消毒技术规范(2008年版)

消毒技术规范目录

第一部分 总 则

1.1 引言............................................................................................................................................ 1 1.2 适用范围 ..................................................................................................................................... 1 1.3 术语............................................................................................................................................. 1 1.4 消毒产品功效检验的基本原则和要求 ..................................................................................... 3 1.4.1 消毒产品检验基本要求 .......................................................................................................... 3 1.4.2 消毒产品理化检验基本要求 .................................................................................................. 7 1.4.3 消毒产品毒理学实验基本原则 .............................................................................................. 8 1.4.4 医疗卫生机构消毒、灭菌基本要求 ...................................................................................... 9 1.4.5 疫源地消毒基本要求 ............................................................................................................ 12

第二部分

消毒产品检验技术规范

2.1 消毒产品消毒效果检验技术规范 ........................................................................................... 15 2.1.1 消毒剂杀微生物试验 ............................................................................................................ 15 2.1.2 消毒剂模拟现场和现场消毒鉴定试验 ................................................................................ 43 2.1.3 空气消毒效果鉴定试验 ........................................................................................................ 53 2.1.4 水的消毒效果鉴定试验 ........................................................................................................ 56 2.1.5 灭菌与消毒器械消毒功效鉴定试验 .................................................................................... 62 2.1.6 灭菌与消毒指示器材鉴定试验 ............................................................................................ 75 2.1.7 灭菌医疗用品包装材料鉴定试验 ........................................................................................ 80 2.1.8 抗（抑）菌试验 .................................................................................................................... 83 2.1.9 一次性使用医疗用品产品细菌和真菌污染的检测 ............................................................ 94 2.1.10 隐形眼镜护理液鉴定试验 .................................................................................................. 99 2.1.11 一次性使用卫生用品鉴定试验 ........................................................................................ 102 2.2 消毒产品理化检验技术规范 ................................................................................................. 109 2.2.1 消毒产品原料或单方制剂的测定法 .................................................................................. 109 2.2.2 复方消毒产品有效成分含量测定的指导原则 .................................................................. 123

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2.2.3 消毒产品稳定性测定 .......................................................................................................... 124 2.2.4 消毒剂对金属腐蚀性的测定 .............................................................................................. 124 2.3 消毒产品毒理学实验技术规范 ............................................................................................. 126 2.3.1 急性经口毒性试验 .............................................................................................................. 126 2.3.2 急性吸入毒性试验 .............................................................................................................. 128 2.3.3 皮肤刺激试验 ...................................................................................................................... 129 2.3.4 急性眼刺激试验 .................................................................................................................. 131 2.3.5 阴道黏膜刺激试验 .............................................................................................................. 132 2.3.6 皮肤变态反应试验 .............................................................................................................. 134 2.3.7 亚急性毒性试验 .................................................................................................................. 135 2.3.8 致突变试验 .......................................................................................................................... 136 2.3.9 亚慢性毒性试验 .................................................................................................................. 146 2.3.10 致畸胎试验 ........................................................................................................................ 147 2.3.11 慢性毒性试验 .................................................................................................................... 148 2.3.12 致癌试验 ............................................................................................................................ 149 2.3.13 毒理学试验结果的最终判定 ............................................................................................ 150

第三部分

医疗卫生机构消毒技术规范

3.1 消毒与灭菌方法 ..................................................................................................................... 152 3.2 手术器械和用品的灭菌 ......................................................................................................... 168 3.3 输注器材的灭菌 ..................................................................................................................... 169 3.4 一般诊疗用品的消毒 ............................................................................................................. 170 3.5 内镜的消毒灭菌 ..................................................................................................................... 171 3.6 医务人员手的消毒 ................................................................................................................. 173 3.7 皮肤与黏膜的消毒 ................................................................................................................. 174 3.8 医院室内空气的消毒 ............................................................................................................. 175 3.9 餐具和卫生洁具的消毒 ......................................................................................................... 176 3.10 物体和环境表面消毒 ........................................................................................................... 178 3.11 检验相关物品的消毒 ........................................................................................................... 179 3.12 口腔诊疗器具与环境的消毒与灭菌 ................................................................................... 182 3.13 织物的消毒 ........................................................................................................................... 183 3.14 污水的消毒处理 ................................................................................................................... 184

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3.15 污物的消毒处理 ................................................................................................................... 188 3.16 尸体及其相关环境的消毒 ................................................................................................... 192 3.17 医院消毒灭菌的效果监测 ................................................................................................... 194

第四部分 疫源地消毒技术规范

4.1 常用消毒方法 ......................................................................................................................... 206 4.2 消毒面积与体积的测算 ......................................................................................................... 206 4.3 消毒剂的应用 ......................................................................................................................... 207 4.4 紫外线强度及消毒剂浓度简易测定法 ................................................................................. 211 4.5 各种污染对象的常用消毒方法 ............................................................................................. 212 4.6 疫区饮用水的消毒与管理 ..................................................................................................... 214 4.7 疫源地消毒效果的微生物学评价 ......................................................................................... 216 4.8 各种传染病疫点消毒要求 ..................................................................................................... 218 附录A消毒试验用试剂和培养基配方 ........................................................................................... 226 附录B疫点终末和随时消毒工作记录表 ....................................................................................... 233

1 总 则

General Principle

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1.1 引言

根据《中华人民共和国传染病防治法》和卫生部《消毒管理办法》制订本规范。 1.2 适用范围

本规范适用于消毒产品申报和监督时为评价其安全性、有效性和理化特性而开展的检测活动及与检测活动相关的实验条件的控制。 1.3术语

1.3.1 消毒 disinfection

杀灭或清除传播媒介上病原微生物，使其达到无害化的处理。 1.3.2 灭菌 sterilization

杀灭或清除传播媒介上一切微生物的处理。 1.3.3 化学指示物 chemical indicator

利用某些化学物质对某一杀菌因子的敏感性，使其发生颜色或形态改变，以指示杀菌因子的强度（或浓度）和/或作用时间是否符合消毒或灭菌处理要求的制品。 1.3.4 生物指示物 biological indicator

染有一定量的特定微生物，用于指示消毒或灭菌效果的制品。 1.3.5 消毒剂 disinfectant

用于杀灭传播媒介上的微生物使其达消毒或灭菌要求的制剂。 1.3.6 有效氯 available chlorine

有效氯是衡量含氯消毒剂氧化能力的标志，是指与含氯消毒剂氧化能力相当的氯量（非指消毒剂所含氯量），其含量用mg/L或%浓度表示（有效碘及有效溴的定义和表示法与有效氯对应）。 1.3.7 中和剂 neutralizer

在微生物杀灭试验中，用以消除试验微生物与消毒剂的混悬液中和微生物表面上残留的消毒剂，使其失去对微生物抑制和杀灭作用的试剂。 1.3.8 中和产物product of neutralization

中和剂与消毒剂作用后的产物。

1.3.9 菌落形成单位 colony forming unit，cfu

在活菌培养计数时，由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落，称为菌落形成单位，以其表达活菌的数量。 1.3.10 自然菌 natural bacteria

本规范指存在于某一试验对象上非人工污染的细菌。 1.3.11 存活时间 survival time，ST

用于生物指示物抗力鉴定时，指受试指示物样本，经杀菌因子作用后全部样本有菌生长的最长作用时间（min）。

1.3.12 杀灭时间 killing time，KT

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用于生物指示物抗力鉴定时，指受试指示物样本，经杀菌因子作用后全部样本无菌生长的最短作用时间（min）。 1.3.13 D 值 D value

杀灭微生物数量达90%所需的时间（min）。 1.3.14 杀灭对数值killing log value

当微生物数量以对数表示时，指消毒前后微生物减少的对数值。 1.3.15 杀灭率 killing rate，KR

在微生物杀灭试验中，用百分率表示微生物数量减少的值。 1.3.16 灭菌保证水平 sterility assurance level，SAL

灭菌处理后单位产品上存在活微生物的概率，通常表示为10，本规范规定为10，即经灭菌处理后，每件物品中有菌生长的概率是1/10。 1.3.17 无菌检验 sterility testing

为明确灭菌后的物品中是否存在活微生物所进行的试验。 1.3.18 生物负载 bioburden

被测试的一个单位物品上承载活微生物的总数。 1.3.19 暴露时间 exposed time

消毒或灭菌物品受到消毒因子作用的时间，又称作用时间、处理时间。 1.3.20 载体 carrier

试验微生物的支持物。 1.3.21 满载 fully loaded

厂家说明书规定的最高装载量和摆放方式。

1.3.22 灭菌过程验证装置 process challenge device，PCD

对某一灭菌过程构成特定抗力的装置，用于评价该灭菌过程的有效性。 1.3.23 抗菌antibacterial

采用化学或物理方法杀灭细菌或妨碍细菌生长繁殖及其活性的过程。 1.3.24 抑菌bacteriostasis

采用化学或物理方法抑制或妨碍细菌生长繁殖及其活性的过程。 1.4 消毒产品检验的基本要求 1.4.1 实验室要求

开展消毒产品检测的检测机构应该通过实验室资格认定，其认定的检测项目应该涵盖消毒产品检测项目。消毒产品申报卫生部卫生许可批件时，应该在卫生部授权的检测机构进行检测。

消毒实验室应按《微生物实验室生物安全管理条例》管理，符合GB 19489《实验室生物安全通用要求》的条件，进行致病微生物包括分枝杆菌、黑曲霉菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和脊髓灰质炎病毒的消毒学试验时或检测现场标本时，应在生物安全Ⅱ级以上的实

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验室内进行，并符合国家有关生物安全的标准。实验室应采取封闭式布局，便于清洁、消毒。无菌检验必须在 100 级洁净度的实验室或 100 级层流操作柜中进行。

