；浙江轻工业研究所； GR1— L 04 2台式高速冷冻离心机，北京医用离心 .机厂.

动脉粥样硬化的生化药物口.同时它具有广谱]蛋白水解活性，示了在食品工业中具有广阔显的应用前景和较高的商业价值 .我国该产品的

1 2培养基 .

生产是靠猪胰脏提取，由于脏器资源不足，胰弹性蛋白酶一直供不应求 .国外，用微生物发采酵技术，规模工业化生产弹性蛋白酶已取得大了巨大的进展，出现了商品化的弹性蛋白酶 .

1 2 1平板及斜面培养基 (/ . . g L)pH 7 . .0

牛肉膏

4,蛋白胨 6,酵母膏 2,Na ,琼脂 2, C15 0 12 2增殖培养基 (/ ) .. g LM gSO 4 7 2 0.1,pH 7. H O 0.

弹性蛋白 5,酵

利用微生物生产弹性蛋白酶不仅能够提供足够的治疗用药物酶，也能为开拓该酶的其它方面应用提供了充足的酶源，如肉的嫩化和动物蛋白质的水解利用等等 .16 9 2年，自 IM a d . n l和 B. h n从牙周 Co e

母膏 0 1葡萄糖 1 O21 .,,K HP ,K P 5 H O,

1 2 3初筛弹性蛋白选择性培养基 (/ ) .. g L弹性蛋白 8,葡萄糖 1,酵母膏 1 O 1,K HP,KH O 0 5 M g O 7 .,琼脂 2, P ., S H O 0 1 0pH 7 .0.

病患者的送检样品中首次分离出能产胞外弹性蛋白酶的微生物菌株 F a o a tr m ls lt lv b cei ea t y— u o iu c m]并从它的纯培养液中分离纯化出专一 i,降解弹性蛋白的菌源性弹性蛋白酶以来，相继

12 4发酵培养基 (/ .. g L)7 2 0 H O .1,pH 7. 0.

酪蛋白 3,葡 0

萄糖 4,玉米提取液 2 0,K: O:,Mg O HP 1 S 1 3培养方法 .

从细菌、菌、线菌中都分离出了产酶菌株及霉放其弹性蛋白酶 .国的研究者们自 1 9我 9 0年才开始进行微生物产弹性蛋白酶的初步研究，继相已从自然界中分离到产弹性蛋白

酶的黄杆菌。、香杆菌 l等，分离到的产酶菌都不同。芳] _ 6 但

1 3 1种子斜面及平板培养 . .2 4 h.

3 _养 7 C培

1 3 2复筛发酵培养 . .

发酵培养基 2 0mL

盛于 2 0 mL三角瓶中，种后在旋转式摇床 5接上 3￣3 C,速 1 0r ri 2 7转 8/ n,发酵培养 2 . a 4h1 3 3发酵条件研究 ..发酵培养基 2 0mL盛于 2 0mL三角瓶中， 5的接种量接种子 5按 培养基后在旋转式摇床上 3~ 3 C, 8/ 2 7 1 0 ra n培养 2 . ri 4h 1 4实验方法 .

程度地存在着一定毒性，人体存在潜在危害，对而且筛选到的菌株产酶水平较低，以实现工难业化生产 .本研究从土壤和污水中分离到一株能降解弹性蛋白且酶活较高的芽孢杆菌，初经步鉴定属芽孢杆菌属中的一个种，并对产酶条件和粗酶液性质进行了初步研究 .

1 4 1胞外弹性蛋白酶产生茵的筛选方法 ..

1材料与方法 11材 .料

采集到的样品先经增殖培养基培养 4 8h后，

稀释涂布于牛肉膏平板形成单菌落，再点种于弹性蛋白选择性培养基上进行初筛 .选择细菌分离自肉联厂附近的土壤弹性蛋白 ( ima Sg 水解弹性蛋白所形成的透明圈直径与菌径之比 1 1 1菌株 . .和污水中 .

