拟南芥成花时间调控

拟南芥成花时间调控

REGULATION OF TIME TO FLOWER IN ARABIDOPSIS

THALIANA

朱克明 学号：D06064 导师：梁建生

摘要：调控开花时间是大多数植物由营养生长向生殖生长转化的一个重要生长发育过程。影响拟南芥开花时间的因素有很多，其中光照和温度是两个主要的外部因素，而赤霉素(GA)和一些自主性因子是主要的内部因素。目前，一般按照对以上因素的反应将晚花突变体归于四条开花调控途径：光周期途径、春化途径、自主途径和GA途径。在不断变化的外部环境条件和内部生理条件下，这些途径通过一些主要的整合基因如SOC1、FT、LFY等实现了对拟南芥开花时间的精确调控。

关键词：拟南芥，开花时间，整合途径

Abstract: The timing of the floral transition has significant consequences for reproductive success in plants. There are many factors affecting the flowering time of Arabidopsis. The photoperiod and temperature are the major external factors, and the GA and autonomous factors are the major internal factors. Genetic analysis of Arabidopsis thaliana has identified numerous pathways that control the timing of the floral transition: photoperiod pathway, vernalization pathway, autonomous pathway and GA pathway. Depending on abiotic (photoperiod, temperature, nutrients) and biotic (competition, pollinators, herbivores) conditions, these processes are integrated by the function of the genes LHY, SOC1, and FT at the integration pathway. The integrated signal of the floral induction is transmitted to the floral meristem identity genes , and floral morphogenesis is performed.

Key words:Arabidopsis, flowering time, integration pathway

开花是植物由营养生长向生殖生长转型的最重要的一个过程，在合适的时间完成这个转型是植物实现生殖发育所必需的。通过对开花时间的调控，植物才能实现种间同步杂交并产生尽可能多的种子，这是植物在长期进化过程中形成的对环境条件的一种适应。最近十余年来，利用拟南芥为模式植物，对高等植物开花时间调控机理与信号转导途径的研究取得了长足的进步。目前我们对植物开花时间调控机制的了解主要是通过对拟南芥的遗传学研究获得的。

拟南芥的开花时间受许多因素的影响，其中光照(光质、光强、日照长度) 和温度是主要的外部因素，自主途径因子和赤霉素(GA)是主要的内部因素。此外，植物的生理状况(如年龄、植株大小)、胁迫条件(如干旱、营养匮乏、拥挤、病害、极点温度)、植物激素、水杨酸、碳水化合物、维生素C、谷胱甘肽、过氧化氢、Ca2+ 浓度、micro RNA等也对开花时间产生一定的影响。通常这多种信号汇集在一起调控顶端分生组织(shoot apical meristem；SAM)的发育过程，这种随着内在生理条件和外界环境条件的变化而对开花时间所进行的精细调控，是拟南芥在长期进化过程中形成的一种适应性的选择优势。

拟南芥对开花时间的调控是通过多个不同的遗传位点来实现的。现在已发现拟南芥中有80 多个位点影响开花时间，其中20多个位点与晚花有关。目前对开花时间的研究主要集中于筛选开花时间改变的突变体及这些突变基因的克隆和功能研究。根据开花突变体在不同环境条件下(主要指光照、温度) 的表型和遗传上位性实验，通常将晚花突变体分为四条开花促进途径：光周期途径

(photoperiodpathway)、自主途径(autonomous pathway)、春化途径(vernalization pathway) 和赤霉素途径(GApathway)。本文主要对最近几年拟南芥开花时间调控的研究进展作一小结并对部分重要结果进行简单的讨论。

1 拟南芥的开花促进途径

1.1 光周期途径

日照长度(即光周期)是影响开花时间的主要因素之一。拟南芥是一种兼性的(facultative)长日照植物，长日照条件能促进拟南芥开花转型，而短日照条件则促进其营养生长。目前发现，在光周期途