容量分析实验室工作温度应控制在 20℃～25℃。 毒理实验室应该为ABSL-Ⅱ级或高于此要求。 1.4.2 人员要求

消毒产品检测的实验室人员应该是经过实验操作技术培训的专业人员。

实验审核人员应该具有中级职称、五年以上的消毒产品检测经历并经过专门培训。 实验室技术负责人和质量负责人应该具有高级职称，五年以上的消毒产品检测经历并经过专门培训。 1.4.3 受理要求

对申报卫生部卫生许可批件的国产消毒产品，检验机构应该只受理由生产企业所在地的卫生监督部门现场抽样并封样的样品，发现封签破损或其他异样情况导致封样无效时，应不予受理。

对申报卫生部卫生许可批件的进口消毒产品，检验机构受理时应该查验并留存消毒产品生产地所在国的销售证明和经我国海关验证的报关单底单。留存的销售证明和报关单可以为送检单位盖章认可的复印件。

检验项目由送检单位决定。受理样品数量应满足各项检测需要，发现数量不足时应该拒绝受理。因不可预知的原因，试验中确实需要补充样品数量时，送检单位应该按规定重新送样并在检验申请中说明理由，检验机构应重新受理，重新编排受理号。

受理时应同时要求送检单位提供盖章认可的产品说明书、配方、研制报告等材料。盖章认可的说明书应该与每件样品的说明书完全一致。受理后发现按说明书无法完成检验项目时应停止检测并向送检单位说明理由。 1.4.4 消毒效果检验要求 1.4.4.1 无菌操作要求

（1）试验开始前，应以湿式方法清洁台面和打扫室内地面。

（2）实验人员应穿戴工作服、防护鞋、口罩、帽子，进行无菌检验时，需经风淋后进入实验室，然后，正确穿戴好无菌隔离衣、鞋套、帽子和口罩。

（3）每吸取一次不同样液应更换无菌吸管，接种环（针）需在火焰上烧灼灭菌后，才可再次使用，也可用一次性使用的无菌吸管和接种环（针）。

（4）要求无菌的试剂，如蒸馏水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、培养基、标准硬水、中和剂等，均需灭菌。

（5）无菌器材和试剂，使用前须检查容器或包装是否完整，有破损者不得使用。 （6）正在使用的无菌器材和试剂不得长时间暴露于空气中。

（7）重复使用的器材，使用后应立即放入盛有消毒液的容器中，一次性使用的器材使用后应立即放入感染性废物收集袋中。

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（8）若不慎发生微生物培养物打碎或试验微生物其他泄漏事故时，不论是否具有致病性，均应立即停止手中工作，对污染及可能波及的区域进行消毒处理。

（9）全部试验结束后，应对室内环境进行消毒处理。 1.4.4.2 检测要求

（1）消毒学试验分为实验室试验、模拟试验和现场试验三个阶段。

（2）实验室试验以悬液定量试验为主，试验应重复 3 次。对不适宜用悬液定量试验评价的消毒剂，如粘稠的消毒剂、冲洗用消毒剂和原液一次性使用的消毒剂等的实验室试验用载体定量试验，试验应重复 3 次。无特殊要求的情况下，载体定量试验以布片为载体，用途单一、明确的可以选用对应的玻璃片、不锈钢片、滤纸片等。评价消毒剂的实验室试验，消毒剂试验浓度需用产品说明书规定的该消毒剂对某一有代表性消毒对象的最低使用浓度。试验设 3 个不同作用时间，原则上第一时间为说明书规定的最短作用时间的 0.5 倍，第二时间为最短作用时间，第三时间为最短作用时间的 1.5 倍。对多用途的消毒剂，消毒对象所涉及的微生物相同时，若使用浓度相同，选择各种用途中最短的作用时间。若作用时间相同，选择各种用途中最低的使用浓度。使用浓度低、作用时间短者与使用浓度高、作用时间长者同时存在时，以前者为准。使用浓度高、作用时间短者与使用浓度低，作用时间长者同时存在时，每个剂量均须进行试验。

消毒器械产生的化学杀微生物因子的试验要求同消毒剂。对于冲洗用化学消毒因子可以用载体流动浸泡试验。如为物理杀微生物因子，试验一般用载体定量试验，在无特殊要求的情况下，以布片为载体。用途单一、明确的可以选用对应的玻璃片、不锈钢片、滤纸片等。试验重复3次。

灭菌试验应用载体定性试验，普通医疗器械的灭菌以不锈钢片为载体，特殊用途的可以选用玻璃片、聚四氟乙烯片等。灭菌试验按产品说明书规定的最低使用浓度（强度）和 0.5 倍的最短作用时间进行试验。载体定性试验应重复 5 次，载体数量应不小于 30 个，每次试验均应该设立规定数量的阴性对照和阳性对照。

（3）消毒模拟现场或现场试验，以使用说明书的最低有效浓度（强度）和最短作用时间进行试验，试验应重复3次。每次试验均应该设立规定数量的阴性对照和阳性对照。

（4）灭菌模拟现场或现场试验，以使用说明书的最低使用浓度（强度）和0.5倍的最短作用时间进行试验，消毒器械的灭菌试验应重复5次，消毒剂的灭菌试验应试验60个样本，至少重复3次。每次试验均应该设立规定数量的阴性对照和阳性对照。

（5）在对消毒剂进行监督监测时，定量杀菌试验以说明书规定的最低浓度和最短时间验证其消毒效果。对用于灭菌的消毒剂则以说明书中规定的使用浓度和其 0.5 倍的作用时间验证其灭菌效果。

（6）鉴定和监测多用途消毒剂与消毒器械消毒效果时，现场或模拟现场试验的消毒对象原则上是在类似物品中最难达到消毒合格者，如医疗器械消毒或灭菌选用止血钳齿端；皮肤消毒选用人体前臂屈面皮肤；织物消毒选择棉布；一般物品表面（包括木质、塑料、橡胶、玻璃）消毒

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选用木质表面；餐具消毒选用竹（木）筷，不用于筷子消毒的可选用瓷质碗盘；瓜果蔬菜消毒选用黄瓜；地面消毒选择水泥地面；手消毒选择五指屈面；对于特指消毒对象而又在上述物品中不能选出有代表性物品时，则需用该特指对象进行试验。

（7）进行实验室试验和模拟现场试验时，对用于经过清洗或较清洁的消毒对象的消毒剂，有机干扰物牛血清白蛋白的浓度为 0.3%，对用于不经过清洗或较脏的消毒对象的消毒剂，有机干扰物牛血清白蛋白的浓度为 3.0%。 1.4.4.3对重复试验的要求

重复性试验不是只在同次试验中增加菌片数，或多作几份样本，而是应分期分批进行。必要的器材和试剂应重新制备或灭菌，以防产生系统性误差。 1.4.5 理化检验要求

1.4.5.1 标准品的纯度≥99.0%，对照品的纯度应采用最高纯度的试剂，也可使用标准品或对照品进行标定过的标准溶液作为含量测定的对照物。

1.4.5.2 以滴定法分析有效成分时，滴定液用量不得超过滴定管所标示的量。本规范规定滴定时所取样本的质量或容量（包括浓度），均根据此原则设定。若所测消毒剂浓度过高，可适当减少取样量或稀释后测定；若消毒剂浓度过低，可增加取样量或采用灵敏度更高的方法进行测定。 1.4.5.3 有效成分含量以法定计量单位表示。复方消毒剂以其杀菌主要有效成分含量表示；植物消毒剂以百分浓度表示，如1份原液加4份水即该消毒剂溶液的浓度为20%。溶液或消毒剂的有效成分含量的表示，以mg/L或mg/kg为主。采用百分数表述含量时有下列2种含义：①液体和液体之间为体积百分数，用“%”表示，即100mL溶液中含溶质若干毫升，或100mL消毒剂中含有效成分若干毫升；②固体和固体之间为质量百分数，用“%”表示，即100g消毒剂中含有效成分若干克；对固体和液体之间采用质量浓度表示（mg/L、g/L等），即1L溶液中含溶质若干毫克或克，或1L消毒剂中含有效成分若干毫克或克等。

1.4.5.4 本规范中所列试剂的纯度涉及基准、分析纯、化学纯及色谱纯等，未作专门说明者，一般采用分析纯。配制滴定液试剂（如硫代硫酸钠）因配制后尚需专门处理，亦可用化学纯。 1.4.5.5 本规范中，“滴定液”是指经过标定，浓度准确至 0.001mol/L～0.0001mol/L 的溶液。未经浓度标定者则称“溶液”，以示区别。摩尔（mole，mol）为物质量的单位，当分子、原子或其它粒子等的个数约为 6.02310时即为 1mol。本规范中滴定液浓度的计算，除碘滴定液按原子量计算外，其它滴定液均按分子量计算。

1.4.5.6 滴定液的标定及所有样品测定均平行进行两次。将滴定管中滴定液补足至全量后滴定。所有试验结果（包括消毒剂有效成分测定及滴定液标定）应当以空白试验校正。所使用的滴定液应按要求在有效使用期内使用。

1.4.5.7 粉剂和片剂的取样量为测定所需量的10倍以上，经研磨后精确称取适量样品进行测定。 1.4.5.8 如果选用色谱法或分光光度法，进行方法可靠性论证时应附空白样品（不含被测成分的其它成分所构成的样品）、模拟样品（空白样品加有效成分的标准品）以及待测样品的色谱图或

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光谱图。如果无法提供空白样品，可用加入标准量法进行方法可靠性的论证。

1.4.5.9 对理化检测方法检出限和定量下限的要求。检出限为被测物能被检出的最低量。定量下限为能够对被测物准确定量的最低浓度或质量，称为该方法的定量下限。检出浓度为按规范方法操作时，方法检出限对应的被测物浓度。最低定量浓度为按规范方法操作时，定量下限对应的被测物浓度。

