双水相体系萃取纤维素酶的研究

FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY

食品科技

2010年第 35卷第 12

期

纤维素酶是具有纤维素降解能力酶的总称, 其应用非常广泛,如蔬菜加工,果汁及粮食加工、天然有效成分的提取、饲料、造纸、纺织工业、采油工程、废水处理以及能源制造等方面 [1-3]。目前纤维素酶的分离纯化多采用盐析、凝胶色谱等方法。

双水相体系萃取具有条件温和,产品活性损失少,处理量大,设备投资小,操作简单,易于放大及连续操作等优点,广泛应用于蛋白质、酶、核酸及多糖等生物大分子的分离纯化 [4]。本课题以商业粗酶制剂为酶源,研究 PEG 浓度、硫酸铵浓度

及 pH 对 PEG4000/(NH4 2SO 4双水相体系萃取纤维素酶的影响,以确定合适的萃取条件。 1材料与方法 1.1

材料

纤维素酶:杭州绿柔生物科技有限公司;羧甲基纤维素钠:上海精析化工科技有限公司;聚乙二醇 4000:天津科密欧化学试剂开发中心。 1.2方法 1.2.1

纤维素酶活力测定

以柠檬酸 -硫酸氢二钠

Extraction of cellulase by aqueous two-phase system

SHU Guo-wei, WANG Chang-feng, CHEN He, YANG Zhi-wei

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(Collegeof Life Science and Engineering, Shaanxi University of Science and

Technology, Xi'an 710021

Abstract:The effects of concentration of polyethylene glycol, ammonium sulfate and pH on extraction of

cellulase from industrial cellulase in aqueous two-phase system of PEG -4000and ammonium sulfate were studied. The results show that:The conditions of aqueous two -phase systems extraction are as folows:concentration of (NH4 2SO 4is 8%, concentration of PEG400026%, pH4.8, The partition coefficient K and the recovery rate were 5.21and 79.4%respectively.

Key words:cellulase; aqueous two-phase systems; partition coefficient

舒国伟 , 王长凤 , 陈

合 , 杨志伟

(陕西科技大学生命科学与工程学院,西安 710021

摘要 :研究了聚乙二醇 4000-硫酸铵 (PEG4000/(NH4 2SO 4 双水相体系中, PEG 浓度、硫酸铵浓度

及 pH 对从商品纤维素酶样品中萃取纤维素酶的影响。结果表明:双水相体系的质量组成为 (NH4 2SO 48%, PEG400026%, pH4.8时,分配系数 K 为 5.21,萃取率为79.4%。

关键词 :纤维素酶;双水相;分配系数中图分类号 :O 658.2

文献标志码 :A

文章编号 :1005-9989(201012-0191-03

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双水相体系萃取纤维素酶的

研究

收稿日期 :2010-04-15

基金项目 :陕西省科技攻关项目 (2007JK01-13-2;咸阳市科技攻关项目资助

(K0311-2。作者简介 :舒国伟 (1977— ,男,四川内江人,硕士,讲师,研究方向为功能性食品及酶工程。

提取物与应用

·191

·

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(0.2mol/L, pH4.4 缓冲液配制 0.625%CMC-Na 底物溶液。取 0.5mL 酶液与2.5mL 底物溶液 50℃水浴保温 30min ,测定反应后还原糖含量,同时做空白对照。酶活定义为在上述条件下, 1h 产生 1mg 葡萄糖的酶量为 1个酶活力单位 (U[5]。1.2.2双水相萃取参考文献 [6]。 1.2.3萃取率的计算 [7]

y=RK/(1+RK

式中:y 为萃取率;

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R 为相比, R=Vt /Vb , V t 和 V b 分别是上相和下相的体积;

K 为纤维素酶的分配系数, K=Ct /Cb , C t 和 C b 表示上下相的酶活。

2

结果与分析

分别取不同体积的标准葡萄糖液于 25mL 比色管中,加水至 1.0mL ,再加入 3mL DNS 溶液。在沸水浴中蒸煮 5min ,立即冷却,定容后摇匀, 以不加葡萄糖的溶液作对照,在 500nm 测定其测吸光度,以葡萄糖浓度对吸光度作图,结果见图 1。

由图 1可知,标准曲线方程为:y=0.2447x-0.1367,相关系数 R 2=0.9972,即在

1~3.5mg/mL

范围内葡萄糖浓度和吸光度有着良好的线性关系。 2.1盐浓度对相比 R(Vt /Vb 影响

在聚乙二醇 PEG4000/(NH4 2SO 4双水相体系中,当 PEG 浓度为 18%,

pH4.8, T=20℃条件下进行,不同浓度 (NH4 2SO 4下相比 R 变化见图 2。

由图 2可知,在聚乙二醇 PEG4000/(NH4 2SO 4

双水相体系中。当聚乙二醇 PEG 浓度保持一定条件下,相比 R(上相体积 /下相体积随硫酸铵盐用量增加而减小。

2.2PEG 浓度对相比 R 的影响

在聚乙二醇 PEG4000/(NH4 2SO 4双水相体系中, 当 (NH4 2SO 4浓度为16%, pH4.8, T=20℃条件下进行,不同浓度 PEG 下相比 R 变化见图 3。