径中的主要调控基因有CONSTANS (CO)、CRY2/FHA、GIGANTEA(GI)、FT和FWA。它们的突变体在长日照(LD)条件下延迟开花，但在短日照(SD)条件下开花时间与野生型相似。除CO以外，其他基因还参与其他途径。其中FWA和FT位于CO的下游而GI和CRY2位于CO上游。

CO编码具有两个B-box类型锌指结构的GATA 转录因子，其C端有CCT域。其中CCT域是GFP::CO核定位所必需的，而B-box与蛋白质之间的互相作用有关。由于没有任何突变能完全抑制35S:CO的早花表型，说明CO能激活几条平行的开花途径。此外，CO位于生物钟的输出途径，因而也是生物钟和开花时间途径之间监测日照长度的重要元件。FT与TFL1相似，是一个Raf-like 激酶抑制蛋白。除受CO调节促进开花以外，在拟南芥中最新发现的温度感知途径和光质途径也是通过调节FT 的表达调节开花时间。GI是具有6个跨膜域的核蛋白，其突变表型及下游基因的表达方式说明GI与光信号输入生物钟有关。FWA编码一个具有同源域(homeodomain)的转录因子。在fwa突变体中，FWA编码区的核酸序列并没有发生变化，造成功能获得性突变的原因是FWA启动子上两个正向重复序列的甲基化水平下降，使FWA异位表达。一些控制DNA甲基化的突变体，例如ddm1(decreased DNA methylation 1)和ddm2 (decreasedDNA methylation 2)均可以使FWA启动子上的DNA甲基化丢失，造成FWA过量表达和晚花的表型 最近Kinoshita等发现，FWA甲基化调控“印迹”(imprint)的建立是通过特异的母配子来源的DME DNA糖基化酶活性实现的。

光对开花时间的调节一般是通过下列过程实现的：不同波长的光被其受体接收后，由光信号传导分子将光信号传递到内源的控时器——“生物钟(circadian clock)”。通过信号输出途径，生物钟将检测的日照长度信号传输给主要信号分子CO，进而诱导其靶位基因FT的表达，从而实现了日照长度对开花时间的调控。CO位于生物钟输出途径，在生物钟和开花时间之间起着纽带作用。在此过程中，任何影响光信号检测(如光受体)、生物钟组分和光信号输入、输出生物钟途径的突变都会影响拟南芥的开花时间。生物钟对开花时间的调控已有许多报道，这里不展开讨论。

不同的植物对光周期反应采用不同的机制。拟南芥是一种长日植物，而水稻、马铃薯、烟草、牵牛花等短日照植物中也发现了一些拟南芥开花基因的同源基因，它们通过与拟南芥类似或截然不同的方式调控开花时间。水稻的OsGI、Hd1(Se1)和Hd3a基因分别是拟南芥GI、CO和FT的同源基因。在SD和LD条件下水稻的Hd1能分别促进和抑制Hd3a的转录从而控制开花转型，这与拟南芥的CO基因在LD下促进FT的表达相反。水稻OsGI激活Hd1(Se1)的机制与拟南芥很相似，但在LD下Hd1(Se1)抑制Hd3a的表达，导致水稻延迟开花。小麦中也发现了三个AtCO的同源基因，TaHd1、TaHd2和TaHd3，其中TaHd1-1能互补水稻Hd1的功能。这说明，为了适应环境，一个重要的进化过程能通过同一组基因的不同调控方式而产生多样性。另外，牵牛花中CO的同源基因PnCO在LD或SD下过量表达都能促进拟南芥co突变体开花，这也表明SD和LD植物中的这些同源基因在结构和功能上都很相似。

1.2 春化途径

当物种传播时，环境的选择压力使得开花时间改变的植物对新的环境具有一定选择优势，不同生态型的拟南芥采用了不同策略适应环境。大多数拟南芥生态型为晚花生态型，即冬季生态型(winter-annual)，它们在越冬前主要进行营养生长，经过冬季低温后在翌年春季适宜条件下迅速开花。而夏季生态型(summer-annual)不需要经过低温过程就能直接开花。目前在实验室条件下最常用的Columbia (Col)、Wassilewskija (WS)、Landbergerecta (Ler)等都属于夏季生态型。冬季生态型的晚花