常用检验方法的检出限和定量下限的计算可参考表1-1。

表1-1 检出限及定量下限的定义

检验方法 AAS/AFS GC HPLC 分光光度法 容量法

1.4.5.10对于本规范中测定方法不适用的产品，有效成分的测定，由厂家提供检测方法及方法可靠性的论证报告，经检验机构认可后方可采用。

1.4.5.11 样品的重量测定用秤重法，天平的精度应为测定样品重量的1% 以上。

1.4.5.12 对消毒剂测定一个批号，3 个样品，每个样品平行测定 2 次。对消毒器械的杀菌因子强度应该测定强度曲线，该曲线应能反映消毒器械消毒灭菌全过程杀菌因子强度的变化趋势。 1.4.5.13 玻璃仪器清洗干净，用蒸馏水冲洗 3 遍。所用容量瓶和量筒等不能加热，对仪器设备应进行计量检定。 1.4.6 毒理学实验要求

1.4.6.1 消毒产品毒理学实验评价程序

消毒剂安全性毒理学评价，可分为4个阶段。

第一阶段 包括急性经口毒性试验、急性吸入毒性试验、皮肤刺激试验、急性眼刺激试验、阴道黏膜刺激试验和皮肤变态反应试验等。

第二阶段 包括亚急性毒性试验和致突变试验。后者包括体外哺乳动物细胞基因突变试验 （L5178Y 细胞基因突变试验，V79 细胞基因突变试验）、体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 （体细胞染色体水平，体外试验）、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验 （体细胞染色体水平，体内试验）、哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验 （体细胞染色体水平，体内试验）、程序外 DNA 修复合成试验 （DNA水平，体外试验）、小鼠精子畸形试验（性细胞基因和染色体水平，体内试验）、睾丸生殖细胞染色体畸变试验 （性细胞染色体水平，体内试验）、小鼠精原细胞染色体畸变试验和小

检出限（对应的质量、浓度） 定量下限（对应的质量、浓度）

3 SD 3倍空白噪音 3倍空白噪音 0.005 A X+3 SD

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10 SD 10倍空白噪音 10倍空白噪音 0.015 A X+10 SD

注：* X为在终点附近出现可察觉变化的最小试剂体积的平均值。

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鼠精母细胞染色体畸变试验等。

第三阶段 包括亚慢性毒性试验和致畸胎试验等。 第四阶段 包括慢性毒性试验和致癌试验等。 1.4.6.2 毒理学试验受试物

（1）在急性经口毒性试验、急性吸入毒性试验、亚急性毒性试验、致突变试验、亚慢性毒性试验、致畸胎试验、慢性毒性试验和致癌试验时，一般采用消毒剂原形样品。消毒剂原形是指在销售过程中原包装的粉剂、片剂或原液。对于二元或多元包装的消毒剂，以按说明书规定的比例配制后作为消毒剂原形。

（2）在皮肤刺激试验、急性眼刺激试验和阴道黏膜刺激试验中所用受试物的浓度，通常是对皮肤、黏膜消毒时应用浓度的 5倍。使用原形（原液）对皮肤、黏膜进行消毒的消毒剂，则采用消毒剂原形（原液）作为试验受试物，不需对消毒剂原形再进行浓缩。

（3）在皮肤变态反应试验时，采用的诱导浓度应为引起皮肤刺激反应的最低浓度或原液，激发浓度应为不引起皮肤刺激反应的最高浓度或原液。 1.4.7 检测记录要求

实验室对所进行的试验，应认真观察试验结果，按实验室资格认定和/或实验室认可的要求作好原始记录。为使记录规范化，一般用表格方式记录，表格中应包括样品名称与编号、检验日期、检测项目、检测依据、试验条件、使用仪器编号、观察结果、试验者和校核者签名等栏目。表格中每一栏目应用蓝黑或碳素墨水逐项填写。一次试验填写一份表格。原始记录数据和计算应及时校核，整理装订附于检验报告后，入档保存备查。 1.4.8 检测报告要求

检测报告必须逐项报告清楚，凡检验方法在本规范和有关标准中未列出者，必须详细描述。 消毒灭菌效果的结果部分用表格将各试验组、阳性对照、阴性对照及其他对照组的数据列出，定性试验的对照可用文字加以说明。试验组应列出其杀灭对数值，杀灭效果合格时，杀灭对数值无须列出具体数值，用大于等于某一规定值表示；当杀灭对数值小于某一规定值时，则应列出具体杀灭对数值。并用文字简要叙述所得的结果。检验报告的结论部分，应根据试验结果得出明确的结论。此外，对试验中出现某些异常现象亦应加以说明。 1.4.9 检测结果评价

消毒效果试验、理化检验和毒理学实验均符合要求时可以认为该产品检测合格。 1.4.9.1 理化检验结果评价

符合下列条件的消毒产品认为理化检验合格：

（1）消毒剂有效成分符合我国允许的消毒剂组分，不含有抗生素、激素等各种处方药成分和卫生部规定的禁用物质。

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（2）用于皮肤黏膜消毒的消毒剂限量成分符合要求；用于饮用水、食品和餐饮具消毒的消毒剂其有毒有害成分在使用浓度下符合有关标准的限量要求；消毒器械产生的有毒有害物质符合有关标准和规范的限量要求。

（3）消毒剂的成分与申报的配方一致。在产品有效期内，有效成分含量及其变化应在规定的范围内。

（4）最小样品单位间的重量误差小于5%，主要有效成分含量误差小于10%。

（5）用于金属物品消毒的消毒剂对金属基本无腐蚀性，偶尔接触金属物品的消毒剂如果存在金属腐蚀性时在标识中应有警示。

（6）消毒剂的pH值在合理的范围内，并与企业标准一致。 1.4.9.2 消毒效果试验结果评价

符合下列所有相应条件的消毒产品认为消毒效果试验结果合格： （1）去除残留消毒剂效果的鉴定试验合格。 （2）消毒产品的实验室试验结果符合下列相应条件：

a.悬液定量试验时，每次试验对细菌繁殖体和细菌芽孢如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、白色葡萄球菌、枯草杆菌黑色变种芽孢的杀灭对数值≥5.00，对龟分枝杆菌脓肿亚种、白色念珠菌和黑曲霉菌的杀灭对数值≥4.00，对病毒的灭活对数值≥4.00。对照组微生物数在规定的范围内。

b.载体定量试验和载体流动浸泡试验时，每次试验对各类微生物的杀灭对数值或灭活对数值≥3.00，对照组微生物数在规定的范围内。载体定性试验时，各次试验所有载体相应细菌芽孢均无生长，对照组微生物数在规定的范围内。

（3）消毒模拟现场试验时，各次试验对试验微生物的杀灭对数值≥3.00，对照组微生物数在规定的范围内。灭菌模拟现场试验时，各次试验所有载体相应细菌芽孢均无生长，对照组微生物数在规定的范围内。

（4）现场试验时，对消毒对象上自然菌的平均杀灭对数值≥1.0。

（5）消毒产品用于饮用水消毒时，消毒效果的评价按《生活饮用水卫生监督管理办法》进行。

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2 消毒产品检验技术规范

Technical Standard for Testing Disinfection Products

2.1 消毒剂消毒与灭菌效果验证试验 2.1.1 适用范围

适用于消毒剂的消毒效果的许可检验和监督监测。 2.1.2 菌悬液与菌片的制备 2.1.2.1 适用范围

制备消毒剂杀菌试验用菌悬液与菌片，以供消毒剂杀菌试验时使用。也适用于本规范中其他消毒学试验所用菌悬液与菌片。 2.1.2.2 实验器材

（1）实验菌种 金黄色葡萄球菌ATCC 6538、铜绿假单胞菌ATCC 15442、大肠杆菌 8099、枯草杆菌黑色变种ATCC 9372、白色葡萄球菌 8032。在上述规定的菌株基础上，根据消毒剂特定用途或试验特殊需要，还可增选其他菌株

（2）有机干扰物 见附录A （3）磷酸盐缓冲液 见附录A （4）无菌蒸馏水或其他纯化水 （5）稀释液 见附录A

（6）细菌培养基 营养琼脂培养基，营养肉汤培养基，见附录A （7）革兰染色液 见附录A （8）芽孢染色液 见附录A （9）恒温水浴箱 （10）玻璃漏斗

（11）刻度吸管（1.0mL、5.0mL、10.0mL），毛细吸管

（12）移液器（10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL）及配套的塑料吸头 （13）离心机 （14）电动混匀器 （15）浊度计 （16）恒温培养箱 2.1.2.3 细菌悬液制备程序

（1）细菌繁殖体悬液的制备

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1）以无菌操作方式开启菌种管，用毛细吸管加入适量营养肉汤培养基，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0mL～10.0mL 营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置 37℃ 培养18h～24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，置 37℃ 培养 18h～24h。或从microbank中取出一粒菌珠接种于平皿上，置 37℃ 培养 18h～24h，挑取上述第 2 代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，置 37℃ 培养 18h～24h，即为第 3 代培养物。

2）取第 3～6代的营养琼脂培养基培养 18h～24h 的新鲜斜面培养物，用 5.0mL 吸管吸取 3.0mL～5.0mL 稀释液（一般用TPS，酸化水用生理盐水）加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用 5.0mL 吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混匀器混合20s，或在手掌上振打80次，以使细菌悬浮均匀。

3）初步制成的菌悬液，先用细菌浓度比浊测定法粗测其含菌浓度，然后以稀释液稀释至所需浓度。

4）细菌繁殖体悬液应保存在4℃冰箱内备用。应当天使用不得过夜。 5）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。 （2）细菌芽孢悬液的制备