较大的菌落进行摇瓶发酵复筛，测定发酵液弹性蛋白酶活力 .

1 1 2主要试剂和仪器 ..

公司产品 ),刚果红一性蛋白 ( ima公司产弹 Sg

1 4 2菌种鉴定方法 ..

根据《般细菌常用一

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陈启和，等

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鉴定方法》 B re’和 eg r S细菌鉴定手册第八版对试验菌属的特征进行鉴定 J . 1 4 3生物量的测定 . .生物量的测定方法采用

见文献[] 6.1 4 4弹性蛋白酶活性测定方法 . .

S c a E法并参照我国现行药用弹性蛋白酶测 a h r7定方法加以改进 .该法以与染料偶联的不溶性

底物经酶作用而溶解至水相，反应上清液的光密度反应底物被酶消化的程度 .称取 2 0mg刚果红一性蛋白溶于 1弹 mL水中，加 1 mL p .,0 2mo/的硼酸缓冲液， 1mL适 H7 4 . lL取 当稀释的酶液于 3 7 C下振荡反应 2 i 0r n,加 a入 p .、 . lL磷酸钠缓冲液 2mL终止 H6 0 0 7mo/ 反应，过滤后取上清液测 4 5n处的光密度， 9 m 以不加酶液和底物的反应系统为空白.在此反应条件下溶解 1mg刚果红一性蛋白底物所需 弹的酶量定义为一个弹性蛋白酶活性单位 ( . U) 参照 S ca方法进行制作标准曲线 . ah r芽孢杆菌属 ( a i u p ) B c lss . . l 23 .菌株 B c lss . E 3产生弹性蛋白酶 a i u p l L图 1 Ba i u p L 3菌株在 0 8的弹性 cl ss .E一 l .

蛋白平板上 4 8h培养产生的水解圈Fi g. 1 El s o y i c i iy o cl u p. EI一 t a n o a t l tc a tv t f Ba il s s 3 sr i n 0 8 . el s i g r pl t safe 8 h i c ba i n a tn a a a e t r 4 n u to

的条件

2 3 1不同碳源对产酶的影响 . .

在产酶基

础培养基中试验了浓度为 4/的 9种碳源，在 9 5

2结果和讨论2 1菌株筛选 .

摇床上培养 2 4h后，分别测菌体生物量及酶活 .果表明 ( 1,葡萄糖效果最好，其次为结表 )

果糖和糊精 .麸皮作为一种廉价的替代碳源也具有较高的产酶水平 .其可能原因是麸皮中含有促进弹性蛋白酶分泌的物质 .实验结果还发现菌体生物量与酶活间相关性不显著，中葡其萄糖和果糖、精的差别不大，虑到果糖和糊糊考

从土壤和污水中采取土样和污水 1 0余 0

份，采用增殖培养基富集培养，稀释涂布于牛肉膏蛋白胨平板形成单菌落，后挑取近 2 0 然 00个单菌落于弹性蛋白选择性平板上，培养 2~ 4

4 8 h,挑取水解圈直径与菌落直径比值大于 2 的

菌落进行摇瓶复筛.在近 20 0 0个菌落中有 1 0多株能产生弹性蛋白酶，经反复发酵复筛 8得到 1 3株产酶较稳定的菌株，取其中比值 2选大于 3的菌株复筛测酶活，其中发现 3号和 2 9

精的价格，选用葡萄糖作为后续试验碳源 .表 1不同碳源对产酶的影响Ta e l Ef e t o a i u a b n S u c s bl f c f v ro s c r o O r e o l s a e pr d t n e a t s o uc i on

号菌株产酶最高且稳定，这两菌株分别编号将为 E 3和 EL 2 . 3号菌株 2 L一一9 4h复筛酶活达到 6 mI.经过平板上 3次自然分离，酶 0U/ 其活达 1 0U/ 0 mL.该菌株在弹性蛋白平板上培养 4 8h时所形成的水解圈见图 1 .我们选取 3 号作为下一步研究的菌株 .2 2菌株鉴定 .