表型主要由两个显性位点FRIGIDA (FRI)和FLOWER LOCUS C (FLC)共同控制。FRI编码一个植物特异的未知蛋白，而FLC编码一个含MADS结构域的转录因子。FRI能促进FLC mRNA的高水平表达，从而导致了冬季生态型的晚花表型。春化低温能拮抗FRI的作用降低并保持FLC的这种低水平表达状态，从而促进了冬季生态型在春天合适的条件下开花。FRI和FLC的二者之中任一个发生突变都能削弱或克服晚花表型，夏季生态型就是通过FRI功能缺失性突变或FLC等位基因的自发突变进化而来。最近还发现，FRIGIDA LIKE1(FRL1)特异地在FRI促进FLC表达方面起作用，并且FRI、FRL1、FRL2都是维持拟南芥冬季生态型的习性所必需的。此外，由于flc功能缺失性突变体还能对春化作用作出反应，因此除了依赖于FLC的春化途径以外，还存在一条不依赖于FLC的春化途径，但这条途径的作用机制还不清楚。

春化反应是拟南芥冬季生态型对环境条件的一种适应。春化作用分二个阶段，首先响应春化低温起始抑制FLC mRNA的表达，然后保持这种FLC低水平表达状态。VIN3 (vernalization-insensitive 3)和VRN1 (vernalization 1)、VRN2 (vernalization 2)分别在这两个阶段起主要作用。VIN3编码一个PHD finger(与蛋白质之间的相互作用有关)蛋白，许多染色质重建(remodeling)复合体的组分中含有PHD finger。VRN2是果蝇Polycomb-Group (PcG)发育调节因子Su (Z)12的同源基因，在果蝇中Su(Z)12能通过修饰染色质结构调节基因表达。最近发现，Su(Z)12作为组蛋白甲基转移酶复合体的一部分直接作用于组蛋白H3的Lys27，并且还可能作用于Lys9。VRN1定位于核内，具有二个植物特异的与DNA结合有关的B3结构域。除与VRN2一起保持春化后FLC的低水平表达之外，VRN1在春化作用及调控开花方面还有其他功能。

VRN1、VRN2 和VIN3的结构和突变表型说明它们可能参与了FLC染色质的修饰。对vin3、vrn2和vrn1突变体进行染色质免疫沉淀(ChIP)时的确发现春化作用导致FLC的染色质发生了一系列修饰作用，其中VIN3是春化过程中组蛋白乙酰化修饰所必需的，而VRN1和VRN2与FLC组蛋白H3Lys9和Lys27的甲基化有关。vrn1和vrn2在春化过程中发生了低乙酰化修饰，但当转回温暖的生长条件时这种低乙酰化水平和对FLC的抑制状态不能维持。根据以上研究结果，Sung等提出了春化作用的上位性抑制模型(图1)：在春化过程中，首先VIN3通过起始HDAC去乙酰化使FLC染色质的特异区域乙酰化水平降低，随后通过包含VRN1和VRN2组分的组蛋白甲基转移酶复合体对FLC组蛋白H3 Lys9和Lys27进行甲基化修饰，抑制了FLC的高水平表达，并可能通过招募HP1异染色质蛋白最终导致了在有丝分裂时能稳定存在的抑制性的异染色质状态。与此同时，植物通过这种机制对冬季产生“记忆”。

各种植物种属间的春化机制究竟在多大程度上保守现在还不能确定。在芸苔属中发现了多个FLC的同源基因，其中VFR2是芜菁(B. rapa)中的FLC同源基因。油菜(B. napus)中的5个FLC同源基因BnFLC1～BnFLC5过量表达能导致晚花，并且春化作用能降低它们的表达水平。Schranz 等从芜菁中克隆的5个重复的BrFLC都以与AtFLC类似的方式在春化过程中起作用。二倍体小麦的春化作用主要由VRN1和VRN2介导，而VRN1的变异是多倍体小麦进化为春季生态型的分子基础。由此可见，这些作物春化作用的目标基因与拟南芥的FLC基因感受长时间低温的基本机制还是相同的。