1）以无菌操作方式开启菌种管，用毛细吸管加入适量营养肉汤培养基，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0mL～10.0mL 营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置 37℃ 培养 18h～24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，置 37℃ 培养 18h～24h。挑取上述第 2 代培养物中典型菌落，接种于营养肉汤培养基，置 37℃ 培养 18h～24h，即为第 3 代培养物。

2）用 10.0mL 吸管吸取 5.0mL～10.0mL 第 3～5代的 18h～24h 营养肉汤培养物，接种于罗氏瓶中营养琼脂培养基表面，将其摇动使菌液布满营养琼脂培养基的表面，再将多余肉汤培养物吸出，将罗氏瓶置 37℃ 恒温培养箱内培养 5d～7d。

3）用接种环取菌苔少许涂于玻片上，固定后以改良芽孢染色法染色，并在显微镜（油镜）下进行镜检。当芽孢形成率达 95% 以上时，即可进行以下处理。否则，应继续在室温下放置一定时间，直至达到上述芽孢形成率后再进行以下处理。

改良芽孢染色法：①用接种环取菌苔涂布于玻片上，待自然干燥，而后通过火焰加热将菌固定于玻片上。②将涂片放入平皿内，片上放两层滤纸，滴加足量的 5.00% 孔雀绿水溶液。将平皿盖好，放54℃～56℃ 条件下，加热 30min。取出，去滤纸，用自来水冲去残留液。③加0.5% 沙黄水溶液，染1min。水洗，待干后镜检。芽孢呈绿色，菌体呈红色。

4）加 10.0mL 无菌蒸馏水于罗氏瓶中，以L棒轻轻推刮下菌苔，吸出，再加入5.0mL 无菌蒸馏水冲洗培养基表面，吸出。将两次吸出的菌悬液集中于含玻璃珠的无菌三角烧瓶中，振摇5min。

5）将三角烧瓶置 45℃ 水浴中 24h，使菌自溶断链，分散成单个芽孢。 6）用无菌棉花或纱布过滤芽孢悬液，清除琼脂凝块。

7）将芽孢悬液置无菌离心管内，以 3000r/min 速度离心 30min。弃上清液，加蒸馏水吹吸

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使芽孢重新悬浮，本步骤重复3遍。

8）将洗净的芽孢悬液放入含适量小玻璃珠的三角烧瓶内，80℃水浴10min（或60℃ 30min），以杀灭残余的细菌繁殖体。待冷至室温后，摇匀分装保存于4℃冰箱中备用。有效使用期为半年。

9）芽孢悬液在使用时，应先进行活菌培养计数。

10）怀疑有杂菌污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。 2.1.2.4 菌片（染菌载体）的制备程序

（1）菌片用载体应根据消毒对象选择，常用的材料有金属、玻璃、滤纸、棉布、聚四氟乙烯等。金属载体一般用 12mm 直径圆形金属片（厚 0.5mm），其他材质载体一般为方形，大小10mm310mm，特定用途的消毒产品可使用其他材质、形状的载体。

（2）所用载体（除滤纸片外）于染菌前，应进行脱脂处理。脱脂方法如下：①将载体放在含洗涤剂的水中煮沸30 min；②以自来水洗净；③用蒸馏水煮沸 10min；④用蒸馏水漂洗至 pH 呈中性；⑤晾干、熨平备用。

（3）布片用40织纱的白平纹棉布制作。将脱脂后的布块按载体规定的大小抽去边缘一周的经纬纱各一根，按抽纱痕剪开。金属片以不锈钢制作，纸片以新华滤纸制作。

（4）载体经压力蒸汽灭菌后，使用滴染法染菌。

染菌用菌悬液：菌悬液和芽孢悬液的制备按2.1.2.3 进行，试验用菌悬液的含菌量约为2310cfu/mL～1310cfu/mL，可使用浊度计调整菌液浓度。然后加入等量 3.0% 或 0.3% 的牛血清白蛋白，使菌液的浓度为 1310cfu/mL～5310cfu/mL。

滴染法染菌时，将经灭菌的载体片平铺于无菌平皿内，用移液器逐片滴加菌液10μL，必要时用接种环涂匀整个载体表面。置37℃恒温培养箱或室温干燥备用。

（5）每个菌片（载体）的回收菌数应为 1310cfu/片～5310cfu/片。 2.1.2.5 注意事项

（1）用浊度计测定的菌悬液浓度，只用于在滴染菌片时对菌悬液稀释度的估计。作为菌悬液含菌浓度或菌片染菌量的正式报告（如杀菌试验中阳性对照组菌悬液或菌片所含菌量），必须以活菌培养计数的实测结果为准，不得使用根据比浊法判定的估计值。

（2）菌液滴加不宜过快，避免流散影响染菌的准确性。

（3）细菌繁殖体在载体上干燥的过程中，可引起部分死亡。因此应提高初始菌浓度，以便达到所需的回收菌量。

（4）配制菌悬液和制备菌片时，应严格无菌操作，以防污染杂菌，影响杀菌试验的结果。 （5）保存菌液的容器使用橡皮塞时，应将其预先煮沸 10min 进行脱硫处理。

（6）菌悬液和菌片应随时放入冰箱内，尽量缩短室温放置时间，以减少细菌的自然死亡。 2.1.3 活菌培养计数技术 2.1.3.1 适用范围

测定消毒试验用细菌悬液、菌片（染菌载体）、采样液等样本含有活菌的数量。

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2.1.3.2 实验器材

（1）稀释液 见附录A

（2）细菌培养基 胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA），胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）等，见附录A

（3）刻度吸管（1.0mL、5.0mL、10.0mL）

（4）移液器（10μL、20μL、100μL、200μL、1mL、5mL）及配套的塑料吸头 （5）电动混匀器 （6）浊度计 （7）恒温培养箱 2.1.3.3 操作程序

活菌培养计数一般使用倾注法，有特殊规定者，可以使用其他方法。倾注法操作程序如下： （1）对菌悬液可直接进行培养计数。对菌片和小型固体样本，将其直接投入含 5.0mL 稀释液的无菌试管中，对棉拭则将其采样端剪入管内。用电动混匀器混合 20s，或在手掌上用力振打 80次，将菌洗下形成菌悬液。以上操作应严格按无菌要求进行。

（2）将试管按需要数量分组排列于试管架上，每管加入 4.5mL 稀释液。各组由左向右，逐管标上 10、10、10......等。

（3）将菌悬液样本用电动混匀器混合20s，或在手掌上用力振打 80次，随即吸取 0.5mL 加至 10 管内。

（4）将 10 管依前法用电动混匀器混合20s，或在手掌上用力振打 80次，混匀，再吸取出0.5mL 加入 10管内。如此类推，直至最后一管。必要时，还可作某稀释度的 1:1或1:4 稀释。

（5）选择适宜稀释度试管（以预计生长菌落数每平板为 15cfu～300cfu 者为宜），吸取其中混合均匀的悬液 1.0mL 加于无菌平皿内。每一稀释度接种 2个平皿。一般需接种 2个～3个不同稀释度。

（6）将 40℃～45℃ 熔化的培养基，倾注于已加入样液的平皿中，每平皿 15mL～20mL。 （7）将平皿盖好，即刻轻轻摇动混匀，平放。待琼脂凝固后，翻转平皿使底向上，置 37℃恒温培养箱内培养。

（8）培养至规定时间，计数菌落数。对于现场试验样本，应每日观察并记录菌落数。 （9） 计数菌落时，一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。以每平板菌落数在15cfu～300cfu的稀释度为准记录结果。对黑曲霉菌活菌计数时，以每平板菌落数在 15cfu～100cfu 的稀释度为准记录结果。对菌量极少的样本，即使平板菌落数未达 15cfu 时，亦可用其计算最终结果。

（10）根据稀释倍数和接种量计算每毫升菌液中或每一菌片（染菌载体）上的平均菌落数。 2.1.3.4 活菌计数中技术操作误差的测定

活菌计数因技术操作而引起的菌落数误差率（平板间、稀释度间）不宜超过 10%。误差率的计算可按下列公式进行。

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-2 -1

-1

-1

-2

-3

50mL 冲洗液做第 2 次冲洗过滤处理，冲洗后吸取 0.2mL 试验菌悬液直接加入到过滤器中，再加入 50mL 蒸馏水做第 3 次冲洗过滤处理，然后将滤膜有菌面朝上贴于平板表面，置 37℃ 恒温培养箱中培养 48h（真菌和芽孢培养72h），计数菌落数。 2.1.6.5 评价规定

试验结果符合以下全部条件，所测中和剂可判为合格:

（1）第 1、2 和3 组测定的结果，菌悬液菌数应在 50cfu/滤膜～200cfu/滤膜之间，其组间菌落数误差率不得超过 15%。组间菌落数误差率的计算见2.1.5.7中公式。

（2）试验重复 3 次，每次试验均应符合以上要求。 2.1.7 细菌杀灭试验 2.1.7.1 目 的

在实验室内验证消毒剂对悬液中或载体上细菌繁殖体和细菌芽孢的消毒效果。 2.1.7.2 实验器材

（1）按 2.1.2 所示方法制备的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和枯草杆菌黑色变种芽孢悬液或菌片。对特定用途或试验特殊需要，可准备相应其他菌种的悬液或菌片

（2）消毒剂溶液除有特殊规定者外，应使用无菌硬水配制。消毒剂溶液浓度应以所含有效成份为准。例如，含氯消毒剂以所含有效氯浓度为准，碘伏以所含有效碘为准，过氧乙酸以所含过氧乙酸量为准，复方消毒剂浓度以主要杀菌有效成分含量为准。各组消毒剂溶液有效成份浓度的计算，应以实验菌与消毒剂的混合液中有效成份的最终浓度（作用浓度）为准