由图 3可知,在聚乙二醇 PEG2000/(NH4 2SO 4

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双水相体系中。当 (NH4 2SO 4浓度保持一定条件下, 相比 R(上相体积 /下相体积随聚乙二醇用量增加而增大。由萃取率 y=RK/(1+RK可知,为了提高萃取率,需要同时考虑分配系数 K 和相比 R 这 2个参数。

2.3(NH4 2SO 4浓度对萃取的影响

在聚乙二醇 PEG4000/(NH4 2SO 4双水相体系中,当聚乙二醇 PEG 浓度为18%, pH4.8, T=20℃条件下进行, (NH4 2SO 4浓度分配系数 K 和萃取率 y 的影响见图 4。

由图 4可知,在 8%~12%(NH4 2SO 4浓度范围内,分配系数 K 和萃取率 y 随(NH4 2SO 4浓度升高而减小。 (NH4 2SO 4浓度在 12%~20%范围内,分配系数 K 和萃取率 y 随 (NH4 2SO 4浓度升高而升高, 所以在 (NH4 2SO 4浓度为 12%时,分配系数 K 和萃取率 y 最小。由于 (NH4 2SO 4的加入,双水相体系中离子浓度也增大,离子在两相分配情况发生变化,当双水相达到平衡时,双水相必须保持电中性,因此在两相间会形成电位差,而电位差的大

0.80.60.40.201

1.5

22.53

3.5

y=0.244x-0.1367R 2=0.9972

葡萄糖浓度 /(mg/mL

A 540n m

图 1葡萄糖标准曲线

2.521.510.50

5 / 10

8

121620

(NH4 2SO 4/(%,w/w

相比 R 图 2盐浓度对相比 R 的影响3.5

32.521.510.50

1216

1822

26

相比 R

PEG4000浓度 /%

图 3EG4000浓度对相比 R 的影响

4.5

43.532.521.51分配系数 K

8

121620

(NH4 2SO 4浓度 /%

0.770.760.750.740.730.720.710.7

萃取率 y

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分配系数 K 萃取率 y

图 4(NH4 2SO 4浓度对萃取的影响

提取物与应用

·192

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小直接影响到分配系数 K 和萃取率 y 。但盐浓度不能过高,否则,会破坏纤维素酶表面的水化层, 纤维素酶在下相发生盐析,使分配系数 K 和萃取率 y 下降。 2.4

PEG4000浓度对萃取的影响

在聚乙二醇 PEG4000/(NH4 2SO 4双水相体系

中,当 (NH4 2SO 4浓度为 16%, pH4.8, T=20℃条件下进行,不同浓度 PEG 对分配系数 K 和萃取率 y 的影响见图 5。

由图 5可知,当在 PEG 浓度为 26%时,分配系数 K 和萃取率 y 为最大。出现这种原因主要是因为在 (NH4 2SO 4浓度一定下, W PEG 较低时,接近临界点,不易形成双水相,所以分配系数 K 和萃取率 y 比较小。随着 PEG 浓度的增大,系统远离

临界点,两相差别较大,易于形成两相 , 分配系数 K 和萃取率 y 增大。 2.5

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pH 对萃取的影响

双水相体系萃取纤维素酶在 PEG 质量分数为

22%, (NH4 2SO 418%, pH4.8, T=20℃条件下进行, pH 对分配系数和萃取率的影响见图 6。

从图 6可知,在 pH4.5~6.5范围内, pH 对分配平衡系数 K 和萃取率 y 的影响均显著,说明此双水相系统萃取纤维素酶可在较宽的 pH 范围内进行。 3

结论

双水相体系萃取纤维素酶的条件为:(NH4 2SO 4

浓度为 8%, PEG4000为 26%, pH4.8,在此条件下,分配系数 K 为 5.21,萃取率为79.4%。

参考文献 :

[1]A M Oinonen, J Londesborough, V Joutsjoki, et al. Vehmaanpera, Primalco Ltd. Biotec, three cellulases from Melanocarpusalbomyces for textile treatment at neutral pH [J].Enzyme Microb Technol,2004,34:332-341

[2]王岩岩 , 陈东海 , 车烈权 , 等 . 纤维素酶提取枸杞多糖及工艺优化 [J].食品科技 ,2007,28(3:104-106

[3]丁长河 , 鲁慧芳 , 张建华 , 等 . 果胶酶与纤维素酶对马铃薯浆黏度的影响 [J].食品科技 ,2006,27(2:55-57

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Biochemistry,2006,41:257-263

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[5]中华人民共和国轻工行业标准 QB 2583-2003, 纤维素酶

制剂 [S][6]

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PEG/fractionated dextran and PEG/industrialgrade dex -tran aqueous two-phase systems for the enzymic hydroly -sis of starch[J].Journal of Food

Engineering,2007,80:1213-1217

分配系数 K 萃取率 y

12

5.554.543.532.521.5

分配系数 K

0.85

0.80.750.70.65

0.6

萃取率 y

PEG4000浓度 /%

图 5PEG4000浓度对萃取的影响

9 / 10

分配系数 K 萃取率 y

5.554.543.532.521.51

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

0.7750.770.765

0.760.7550.75

分配系数 K

萃取率 y

pH

图 6pH 对萃取的影响

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