1.3 自主途径

自主途径的突变体无论在长日照条件还是在短日照条件下都延迟开花，尤其在短日照条件下，这种晚花表型更明显。春化作用或低比率红光：远红光(R:FR)能恢复自主途径突变体的正常开花表

型。自主途径的突变体有fca、fpa、fy、fld、ld、fve，最近刚发现的flk也属于自主途径。自主途径的基因能抑制FLC的表达，因此它们的突变体中FLC mRNA的水平都比野生型和长日照途径、GA途径的晚花突变体中高。自主途径的基因与不同生态型中FLC的作用结果不同，但这种等位基因调控FLC表达的不同之处现在难以解释。此外，虽然所有的自主途径基因都能抑制FLC表达，但它们之间并不是简单的线性关系。通过双突变体分析，发现自主途径的这些基因通过彼此独立的相互平行的途径调控FLC的表达。目前，所有的七个自主途径突变体都已克隆，它们通过不同的机制调控开花时间。

LD编码一个核蛋白，它对开花时间的调节至少部分是通过调控LFY的表达实现的。FPA、FCA和FLK都编码RNA 结合蛋白。与FCA和FPA具有多个RNA识别位点(RNA recognition motifs，RRMs)的RNA结合蛋白不同，FLK是具有三个KH motifs的RNA结合蛋白。FLK和FCA都定位于核内，并通过FLC调控整合基因FT和SOC1的表达。FCA编码的蛋白质具有两个RNA-binding域和一个WW 蛋白互相作用域。FCA转录的前体mRNA选择性剪切为四种形式：α、β、γ、δ，其中只有γ编码完整的有功能的FCA蛋白。最近，Quesada等的研究使我们对FCA用选择性剪接方式调控开花时间的机制有了更深的了解。FCA通过促进内含子3的剪接和polyA的形成负向调控自身表达，结果导致有功能的FCA-γ转录减少而无编码功能的FCA-β转录增加。FCA WW蛋白互作域对其负向自我调控表达是必需的，而FY也正是通过这个WW域与FCA形成FCA-FY复合体调节FCA pre-mRNA 3′端剪接。FY蛋白与酵母多腺苷酸化因子Psf2p类似，通过RNA结合蛋白FCA与多腺苷酸化因子的相互作用可能是FCA实现自我调控的生化机制。FPA、FCA、FLK这些RNA结合蛋白的发现说明转录后调控可能是自主途径成员控制开花时间的一种重要的调节机制。

图1 春化作用介导的FLC上位性沉默模型 (a) 冬天，FLC 组蛋白H3 的乙酰化(acetylate，AC) 使FLC 处于活跃的转录状态。 (b)经冬天长时间的低温诱导后，VIN3 开始表达，启动组蛋白脱乙酰酶复合体(histone deacetylase，HDAC) 脱去FLC 组蛋白H3 的乙酰基，FLC 失去转录活性。 (c) FLC 组蛋白H3 的去乙酰化为包含VRN1/VRN2 的复合体(甲基化活性可能由哺乳动物和果蝇的E(z)类似物提供) 对组蛋白H3 的赖氨酸9(K9)和赖氨酸27(K27)甲基化创造了条件，FLC 仍然没有转录活性。 (d) 翌年春天气候转暖后，VIN3 不再表达，VRN1/VRN2 复合体及招募的异染色质蛋白HP1 (使H3 的K9 双甲基化) 使FLC 处于稳定的转录失活状态。 FLD是人类KIAA0601的同源蛋白，其N端都有一个特殊的与染色质重建有关的SWIRM结构域。KIAA0601是人类组蛋白脱乙酰酶1，2(HDAC1/2)抑制复合体(通过使组蛋白脱乙酰化抑制基因表达)的一个组分，因此FLD可能具有类似的功能。与此一致，fld中FLC染色质组蛋白H4乙酰化水平明显升高，因而导致FLC表达增加以及明显的晚花表型。FVE是酵母染色质装配及组蛋白修饰复合体组分MSI和哺乳动物眼瘤相关蛋白(retinoblastoma-associated protein) RbAp46、RbAp48的同源蛋白，能