（3）去除残留消毒剂的中和剂或设备（经鉴定试验证实合格的中和剂或有关器材） （4）消毒剂稀释用标准硬水 见附录A

（5）有机干扰物质 悬液试验和载体试验用牛血清白蛋白溶液，本规范中规定对用于经过清洗或较清洁的消毒对象的消毒剂，有机干扰物牛血清白蛋白的浓度为0.3%；对用于不经过清洗或较脏的消毒对象的消毒剂，有机干扰物牛血清白蛋白的浓度为3.0%。有机干扰物的配置方法见附录A

（6）TSA培养基 见附录A

（7）含中和剂的胰蛋白胨大豆肉汤培养基（中和剂TSB），中和剂经鉴定合格 （8）刻度吸管 （1.0mL、5.0mL） （9）恒温水浴箱 （10）恒温培养箱 （11）电动混匀器 （12）秒表 2.1.7.3 实验分组

试验中应分以下各组：

（1）试验组 按测试目的有两种选择。

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第一种适用于消毒产品鉴定。根据使用说明书，选定试验菌和一个消毒剂浓度（即产品使用说明书中指定的最低浓度）以及 3个作用时间（说明书指定最短作用时间，指定最短作用时间的0.5倍，指定最短作用时间的 1.5倍。如说明书指定最短作用时间为 20min，则 3个作用时间应分别为 10min、20min和30min）进行试验。

第二种适用于消毒产品监督机构日常监测。根据所试菌种和消毒剂对该菌的杀灭能力，选定一株抗力较强的菌和一个消毒剂浓度（即产品使用说明书中指定的最低浓度）以及1个作用时间（说明书指定最短作用时间）进行试验。

（2）阳性对照组 根据各种试验的规定，用标准硬水代替消毒剂溶液，按上述同样的步骤进行试验。所得结果代表试验体系中的菌液浓度，以其作为对照组活菌浓度。 2.1.7.4 悬液定量杀菌试验操作程序

（1）按照2.1.2 配制实验用菌悬液，使其浓度为 1310cfu/mL～5310cfu/mL（回收菌落数为 1310cfu/mL～5310cfu/mL）。

（2）按照产品说明书要求配制消毒液。无特殊说明者，一律使用无菌硬水配制，配制的浓度为待测浓度的1.25倍（例如要评价的消毒液浓度为200mg/L，则应配制的浓度为250mg/L），置20℃±1℃ 水浴备用。

（3）取消毒试验用无菌试管，先加入 0.5mL 试验用菌悬液，再加入 0.5mL 有机干扰物质，混匀，置 20℃±1℃ 水浴中 5min后，用无菌吸管吸取上述浓度消毒液 4.0mL 注入其中，迅速混匀并立即计时。

（4）待试验菌与消毒剂相互作用至各预定时间，分别吸取 0.5mL 试验菌与消毒剂混合液加于 4.5mL 中和剂中，混匀。

（5）各管试验菌与消毒剂混合液经加中和剂作用 10min 后，分别吸取 1.0mL 样液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管样液接种 2 个平皿。如平板上生长的菌落数较多时，可进行系列10倍稀释后，再进行活菌培养计数。

（6）同时用标准硬水代替消毒液，进行平行试验，作为阳性对照。

（7）所有试验样本均在 37℃ 恒温培养箱中培养，对细菌繁殖体培养48h 观察最终结果；对细菌芽孢需培养 72h 观察最终结果。

（8）试验重复 3 次，计算各组的活菌浓度（cfu/mL），并换算为对数值（N），然后按下式计算杀灭对数值：

杀灭对数值 （KL）＝对照组平均活菌浓度的对数值（No）－实验组活菌浓度对数值（Nx） 计算杀灭对数值时，取小数点后两位值，可以进行数字修约。但是，如果消毒实验组消毒处理后平均生长菌落数小于 1 时，本规范规定此时的杀灭对数值，即大于等于对照组平均活菌浓度的对数值（KL≥No）。

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2.1.7.5 载体浸泡杀菌试验操作程序

（1）载体浸泡定量杀菌试验操作程序

1）按照2.1.2.4 制配实验用菌片，使每个菌片的回收菌数为 1310cfu/片～5310cfu/片。 2）取无菌平皿，标明所注入消毒液的浓度。按每片 5.0mL 的量，吸取相应浓度的消毒剂溶液注入平皿中。

3）将盛有消毒剂平皿置 20℃±1℃ 水浴 5min，用无菌镊子取预先制备的菌片 3 片分别放入平皿中，并使之浸没于消毒液。

4）待菌液与消毒剂相互作用至各预定时间，用无菌镊子将菌片取出分别移入一含 5.0mL 中和剂试管中。用电动混匀器混合20s，或将试管在手掌上振打 80次，中和作用 10min。混匀后，吸取 1.0mL 直接接种平皿，每管接种 2 个平皿，测定存活菌数。

5）另取一平皿，注入 10.0mL 稀释液代替消毒液，放入 2 片菌片，作为阳性对照组。其随后的试验步骤和活菌培养计数与上述试验组相同。

6）所有试验样本均在 37℃ 恒温培养箱中培养，对细菌繁殖体培养 48h 观察最终结果；对细菌芽孢需培养 72h 观察最终结果。

7）试验重复 3 次，计算各组的活菌量（cfu/片），并换算为对数值（N），然后按下式计算杀灭对数值：

杀灭对数值（KL）＝对照组平均活菌量的对数值（No）－实验组活菌量对数值（Nx） （2）载体浸泡定性灭菌试验操作程序

1）按照2.1.2.4制配实验用菌片，使每个菌片的回收菌落数为1310cfu/片～5310cfu/片。 2）取无菌平皿，标明所注入消毒液的浓度。按每片 5.0mL 的量，吸取相应浓度的消毒剂溶液注入平皿中。

3）将盛有消毒剂平皿置20℃±1℃水浴5min，用无菌镊子取预先制备的菌片 6 片分别放入平皿中，并使之浸没于消毒液。

4）待试验菌与消毒液相互作用至预定时间，用无菌镊子将菌片取出分别移入一含 5.0mL 中和剂试管中。用电动混匀器混合20s，作为试验组样本。

5）另取一平皿，注入 20.0mL 标准硬水代替消毒液，放入 4 片菌片，作用至设定时间，取出 2 片，分别移入含 5mL 中和剂试管中，其随后的试验步骤与上述试验组相同，作为阳性对照组样本。另取出 2 片，分别移入一含 5.0mL 中和剂试管中，用电动混匀器混合20s，或将试管在手掌上振打 80次，然后用稀释液做系列10倍稀释，选择适宜稀释度，吸取 1.0mL 接种平皿，每管接种 2 个平皿，做活菌培养计数，作为菌数对照组样本。

6）所有试验样本均在 37℃ 恒温培养箱中培养，对细菌繁殖体培养 48h，观察最终结果；对细菌芽孢需培养 7d，观察最终结果。

7）试验重复5次，计算各组的活菌量（cfu/片）。

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2.1.7.6 流动浸泡载体定量杀灭试验操作程序

（1）按照 2.1.2.4 制备实验用菌片，使每个菌片的回收菌落数为 1310cfu/片～5310cfu/片。

（2）开启消毒设备，待产生的酸性氧化电位水或臭氧水中有效成分处于稳定状态时，进行杀灭试验。

（3）取尼龙网片或不锈钢网片放 250mL 烧杯底部中央，将染菌载体放于尼龙网片或不锈钢网片表面，染菌载体上再盖一尼龙网片或不锈钢网片。将酸性氧化电位水或臭氧水通过管路沿烧杯壁流下，流动浸泡消毒至规定作用时间，用无菌镊子将染菌载体取出分别移入一含 5.0mL 中和剂试管中。用电动混匀器混合20s，或将试管在手掌上振打 80次，中和作用 10min。混匀，吸取 1.0mL 直接接种平皿，每管接种 2 个平皿，作为试验组样本。

（4）另取两个染菌载体放入 250mL 烧杯中，放置方法与试验组相同。以自来水代替酸性氧化电位水或臭氧水，在相同流量下流动浸泡至最长作用时间，其余步骤与试验组相同，作为阳性对照组样本。

（5）分别吸取稀释液与中和剂各 1.0mL 于同一无菌平皿内，倾入上述试验同批次的培养基15mL～20mL，作为阴性对照样本。

（6）所有试验样本均在 37℃（黑曲霉菌在30℃）恒温培养箱中培养，对细菌繁殖体培养 48h 观察最终结果；对真菌和细菌芽孢需培养 72h 观察最终结果。

（7）试验重复 3 次，计算各组的活菌量（cfu/片），并换算为对数值（N），然后按 2.1.7.5（1）7）公式计算杀灭对数值。 2.1.7.7 滤膜过滤悬液定量杀灭试验

（1）菌悬液的制备和定量杀灭试验同2.1.7.4（1）、（2）和（3）。 （2）滤膜孔径 0.45μm

（3）待试验菌与消毒剂相互作用至各预定时间，分别吸取 1.0mL 试验菌与消毒剂混合液加入到过滤器中过滤，然后加入 150mL 至 500mL 冲洗液（预先置 20℃±1℃ 水浴中 5min）做第1次冲洗过滤处理，再加入 50mL 蒸馏水做第 2 次冲洗过滤处理，最后将滤膜有菌面朝上贴于平板表面，置 37℃ 恒温培养箱中培养至规定时间。

（4）吸取 0.5mL 试验菌悬液于试管内，加入 0.5mL 有机干扰物，再加入 4.0mL 标准硬水，混匀。做系列10倍稀释后取适当稀释度该混合液 1.0mL 加入到过滤器中，然后加入 50mL 蒸馏水（预先置 20℃±1℃ 水浴中 5min）作冲洗过滤处理，然后将滤膜有菌面朝上贴于平板表面，置 37℃ 恒温培养箱中培养至规定时间，计数菌落数，作为阳性对照。