E 3菌的形态特征为杆状，成芽孢， L一形芽

孢椭圆或柱状，中生或近端生，鞭毛，荚膜，有无平板生长菌落不规则状 .生理生化反应为革兰氏阳性，触酶阳性，氧，酵产酸，鉴定属接好发经 2 3 2不同氮源对菌体生物量及产酶的影响 . .在基础培养基中分别加入 3/的不同种类氮 i 9

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源，培养 2 4h后，菌体生物量及酶活 .结果测表明 ( 2,黄豆饼粉效果最佳，其次为酪蛋表 )白.多研究已发现，许多数能分泌胞外蛋白酶的

对上述试验结果进行分析可知：第 9个①处理组合为最优组合，在基础培养基中，即以 6的葡萄糖、的豆饼粉和 0 1的玉米提 5 .

菌株，有机氮源上都可以良好生长.酪蛋白在而仅能提供部分营养，饼粉不仅能提供丰富的豆氮源，能供给较多的 B族维生素和微量元还素 .实验结果还表明，机氮源不利于菌株产从无弹性蛋白酶，原因可能是使用的无机氮源属其于生理酸性或碱性盐类，影响产酶环境的而 p,起细胞生长与产酶环境的剧烈变化 . H引表 2不同氮源对产酶的影响

Ta l Ef e t o a i us nir g n s ur e be2 f c f v ro t o e o c s o ls a e p o c in n e a t s r du to

取液为生长因子时酶活力最高； 3个因子中，② 葡萄糖对产酶影响最大，次是豆饼粉，长因其生子的影响最小，明该菌可能具有合成生长因说

子的能力；在 3个因素的不同处理水平之间③可知其最佳处理组合为葡萄糖 6、饼粉 豆

5、米提取液 02 .具体分析结果见表 3 玉 . .2 3 4摇瓶装量对产酶的影响 ..在 2 0mL 5

三角瓶中装入 2 0mL、 0mL、 0mL、 0mL、 3 4 5 6 0mL上述优化的产酶培养基 .从实验结果可知，酶活分别为 1 0 1 6 9、 1 7 mL,其 1、 0、 1 8、 4U/

随着摇瓶装液量的降低，产酶水平逐渐升高，其 2 0mL时产酶水平最高.考虑到再降低培养基装量会带来较大的实验误差，此选用 2 因 0mL为发酵培养基的装量 .2 3 5初始 p的影响 .. H加∞∞∞∞加 0

采用不同初始 p H

的发酵培养基进行研究，发现当培养基的初始

p为 7 5时产酶活力和生物量最高 ( 2 .说 H .图 )明在中性偏碱性的环境下有利于酶的分泌.

2 3 3碳源、源和生长因子的合适浓度对产 . .氮

酶的影响

在基础培养基中，葡萄糖、饼用豆

粉和玉米提取液进行正交试验 (。, L 3 )以求得三者较适浓度 .表 3三因子正交 (,试验结果和分析结果 L3)Tab e 3 Re uls o t o n lde i n ofe e i nt( 3 ) l s t for h go a s g xp rme L9。

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嘲

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图 2培养基初始 p t对发酵产酶影响 tFi g. 2 Efe tofi t a e i m H n e a t s r d to f c n i l m du p o l s a e p o uc i n

2 3 6菌株产酶过程 . .

