人Rab7基因的原核表达与多克隆抗体制备

第 3 2卷第 2期2 0 1 4年 4月

泉州师范学院学报J o u r n a l o f Qu a n z h o u No r ma l Un i v e r s i t y

Vo 1 . 3 2 NO . 2A pr .2 0 1 4

人 Ra b 7基因的原核表达与多克隆抗体制备昊冰艳，肖惠，吴文林(泉州师范学院化学与生命科学学院，福建泉州 3 6 2 0 0 0 )

摘要：利用 R T— P C R技术从 HE K2 9 3细胞中克隆到人 R a b 7基因，通过双酶切将其克隆到原核表达载体 p GE X一 4 T一 2中，转化大肠杆菌 E. c o l i DH5 a感受态细胞，获得阳性克隆. 2 4℃下 I P T G诱导表达， Gl u t a t h i— o n e S e p h a r o s e 4 B纯化后获得高纯度的 R a b 7蛋白.并以此为抗原免疫小白鼠，获得了 R a b 7的特异性抗体 . 关键词： Ra b 7;原核表达；抗体中图分类号： Q 5 7 5 . 1 2 文献标识码： A 文章编号： 1 0 0 9— 8 2 2 4 ( 2 0 1 4 ) 0 2— 0 0 2 3— 0 4

Ra b蛋白是小分子 G TP结合蛋白家族 (由 R a s、 Rh o/ R a c/ C d c 4 2、 R a n、 S a r/ Ar f、R a b等亚家族组成)中最大的亚家族，由 No v i c k等于 1 9 8 0年首先发现[ 1] .研究表明， Ra b存在于所有的真核生物中， 在进化过程中高度保守，但在不同物种中又表现出数量和功能多样性 .目前，在人类已发现约 7 O种 R a b 蛋白和 R a b样蛋白.

Ra b蛋白由 2 0 0个左右的氨基酸组成，是一种单体形式的 G TP结合蛋白. R a b蛋白由保守的 G结构域和高度可变的 N端和 C端组成，其家族成员的氨基酸序列的相似性在 3 5 ~8 0 之间. R a b蛋白 在体内有两种构象：与 O F P结合的 R a b蛋白处于活化的状态，位于胞膜；未活化的 R a b蛋白与 GD P结合，位于胞浆 .作为囊泡运输的分子开关， R a b蛋白在非活化和活化状态之间不断转换，在囊泡的形成、 转运、粘附和融合过程中起重要作用] . R a b蛋白可直接或间接与被运输的分子结合，使其进入囊泡

. R a b蛋白能聚集于细胞内特定的膜区，通过吸附不同的效应因子而实现与靶膜的结合 .最近几年的研究

表明，一些 Ra b蛋白通过囊泡运输参与细胞内信号传导，调节细胞的增殖、分化和凋亡，而有些 Ra b蛋白甚至直接影响 D NA的复制与转录[ 3 ] .

Ra b 7属 Ra b蛋白家族，在早期内体到晚期内体以及晚期内体到溶酶体的膜泡转运中发挥重要的作用l 7] .本论文将人类 R a b 7基因克隆到原核表达载体，通过诱导基因工程菌获得 Ra b 7蛋白，并以此为抗原免疫小白鼠，获得人 R a b 7多克隆抗体，为进一步研究 R a b 7的生物学功能奠定基础.

1材料与方法1 . 1 材料

Tr i p u r e I s o l a t i o n Re a g e n t购自 Ro c h e公司， M- ML V R Ta s e c D NA S y n t h e s i s Ki t为 T a Ka R a公司

产品，质粒 D NA提取试剂盒和胶回收试剂盒购自 Ome g a公司， Gl u t a t h i o n e S e p h a r o s e 4 B、 P r o t e i n A a g a r o s e购自 GE公司，异丙基 D一硫代吡喃半乳糖苷 ( I P TG)购自S i g ma公司，表达质粒p GE X一 4 T一 2 和大肠杆菌 DH5 a菌株由本实验室保存，引物 1: 5’ AAG GATC CATGA C C TC TAGGAA GAAAG 3,( B a nHI r )和引物 2: 5 AAG AATT CGC AAC T GC AGC T TT C TGC C 3’( E c o R I )由生工上海有限公司

合成， Ta q D NA聚合酶、 d NTP、 E c o R工酶、 B a mH I酶、 T 4 D NA连接酶、蛋白质标准 ma r k e r购自 F e r me n t s, DNA ma r k e r购自上海生工，其他试剂均为国产分析纯 .

收稿日期： 2 0 1 3一 l 1一 O 5

通信作者：吴文林 ( I 9 6 8一),男，福建南靖人，教授，博士，从事细胞代谢调控研究， E— ma i l: we n l i n w@ h o t ma i l . c o m 基金项目：国家自然科学基金资助项目( 3 1 0 7 2 2 3 6 );福建省教育厅资助项目( J K

2 0 0 9 0 4 3 )

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/j8w4.html