（5）分别吸取稀释液、蒸馏水和硬水各 1.0mL 于同一无菌平皿内，倒入上述试验同批次的培养基 15mL～20mL，置 37℃ 恒温培养箱中培养至规定时间，计数菌落数，作为阴性对照。

（6）试验重复 3 次，计算各组的活菌量（cfu/mL或片），并换算为对数值（N），然后按2.1.7.5（1）7）公式计算杀灭对数值。

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2.1.7.8 评价规定

（1）产品监督检验，在产品说明书指定的最低浓度与最短作用时间，重复试验3次。悬液定量杀灭试验中，各次的杀灭对数值均≥5.00，判定为消毒合格。载体定量杀灭试验，各次的杀灭对数值均≥3.00，判定为消毒合格。

（2）产品申报卫生许可检验中，要求在产品说明书指定的浓度与3个作用时间，重复试验3次。在产品指定最低浓度与最短作用时间，以及最短作用时间的1.5倍时，要求悬液定量杀灭试验中各次的杀灭对数均≥5.00。载体定量杀灭试验和流动浸泡载体定量杀灭试验中，各次的杀灭对数均≥3.00，判定为消毒合格。在产品指定浓度与最短作用时间的0.5倍时，可允许对不同细菌或在部分重复次数中，出现不合格结果。

在申报卫生许可检验中，检验机构如果发现产品说明书指定的浓度与作用时间，与常规消毒剂量差异较大，不能进行消毒试验评价时，可根据专业知识合理调整其浓度与时间，然后再进行测试。

（3）对载体浸泡定性灭菌试验，阳性对照组有菌生长，菌数对照组符合要求，阴性对照组无菌生长，5次试验均无菌生长，判定为灭菌合格。

（4）报告中应将各次试验的结果全部以表格的形式列出。阳性对照组应列出各次实验菌浓度，以及平均实验菌浓度。实验组应列出杀灭对数值，例如，杀灭对数值大于5.00时，应表示为≥5.00，而不必列出具体的数字；杀灭对数值小于5.00时，应列出具体的数字（例如2.58，4.65）。 2.1.7.9 注意事项

（1）在杀菌试验中，每次均应设置阳性对照。

（2）试验中所使用的中和剂、稀释液和培养基等，各批次均应进行无菌检查，发现有菌生长，则全部试验需换用未污染试剂或培养基重做。

（3）悬液定量杀菌试验时，有机干扰物质一般采用3.0%（W/V）牛血清白蛋白贮存溶液，在消毒体系中稀释10倍（含量为0.3%），进行消毒试验。如果某消毒剂使用说明书中指定，其产品只用于清洁物品或器械的消毒或只用于冲洗浸泡消毒，可采用0.3%（W/V）牛血清白蛋白贮存溶液，在消毒体系中稀释10倍（含量为0.03%），进行消毒试验。 2.1.8 分枝杆菌杀灭试验 2.1.8.1 目 的

在实验室内验证消毒剂对悬液中或载体上分枝杆菌的消毒效果。 2.1.8.2 实验器材

（1）实验菌株 龟分枝杆菌脓肿亚种CA 93326（ATCC 19977） （2）培养基 分枝杆菌干燥培养基 （3）试验菌及其菌悬液或菌片的制备

（4）中和剂 （根据 2.1.5 所示方法鉴定合格者） （5）稀释液 0.1% 胰蛋白胨的生理盐水溶液

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（6）消毒剂稀释用硬水 见附录A （7）有机干扰物质 见附录A

（8）刻度吸管 （0.1mL、1.0mL、5.0mL） （9）恒温水浴箱 （10）电动混匀器 （11）计时装置 （12）恒温培养箱

2.1.8.3 龟分枝杆菌脓肿亚种菌悬液的制备

（1）以无菌操作方式开启冻干菌种管，用毛细吸管吸加适量营养肉汤于管中，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0mL～10.0mL 营养肉汤试管，滴入少许菌种悬液，置 37℃ 培养 18h～24h。用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于分枝杆菌培养基平板上，置 37℃ 培养 72h。挑取上述第 2 代培养物中典型菌落，接种于分枝杆菌培养基斜面，置 37℃ 培养 72h，即为第 3代培养物。密封后，4℃ 保存，时间不得超过6周。

（2）试验时取第 3 代斜面培养物，在分枝杆菌干燥培养基斜面上连续传代，培养方法与第3代相同。取第5～6代的分枝杆菌培养基斜面新鲜培养物（72h），用 5.0mL 吸管吸取 3.0mL～5.0mL 稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用 5.0mL 吸管将洗液移至另一含有 6g～7g 玻璃珠的无菌圆锥底塑料试管中，在电动混匀器混合 5min 然后将菌液吸入到另一试管内制成菌悬液。

（3）将制成的菌悬液，进行活菌培养计数（见 2.1.3），按其结果用稀释液稀释至所需浓度。

（4）菌悬液保存在 4℃ 冰箱内备用，当天使用不得过夜。 2.1.8.4 实验分组 试验分为下列各组：

（1）试验组，按 2.1.7.3 规定，选定消毒剂浓度与作用时间。

（2）阳性对照组，以标准硬水代替消毒剂溶液，按 2.1.7.3 规定程序进行试验。所得结果代表试验体系中所含受试菌的活菌浓度，并以其计算消毒因子对受试菌的杀灭对数值。 （3）阴性对照组，观察同次试验用相关溶液和培养基有无污染。 2.1.8.5 试验程序

常用杀灭试验有：悬液定量杀灭试验、载体浸泡定量杀灭试验和流动浸泡载体定量杀菌试验等。其操作程序按 2.1.7.4、2.1.7.5 和2.1.7.6 进行，接种后的平皿应放入干净的塑料袋内，置 37℃ 恒温培养箱中培养 7d，观察最终结果。 2.1.8.6 评价规定

（1）产品监督检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和作用时间，重复试验 3 次，悬液定量杀灭试验各次试验的杀灭对数值均≥4.00，载体定量杀灭试验各次试验的杀灭对数值均

26

≥3.00，判定为消毒合格。

（2）产品申报卫生许可检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和 3 个作用时间，重复试验 3 次。

用悬液定量杀菌试验评价杀菌效果时，在产品规定使用浓度与最低作用时间，以及最短作用时间的 1.5倍时，各次试验的杀灭对数值均应≥4.00，在产品规定使用浓度与最短作用时间的0.5倍时，允许杀灭对数值＜4.00，判定为实验室试验该产品对分枝杆菌污染物消毒的有效剂量。

用载体浸泡定量杀菌试验评价杀菌效果时，在产品规定使用浓度与最短作用时间和最短作用时间的 1.5倍时，各次试验的杀灭对数值≥3.00，在产品规定使用浓度与最短作用时间的0.5倍时，允许杀灭对数值＜3.00，判为实验室试验该产品对分枝杆菌污染物消毒的有效剂量。 2.1.8.7 注意事项

（1）分枝杆菌试验操作应在生物安全Ⅱ级实验室中进行，避免造成实验人员实验室感染和对环境污染。

（2）其它注意事项见 2.1.7.9。 2.1.9 真菌杀灭试验 2.1.9.1 目 的

在实验室内验证消毒剂对悬液中或载体上真菌繁殖体或真菌孢子的消毒效果。 2.1.9.2实验器材

（1）麦芽浸膏琼脂（MEA） 见附录A （2）沙堡琼脂培养基 见附录A

（3）试验菌及其菌悬液或菌片 白色念珠菌ATCC 10231和黑曲霉菌ATCC 16404 孢子悬液与菌片，按 2.1.9.3（1）和 2.1.9.3（2）所示方法制备。根据消毒剂特定用途和特殊需要，可选择相应的真菌或孢子悬液与菌片

（4）中和剂 （根据 2.1.5 所示方法鉴定合格者）

（5）磷酸盐缓冲液（ PBS，0.03 mol/L，pH7.2） （6）消毒剂稀释用硬水 见附录A （7）有机干扰物质 见附录A

（8）刻度吸管 （0.1mL、1.0mL、5.0mL）

（9）恒温水浴箱 （10）电动混匀器 （12）计时装置 （13）恒温培养箱 2.1.9.3 真菌悬液制备

（1）白色念珠菌悬液的制备

1）以无菌操作方式开启冻干菌种管，用毛细吸管吸加适量沙堡液体培养基于菌种管中，轻

27

柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0mL～10.0mL 沙堡液体培养基试管，滴入少许菌种悬液，置 37℃ 培养 18h～24h。用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于沙堡琼脂培养基平板上，置 37℃ 培养 18h～24h。挑取上述第 2 代培养物中典型菌落，接种于沙堡琼脂斜面，置 37℃ 培养 18h～24h，即为第 3 代培养物。

2）取第 3～6代的沙堡琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h～24h），用 5.0mL 吸管吸取 3.0mL～5.0mL 稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用 5.0mL 吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混匀器混合20s，或在手掌上振打 80次，以使白色念珠菌悬浮均匀。

3）悬液定量杀菌试验时，实验用菌悬液的含菌量为 1310cfu/mL～5310cfu/mL；载体定量杀菌试验时，菌片制备按 2.1.2.4 要求进行。

4）菌悬液保存在 4℃ 冰箱内备用，当天使用不得过夜。

5）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。菌落形态可直接用显微镜观察。菌体形态可在涂片后直接用高倍显微镜观察，也可用墨水阴地法染色（将菌与黑墨水在玻片上混匀，推成薄膜）后观察。

（2）黑曲霉菌（ATCC 16404）孢子悬液或菌片的制备。

1）以无菌操作方式开启冻干菌种管，用毛细管吸取少量麦芽浸膏营养肉汤培养基加到菌种管中，轻轻吹吸，使菌种沉淀物融化分散。取少许沉淀物悬液加到含 5.0mL 麦芽浸膏营养肉汤培养基试管中，置 30℃±1℃ 恒温培养箱中培养 42h～48h。用接种环划线接种第 1 代培养物于 MEA 培养基平板，置 30℃±1℃ 恒温培养箱中培养 42h～48h。取平板培养物中的典型菌落，接种于麦芽浸膏营养肉汤培养基，置 30℃±1℃ 恒温培养箱中培养 42h～48h，即为第 3 代培养物。