采用上述的适宜发

酵条件进行产酶过程的研究 .从培养 6h时开 始取样测定酶活力和生物量，每隔

一定时间段测定一次，结果见图 3其 .从图 3可知，该菌株在 1 2 h开始产酶，至 2 4 h时开始大量产酶，

到 3 5h时达到产酶的高峰，随后缓慢下降 .而生物量随发酵时间的变化而与弹性蛋白酶的活性呈现一定的正相关性 .但生物量在培养 1 8h

时突然升高，到第一个高峰，达随后又下降， 4 2

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陈启和， 等∞∞们∞∞∞∞们∞ 0

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的作用，提供一部分碳源和氮源，致菌株出还导现多次生长变化 .

曼蜒避

∞∞

3粗酶性质的研究 蛔l

皿

陋

3 1酶反应的最适温度和 p . H

秧

在不同温度下测定酶活力，果见图 4A结一其最适反应温度为 5 O℃.在不同 p下测定酶 H发酵时间/ h

活力，果见图 5A,最适作用 p为 7 4结一其 H ..3 2酶的热稳定性 .

图 3 B cl ss .E a i u p L3产酶曲线 lFi . 3 Co s f e a t s o uc i r m g ur e o l s a e pr d ton f os r i a il ss t a n B c l u p. EL 3

将经离心后的酶液和 0 2mo/硼酸缓冲 . lL液 ( H7 4在不同温度下保温 3 n后冰浴， p .) 0mi 迅速在 3 7℃下测定剩余酶活，以未经保温的酶

h时又逐渐上升，酶活的变化不一致，可能与其原因是发酵培养基中存在着复杂的碳源成分，其是玉米浆不仅能提供生长因子尤

液为 10 0%计，算相对酶活，果见图 4 B该计一.∞∞∞∞结 0酶在 4℃以下稳定性良好， 5℃下 3 n严 O 5 0mi重失活，O 6 C活力全部丧失 .

《!} g靛

2 O

3 o

4 0

5 o

6 o

7 O

8 0

℃

图 4弹性蛋白酶的最适作用温度 (和热稳定性 ( A) B)Fi 1 The o i lt m p r t r ( )a d t e ma t b lt ( g ptma e eaue A n h r ls a iiy B)o l s a e fea ts

10 0 8 0

《

饕

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4 0罂2 O O

7

8

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7

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p H

p H

图 5弹性蛋白酶的最适作用 p A)酸碱稳定性 ( H(和 B)Fi 5 The o i lpH ( )a H t bi t ( g. ptma A nd p s a l y B)o l s a e i fea t s

3 3酶的酸碱稳定性 .

将酶液稀释于 0 2mo/的不同 p的缓 . lL H冲液 ( H4 0 5 8 0 2 mo/乙酸一酸钠； p .~ ., . lL乙

p .~ 7 0 0 2mo/的磷酸氢二钠一酸二 H6 O .,. lL磷氢钠； H7 4~ 9 0 0 0 lL硼砂一 0 2 p . ., . 5 mo/ .mo/ lL硼酸 )于室温 ( 8 2, 1￣ 0℃ )放置 1 下 8h,

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取出后立即置于冰浴中，用 0 2mo/的硼酸 . lL

固醇代谢与排泄，活脂蛋白脂酶等改善脂质激代谢的作用 .此外，食品工业、境保护和化在环妆品生产上具有广泛的应用前景 .目前该酶在 E本已实现微生物工业化生产，且已克隆了 l而相关的微生物基因，在大肠杆菌中得到了表并达，表达产量还不高 .在国内，酶仅从脏器但该中提取，本高，量有限，制了该酶的广泛成产限应用.

缓冲液调 p至 74 H .,再测定酶活，以 p . H7 4时的活力为 1 0计，计算相对酶活，图 5 0见一 B,知该酶在碱性范围内较稳定，这与已报道可的芽孢杆菌产弹性蛋白酶一致 .其可能解释是碱性环境最有利于刚果红一性蛋白上负电离弹子的形成和弹性蛋白酶对底物的结合和降解 . 3 4金属离子和螯合剂对酶活的影响 .