通过与FLD相似的方式控制开花时间，说明对FLC组蛋白进行乙酰化修饰是拟南芥调控开花时间的一种机制。

1.4 GA 途径

GA控制一系列的生长发育过程，调控开花时间是其重要功能之一。在拟南芥中，GA是非诱导性条件下开花所必需的，施加外源GA能促进拟南芥开花。GA合成突变体和GA信号途径突变体一般延迟开花。现在发现的一些影响拟南芥GA合成的突变体如ga1、ga4、ga5，它们的野生型基因编码GA合成过程中不同步骤的酶。而功能获得性突变体ddf1中GA水平的降低可能与GA20ox 催化的GA合成步骤受阻有关。从另一个角度来看，过量表达编码2β- 羟化酶的AtGA2ox7 和AtGA2ox8通过水解C20-GAs，也造成了GA缺陷型表型。

GA信号传导途径的基因也影响开花时间，其中GAI、RGA 和RGL1是GA信号传导途径中三个关键组分，它们的功能部分冗余，当GA缺乏时都负调控GA信号途径，而活性GA则能消除它们的抑制作用。GAI、RGA 和RGL1这三个蛋白质属于植物特异的调控蛋白中的GRAS (GAI、RGA、SCARECROW)家族。除了GRAS家族成员中高度保守的VH11D和RVER区域外，在RGA、GAI和RGL1的N端还有一个特异的保守的DELLA结构域。DELLA结构域的序列为GAI、RGA、RGL1的功能所必需，缺失导致一系列GA缺陷表型。SPY是GAI上游的一个负调控因子，编码一个类似于哺乳动物丝氨酸/ 苏氨酸N-乙酰氨基葡萄糖(O-O- binding-N-acetylglacosamine)转移酶的蛋白质。spy突变体升高的GA水平及早花表型可能是增强了GA传导信号所致。PHOR1是另一个与开花时间有关的GA信号途径组分，在GA的作用下能转移到核内。PHOR1属于与armadillo相关的螺旋状重复蛋白(通常作为其他蛋白质和核酸装配的脚手架)家族，具有一个与泛素系统组分相关的结构域。当有GA存在时，与PHOR1有关的泛素复合物可能通过与GRAS家族GAI/RGA蛋白的DELLA域相互作用而将其降解，从而激活GA信号传导途径，促进下游信号分子如SOC1、FPF1、GAMYB的表达，进而促进花序分生组织基因(如LFY)的表达，由此完成了GA对开花时间的调控。

2 拟南芥开花促进途径的整合

上述四条调控拟南芥开花的途径并不是孤立的，而是根据外部环境条件和拟南芥内在生理条件的变化，通过控制一些开花途径共同控制的整合因子的表达强度，激活或抑制下游花序分生组织基因和花器官基因的表达，从而使植物适应环境条件和自身生理条件的变化，最大程度上优化其生长及发育的需要。

在拟南芥中，目前已发现了三个整合基因SOC1/AGL20、FT 和LFY。SOC1编码一个含MADS结构域的转录因子，由于SOC1和FT都是CO的直接靶基因，因此长日照途径与其整合很可能是通过转录调控实现的，而自主途径和春化途径通过FLC抑制这两个基因表达的机制尚不清楚。最近发现，GA途径也能通过SOC1促进开花转型，这种激活SOC1表达的方式很可能是通过GA信号传导实现的。LFY是一个花序分生组织基因(floralmeristem identity gene)，在开花转型期被诱导，当花序分生组织出现后，LFY的表达逐渐增强。另外，作为花器官基因(floral organ identity gene)，LFY还能直接激活AP1的表达。LFY不受CO的直接调节，并且GA途径和长日照途径在LFY启动子上作用的顺式元件不同。这说明环境信号和内部信号是在LFY 这个下游基因发生整合而不是在哪个上游组分(图2)。

图2 调控拟南芥开花时间的四条途径

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