2）用 10.0mL 吸管吸取 5.0mL～10.0mL 第 3 代培养物，接种罗氏瓶，并摇动使菌液布满 MEA 培养基表面，然后将多余肉汤培养物液体吸出，置 30℃±1℃恒温培养箱中培养 42h～48h。

3）向罗氏瓶培养物中加入 5.0mL～10.0mL 0.05%（V/V）吐温 80 生理盐水溶液，刮洗黑曲霉菌分生孢子于溶液中，将孢子悬液移入装有玻璃珠的三角瓶中，轻轻振摇 1min 后，滤过除去菌丝。滤过后，显微镜下（400 倍）观察是否存在菌丝，若悬液中有菌丝存在，可经 5000 r/min～6000 r/min，离心 20min。再次在显微镜下（400 倍）观察，若悬液中仍有菌丝存在，须再离心。

4）黑曲霉菌分生孢子悬液在 2℃～8℃ 储存不能超过 2d，使用前，混合均匀，在显微镜下（400 倍）观察是否有孢子出芽，若有孢子出芽，则不得使用。

5）悬液试验时，可用稀释液适当稀释使实验用菌悬液的含菌量为 1310cfu/mL ～5310cfu/mL。

6）制备染菌样片时染菌方法为滴染法，每片加菌悬液10μl。染菌后，置二级生物安全柜内干燥备用。回收菌数应达 1310cfu/片～5310cfu/片。 2.1.9.4 实验分组

试验分为下列各组：

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6

6

7

7

7

7

（1）试验组，按 2.1.7.3 规定，选定消毒剂浓度与作用时间，对受试菌种的杀灭能力进行测定。

（2）阳性对照组，以标准硬水代替消毒剂溶液，按 2.1.7.3 规定程序进行试验。所得结果代表试验体系中所含试验菌的活菌浓度，并以其计算消毒因子对试验菌的杀灭对数值。

（3）阴性对照组，观察同次试验用相关溶液和培养基有无污染。 2.1.9.5 试验程序

常用杀灭试验有：悬液定量杀菌试验、载体浸泡定量杀菌试验等。对白色念珠菌使用沙堡琼脂培养基，对黑曲霉菌使用麦芽浸膏琼脂（MEA）。其操作程序详见 2.1.7。

活菌培养计数时，对白色念珠菌，在 37℃ 恒温培养箱中培养72h 观察最终结果。对黑曲霉菌，在30℃ 恒温培养箱中培养 72h 观察最终结果。 2.1.9.6 评价规定

（1）产品监督检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和作用时间，重复试验 3 次 ，对白色念珠菌和黑曲霉菌各次试验的杀灭对数值均≥4.00，判定为消毒合格。对所试特定真菌的杀灭对数值均≥4.00，判定为消毒合格。

（2）产品申报卫生许可检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和 3 个作用时间，重复试验 3 次，在产品规定使用浓度与最短作用时间，以及最短作用时间的 1.5倍时，各次试验的杀灭对数值均应≥4.00，在产品规定使用浓度与最短作用时间的 0.5倍时，允许杀灭对数值＜4.00，判定为消毒合格。

用载体浸泡定量杀菌试验评价杀菌效果时，在产品规定使用浓度与最短作用时间，以及最短作用时间的 1.5倍时，各次试验的杀灭对数值≥3.00，在产品规定使用浓度与最短作用时间的 0.5倍时，允许杀灭对数值＜3.00，判定为消毒合格。 2.1.9.7 注意事项

（1）黑曲霉菌试验操作应在专门的生物安全Ⅱ级实验室内进行，避免造成环境污染和操作者受污染。

（2）其它注意事项见 2.1.7.9。 2.1.10 病毒灭活试验 2.1.10.1 目 的

评价各种用途的消毒因子对病毒的灭活效果。 2.1.10.2 实验器材

（1）实验用病毒株 脊髓灰质炎病毒Ⅰ型（poliovirus-Ⅰ，PV-Ⅰ）疫苗株；艾滋病病毒 1 型（human immunodeficiency virus，HIV-1）美国株

（2）宿主细胞 可采用VERO细胞系、BGM细胞、Hela细胞系或FL细胞系，作为PV-Ⅰ的测试细胞。用含有人T淋巴细胞白血病病毒 1 型（human T cell leukemiavirus 1，HTLV-1）基因的人淋巴细胞（MT4 株）作为HIV-1的测试细胞。

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（3）细胞培养瓶 （4）96 孔培养板 （5）恒温水浴箱 （6）二氧化碳培养箱 （7）二级生物安全柜

（8）低温冰箱（-20℃，-80℃） （9）液氮罐 （10）倒置显微镜 （11）低温高速离心机

（12）可调移液器及配套一次性塑料吸头 （13）细胞维持培养基 见附录A （14）细胞完全培养基 见附录A

（15）去离子水、标准硬水（硬度为324mg/L）

（16）有机干扰物 对未清洗较脏的物品用 3.0% 牛血清白蛋白。对已清洗较清洁的物品用0.3% 牛血清白蛋白

（17）胎牛血清或新生牛血清 2.1.10.3 病毒悬液的制备

（1）从液氮中取出冻存的试验用宿主细胞，在 37℃ 温水中迅速融化，用毛细吸管移置于含有细胞维持液的细胞管内，吹吸数次，混匀，立即离心（3000r/min，3min），去上清液。再加入适当的细胞维持液，吹吸数次，混匀，同上离心后，转种于加有 10mL 完全培养基的培养瓶中。逐日观察细胞生长情况，在细胞长满单层时，用于传代或消毒试验。

（2）取出低温冻存的试验病毒毒种，室温融化，用不含胎牛血清的培养基作10倍稀释，然后全部接种于已经长满单层细胞的细胞瓶内，置37℃ CO2培养箱中，吸附 1～2h，吸出病毒悬液，加入细胞维持液，至37℃ CO2培养箱内培养。待3/4细胞出现病变时，收获病毒。

（3）将含有病毒及宿主细胞的培养液，在冰浴条件下，用超声波（或室温与-20℃反复冻融3次）破碎宿主细胞或用其他相应的方法破碎宿主细胞，释放病毒。然后，尽快离心（6000r/min，15min）去除沉淀（主要为细胞碎片），上清液即为所需的病毒悬液。按每管 1.0mL 分装于无菌离心管（1.5mL）中。

（4）取1支病毒悬液，按病毒滴度测定法，测定其病毒滴度。其余置 -80℃冷冻保存备用。 2.1.10.4 病毒载体的制备

（1）按 2.1.2.4 制备载体。

（2）取出低温冻存的病毒悬液，室温融化，与等量有机干扰物混合，取 0.01mL 滴染于载体片上，室温凉干后备用。 2.1.10.5 病毒滴度测定

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（1）操作步骤

用细胞维持液对样本做系列10倍稀释，每个稀释度滴加 4 孔（各孔中应该已经长满单层的宿主细胞）于培养板上，置37℃ CO2培养箱 1h～2h，确保病毒吸附在细胞上。取出培养板，更换细胞维持液。放入CO2培养箱中（37℃，5%CO2）培养，每日在显微镜下观察细胞病变，连续观察3d～5d，逐孔记录细胞病变情况。

（2）病毒滴度的计算

病毒滴度以半数细胞感染剂量（TCID50）表示，TCID50的对数值计算公式如下： TCID50 对数值= 病变率高于50%组稀释度的对数值 + 距离比例 具体计算步骤如下：

1）计算细胞病变率。先计数培养板上不同稀释度样本细胞病变发生与未发生的孔数，然后分别计算“细胞病变（-）”和“细胞病变（+）”的累积总计值。计算“细胞病变（-）”累积值时，由稀释度低样本组向稀释度高样本组累积；“细胞病变（+）”累积值则相反，由稀释度高样本组向稀释度低样本组累积（见表 2-2）。

各稀释度样本组“细胞病变（+）”累积总计值，除以该稀释度样本组“细胞病变（-）”与“细胞病变（+）”累积总计值之和即为其病变比，由之可得病变率（%）（见表 2-2）。

2）计算距离比例。距离比例可按下式计算：

距离比例?