在测定酶活的反应体系中添加不同的金属离子至终浓度 0 3mmo/考察它们对酶活 . lL,性的影响 .结果表明，该浓度下，属离子在金 A1、 u、 n严重抑制酶的活性， F抖、抖 C抖 Z而 eRef r e enc s: e

[1] YAN Z ig GUAN oxo g(子颖，国雄 ) i n, y Gu— in颜关 .St dy n dv c me

fe a t s r u i g a an e nto l s a e f om i r o ga i m M c o r ns

E] Chns o ra f Mirboo y(生物学通报 ) J . ieeJ u n lo co i g微 l,1 91 1 6): 5 3 9 i 9, 8( 3 6 5 .( n Chi e e) n s

K L能提高酶的活力， a在该浓度下对 、 i C酶活没有激活作用，原因可能是钙离子浓度其太低，足以起激活作用 .ED不 TA能抑制酶活力 .这与国外已经报道的芽孢杆菌产生弹性蛋白酶的酶性质有所区别，别是 F抖对酶活的特 e影响.

[2] Ma d lC h n B ceilElsa e IIoain P r i n a, o e . atr a ts ..s lt, u i— a o fc t n P o e t s[] Ar h B o h m o h s 1 6, ai, rp ri J . o e c . ic e Bi y, 9 0 p9 1: 4— 3 7 5 .

[3] C u,CHEN Yu n AO J n a,LI ifn —a g,e a. (军， Gu t 1曹 陈源，桂芳， ) td nP o u ig Ea ts t李等 .S u yo rd cn lsaewi h Mioo g ns -] c r ra imI .J.M i oilg微生物学杂志 ) J c booy( r,1 96, 6( 9 1 3):— 2.(n Ch n s ) 9 1 i i e e

4结论 本研究从特殊环境中分离到一株产中性弹

[4]

Th n t ue o irboo y,C iee Ac d my o e Isi t fM co ilg t hn s a e fS in e Th d ni i t n M e o oo y f r Ge e a ce c . e I e t c i t d lg o n r l f ao h

B c roo y[]. ej g S ine rs, 9 8 9— a t ilg M e B in: c e c P e s 1 7 . 8 i1 93 .

性蛋白酶的芽孢杆菌，其初步酶活达 1 0U/ 0 mL,培养基优化后酶活达到 1 0U/经 2 mL,比国内报道的酶活要高，首次分离到产弹性蛋且白酶的芽孢杆菌，有工业化生产前景和应用具

[5]

P trH A, n ah Ni oa, i,e 1 B r e S ee S et

c ls S Mar la. egy’ h

Ma u lo ytmai cei o yE . ej g: c— n a S s f e t Batro g M] B in S i c l ien e Pr s 1 8 . aC e s, 9 4 - _

[6] YAN i ig, Z n GUAN Gu— in y o xo g,Z HANG We— i,e i n t q(子颖，国雄，张维钦， ) t de n E a ts 颜关等 .S u i o lsa e sFr m Fl v a t rum:S r i s r e i g n e z m e o a ob c e i t a n c e n n a d ny

的潜力 .对该酶的性质进行了初步研究，发现酶的酸碱特性、度特性以及激活或抑制特性温

p r i t nE] AcaM i o oo iaSiia微生物学 u ic i J . t c b lg c nc ( fa o ri报 ) 1 9, 5 1: 0 5 . i Ch n s ), 9 5 3 ( ) 5— 7 (n ie er7] Sa h rL c a A. Ph t m e rc me h d f re tma in o— o o ti t o o s i to fe

都与以前报道的弹性蛋白酶不一致 .弹性蛋白 酶是一种经济价值较高的蛋白酶种，为生化作药物，可参与机体内血管弹性纤维蛋白代谢它和维持血管弹性等重要功能，时具有促进胆同

lsaeatvt J .Prc o .Ex ei B o. Me a ts cii E] y o .S c p t. i1 d,】 5 9:2 . 9 5, 0 3 3

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/jkgj.html