高于50%组的病变率?50

高于50%组的病变率?低于50%组的病变率注：病变率高于 50% 组是指病变率超过50%的最低组，以下简称高于 50% 组；病变率低于50% 组是指病变率低于 50% 的最高组，以下简称低于 50% 组。

计算举例：设试验数据如表 2-2。

表 2-2 某消毒剂对 HIV 灭活作用的测定结果

样本 稀释度 10 10 10 10 10

-8-7-6-5-4

接种 孔数 4 4 4 4 4

细胞病变 - 0 0 1 3 4

+ 4 4 3 1 0

累积值

细胞病变（-） 0 0 1 4 8

细胞病变（+） 12 8 4 1 0

12/12 8/8 4/5 1/5 0/8 病变比

病变率（%） 100 100 80 20 0

本例，高于50%组病变率（%）为80；低于 50%病变率（%）为20；高于50%组稀释度对数值为6。

31

距离比例?80?50?0.5

80?20TCID50 对数值 = 6＋0.5 = 6.5

2.1.10.6 残留消毒剂中和稀释法的鉴定试验

（1）目 的

确定所选中和剂是否适用于拟进行的细胞感染法病毒灭活试验。 （2）试验设计原则

1）通过所设各组试验结果综合分析，应可确定所用中和剂是否对测试消毒药物有良好的中和作用，对试验用病毒和细胞株是否有害或不良影响。

2）根据试验目的，选择适宜的病毒株和细胞株。

3）中和试验用消毒剂浓度应为最高使用浓度，最短作用时间不得少于30s。 （3）实验分组

1）中和剂 + 病毒悬液 → 细胞维持培养基系列稀释，接种细胞培养 观察中和剂对病毒有无抑制作用。

2）（消毒剂 + 中和剂） + 病毒悬液 →细胞维持培养基系列稀释，接种细胞培养 观察中和产物，或未被完全中和的残留消毒剂对病毒有无抑制作用或对检测方法有无干扰。 3）病毒悬液 →细胞维持培养基系列稀释，接种细胞培养 观察病毒是否可正常生长，并将其结果作为阳性对照值。 4）未接种病毒的细胞 → 培养 观察其生长是否正常。

（4）病毒悬液定量法中和剂鉴定试验操作程序

1）按 2.1.10.3 制备病毒悬液。消毒剂用标准硬水按规定浓度的 1.25倍配制，备用。 2) 中和剂鉴定试验分以下4组：

第 1 组 吸取 0.98mL中和剂溶液于试管内，置 20℃±1℃ 水浴5min，加入 0.02mL 病毒悬液，混合均匀，作用10min，以细胞维持培养基作系列稀释，取样作为第1组样本。

第 2 组 吸取 0.98mL中和产物（0.9mL中和剂＋0.08mL消毒剂溶液）于试管内，置 20℃±1℃ 水浴5min，再吸加 0.02mL 病毒悬液，混合均匀，作用10min，以细胞维持培养基作系列稀释，取样作为第2组样本。

第 3 组 吸取 0.98mL细胞维持液于试管内，置 20℃±1℃ 水浴5min，再吸加 0.02mL 病毒悬液，混合均匀，作用10min，以细胞维持培养基作系列稀释，取样作为第3组样本。

第 4 组 将试验用细胞，加细胞维持液。

3）将第1～3组样本进行病毒滴度测定，观察第 4 组细胞生长情况。 （5）病毒载体定量中和剂鉴定试验操作程序

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1）按 2.1.10.4 制备染毒载体。 2）中和剂鉴定试验分以下4组：

第 1 组 吸取中和剂 1.0mL 于无菌试管中，将其置 20℃±1℃ 水浴5min，用无菌镊子夹入1片病毒载体片，并使浸透于中和剂内，作用 10min，用细胞维持液做系列10倍稀释，取样作为第1组样本。

第 2 组 吸取中和产物溶液（以浸有消毒剂的载体置 1.0mL 中和剂内，作用 10min） 1.0mL 于无菌试管中，将其置 20℃±1℃ 水浴5min，用无菌镊子夹入1片病毒载体片，并使浸透于中和产物溶液中。作用 10min，用细胞维持液做系列10倍稀释，取样作为第 2 组样本。

第 3 组 吸取细胞维持液 1.0mL 于无菌试管中，将其置 20℃±1℃ 水浴 5min，用无菌镊子夹入 1 片病毒载体片，并使浸透于细胞维持液中。作用 10min，用细胞维持液做系列 10倍稀释，取样作为第 3 组样本。

第 4 组 将试验用细胞，加细胞维持液。

3）将第 1～3组样本进行病毒滴度测定，观察第 4 组细胞生长情况。 （6）3d～5d 记录试验结果，试验重复3次。 （7）评价规定

试验结果符合以下全部条件，所测中和剂可判为合格：

1）第1、2、3组病毒滴度的误差率小于50%，悬液定量法病毒滴度对数值为5～7，载体法病毒滴度对数值为4～6。

2）第4组细胞生长正常。 3）连续3次试验取得合格评价。

2.1.10.7 残留消毒剂物理去除方法的鉴定试验要点

病毒灭活试验中的物理去除法，首选稀释法，其次为吸附柱法、分子筛柱法、载体冲洗法。 （1）分 组

1）（病毒悬液 + 消毒剂）+ 除药处理 → 细胞维持培养液系列稀释，接种培养 观察去除残留药物后病毒可否恢复对细胞的感染作用。

2）病毒悬液 + 除药处理 → 细胞维持培养液系列稀释，接种培养 观察除药处理对病毒滴度有无影响。

3）病毒悬液 → 细胞维持培养液系列稀释，接种培养 观察病毒生长是否正常，并以该结果作为阳性对照值。 4）未接种病毒的细胞 → 培养 观察细胞生长是否正常。 （2）悬液定量操作程序

1）按 2.1.10.3 制备病毒悬液。消毒剂用标准硬水按规定浓度 1.25倍配制备用。

33

2）中和剂鉴定试验分以下4组：

第 1 组 吸消毒剂 0.8mL 于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中经 5min 后，吸加 0.2mL 病毒悬液，混匀。待作用至规定的时间，对此液进行除药处理，根据试验规定量，吸取最终样本 （或用细胞维持培养液系列稀释的样液），进行随后的病毒滴度测定。

第 2 组 吸取病毒悬液 0.2mL，加 0.8mL 细胞维持培养液，做除药处理。根据试验规定量，吸取最终样本（或用细胞维持培养液系列稀释的样液），进行随后的病毒滴度测定。

第 3 组 吸取病毒悬液 0.2mL， 加细胞维持培养液 0.8mL，不加消毒剂亦不做任何除药处理。直接进行病毒滴度测定。

第 4 组 向未接种病毒的细胞管内，加入细胞维持培养液进行正常培养。 （3）评价规定

试验结果符合以下全部条件，所测物理除药法可判为合格：

1）第 1 组无试验病毒或仅有少量病毒生长。且明显少于第 2 组、第 3 组的病毒生长。 2）第2、3组病毒生长量相近，二者差异不超过 1 个对数滴度。 3）连续 3 次试验取得合格评价。

4）可使用病毒载体，按同样的原理与操作步骤进行试验，判定合格标准相同。 2.1.10.8 脊髓灰质炎病毒灭活试验

（1）目 的

验证各种消毒因子对病毒的灭活效果。 （2）悬液定量灭活试验操作程序

1）按 2.1.10.3 制备病毒悬液，低温保存备用。

2）取待测消毒剂，用灭菌硬水稀释至说明书设定的作用浓度的 1.25倍，置 20℃±1℃ 水浴中备用。

3）取 0.1mL 有机干扰物与等量病毒悬液混合，置 20℃±1℃ 水浴 5min，加入 0.8mL 消毒剂样品混匀，作用至设定时间，取 0.1mL 加入到 0.9mL 的中和剂中混匀，用细胞维持液做系列 10倍稀释，取样进行病毒滴度测定。

4）阳性（病毒）对照组试验中，用细胞维持液代替消毒剂，其它同实验组。 5）试验重复3次。

（5）脊髓灰质炎载体定量灭活试验操作程序 1）按 2.1.10.4 制备病毒载体。

2）取待测消毒剂，用灭菌硬水稀释至说明书设定的作用浓度，于 20℃±1℃ 水浴中备用。 3）取无菌平皿，按每片 5.0mL 的量，吸取消毒液注入平皿中。

4）将平皿置 20℃±1℃ 水浴 5min 后，用无菌镊子分别取病毒载体片浸没于消毒液中。 5）作用至设定时间，取出载体片分别移入含 1.0mL 的中和剂试管中。振打80次，进行病毒滴度测定。

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6）直接将病毒载体片加到含 1.0mL 细胞维持液的试管中，振打80次，进行病毒滴度测定，作为阳性对照组。

7）试验重复3次。

（6）平均灭活对数值的计算

平均灭活对数值按下式计算：设阳性（病毒）对照组平均病毒感染滴度（TCID50）的为N0，试验（消毒）组平均病毒感染滴度（TCID50）为Nx。

平均灭活对数值 = lgN0－lgNx （7）评价规定

1）悬液定量杀灭试验中，杀灭对数值≥4.00，阳性对照组病毒滴度对数值在 5～7 之间为消毒合格。

2）载体定量灭活试验中，杀灭对数值≥3.00， 阳性对照组病毒滴度对数值在 4～6 之间为消毒合格。

2.1.10.9 艾滋病病毒灭活试验

（1）目 的

测定消毒剂对艾滋病病毒灭活所需的剂量，以验证对该病毒污染物消毒的实用剂量。 （2）实验原理

用细胞感染法测定消毒剂作用前后（或试验组与对照组）样本中 HIV 的量。以细胞病变作为判断指标，确定各组病毒的感染滴度，计算消毒剂对 HIV 的灭活对数值。

（3）安全防护

试验中要求采取严密防护措施。我国规定所有接触 HIV 的试验均需在生物安全三级（biological safety level 3，BSL 3）实验室内进行，并制定有相应的安全防护措施。在 HIV 灭活试验时，必须严格按照有关安全规定进行。

（4）实验分组

1）试验组 根据所测消毒剂对其他微生物的杀灭或灭活剂量估计，设立适宜的浓度与作用时间组（不少于1个浓度，3个作用时间），对作用时间的设计应不短于 30s。所设组应能测出使 HIV 全部灭活所需的最低有效剂量（药物浓度与作用时间）。

2）阳性对照组 用细胞维持液代替消毒剂，按试验组规定步骤加入 HIV 悬液进行试验和培养，观察 HIV 生长是否良好。

3）阴性对照组 用不含 HIV 的完全培养基作为阴性对照，观察所用培养基有无污染，细胞是否生长良好。

4）消毒剂对细胞毒性组 取系列稀释的不同浓度的待测消毒剂各100μL，分别加入含有100μL 用完全培养基制备的 MT4 细胞悬液（含细胞400 000 个/mL）的 96 孔培养板内。置二氧化碳恒温培养箱（37℃）中培养 7d，观察细胞生长情况，确定对细胞无毒性的消毒剂最高稀

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