理论塔板数

理论塔板数

1、定义

理论塔板数（theoretical plate number）N，色谱的柱效参数之一,用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。如果峰形对称并符合正态分布，N可近似表示为： 理论塔板数=5.54(保留时间/半高峰宽)2

柱效率用理论塔板数定量地表示：N=16*（t/w ）2。其中，t是溶质从进样到最大洗脱峰出现的时间，w为该溶质的洗脱峰在基线处的宽度。在一色谱柱中用相同的洗脱条件时候，不同化合物的滞留时间与其洗脱峰宽度之比接近常数。因此理论塔板数大的色谱柱效率高。当然，N的大小和柱子长度有密切关系：理论塔板高度H=柱长/N，用H可以衡量单位长度的色谱柱的效率，H越小，则色谱柱效率越高。

N为常量时，W随tR成正比例变化。在一张多组分色谱图上，如果各组份含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。

用半峰宽计算理论塔板数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更容易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。

N与柱长成正比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。（一般HPLC柱的N在1000以上。）

若用调整保留时间（tR′）计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数（N有效或Neff）=16(tR′/W)2

我们知道实际操作过程中，峰会出现拖尾的情况，所以，实用半峰宽比使用峰宽要准确一些，当然这也不是绝对的。

理论塔板高度和理论塔板数都是柱效指标，，由于峰宽或半峰宽是组分分子在色

谱柱内离散的度量，总的离散程度是单位柱长内分子离散的累计，其与柱长成正比。

理论塔板数首先应该是和柱子的性能是有关系的，像填料，柱长什么的，和你的流动相，流速，样品分子量大小都是有关系的。每个峰的理论塔板数肯定是不同的，理论塔板数越高峰形越好。

2、理论塔板数下降后可以考虑色谱柱再生

（1）、反相柱

分别用甲醇：水=90：10，纯甲醇（HPLC级），异丙醇（HPLC级），二氯甲烷（HPLC级）等溶剂作为流动相，依次冲洗，每种流动相流经色谱柱不少于20倍的色谱柱体积，然后再以相反的次序冲洗。

（2）、正相柱

分别用正己烷（HPLC级），异丙醇（HPLC级），二氯甲烷（HPLC级），甲醇（HPLC级）等溶剂做流动相顺次冲洗，每种流动相流经色谱柱不少于20倍的柱体积(异丙醇粘度大,可降低流速，避免压力过高)。注意使用溶剂的次序不要颠倒，用甲醇冲洗完后，再以相反的次序冲洗至正己烷.所有的流动相必须严格脱水。

（3）、离子交换柱

长时间在缓冲溶液中使用和进样，将导致色谱柱离子交换能力下降，用稀酸缓冲溶液冲洗可以使阳离子柱再生，反之，用稀碱缓冲溶液冲洗可以使阴离子柱再生。

另外，还可以选择能溶解柱内污染物的溶剂为流动相做正方向和反方向冲洗，但再生后的色谱柱柱效是不可能恢复到新柱的水平的。

如果柱子装反了可以调回来，但可能会造成柱内担体塌陷，在不得已的情况下尽量不要反装色谱柱。 提问一：塔板理论困惑？（塔板数和峰宽有关，当进样浓度变化时，峰宽变吗？） 回答：楼1: Originally posted by 605108287 at 2012-02-21 1655：保留时间不变，峰高变高，峰宽变宽。 辩论楼1：峰宽变了，由塔板理论得出塔板数也变大，难道塔板数会随浓度变化而变化？一个柱子的塔板数不但和样品有关，还和样品的浓度有关？ 楼2: Originally posted by yinyao2300 at 2012-02-22 1231：提到色谱柱，就要引入Van Deemter方程了，流速一定，理论塔板高越低，柱效越高。理论塔板数，决定了色谱柱上的保留情况，可以说是理论塔板数越多，峰越窄。理论塔板数是不会随浓度变化而变化的，只是你可以从峰的宽窄上面看出柱效的高低。 辩论楼2：塔板理论有缺陷，不能说明流速对其影响。但是如果塔板数和浓度没关系的话，那么1ng和1mg的同一样品是否有同样的峰宽，只是峰高不同。 楼3: Originally posted by yinyao2300 at 2012-02-22 2119：个人觉得如果你是真的在乎实践中的样品不同浓度的峰宽的话，你应该将色谱柱的因素考虑进去，比如填料，键合相。你将理论带入实际中也应该考虑实际中能否达到理论的要求 。

辩论楼3：不考虑实际，也不考虑速率方程，只说塔板理论，是不是对于同一种物质的不同浓度的峰宽是一样的，而量只是体现在峰高上。

如果实际峰宽不一样，只是说明塔板理论有缺陷，不如速率方程完善。（但是塔板理论简单易用）。不知道我这样理解对不对。

楼4: Originally posted by 补天士Sai at 2012-02-22 2203：额不太确认现在想的对不对，首先肯定是保留时间不变,但是浓度越高需要越多的理论塔板实现分离，所以n变大，W变大,也就是说同样一根柱子在低浓度下能实现分离，在高浓度下也许就不能了 。

辩论楼4：我明白了，塔板数和浓度没有关系。也就是说按照塔板理论，浓度不影响峰

宽只影响峰高。

补充：色谱流出曲线方程及定量参数（峰高h和峰面积A） 由色谱流出曲线方程可知：当t＝tR时，浓度C有极大值。Cmax就是色谱峰的峰高。因此：①当实验条件一定时（即σ一定），峰高h与组分的量C0（进样量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。②当进样量一定时，σ越小（柱效越高），峰高越高，因此提高柱效 色谱柱 能提高HPLC分析的灵敏度。 由流出曲线方程对V(0~∞)求积分，即得出色谱峰面积A。可见A相当于组分进样量C0，因此是常用的定量参数。把Cmax＝h和Wh/2＝2.355σ代入上式，即得A＝1.064×Wh/2×h，此为正常峰的峰面积计算公式。

高效液相色谱操作知识

（一）高压恒流泵的维护注意事项

泵的密封圈是最易磨损的部件，密封圈的损坏可引起系统的许多故障，要注意保养和定期更换。应采取下列措施以延长使用寿命：

绝对不允许在没有流动相的或流动相还没有进入泵头的情况下启动泵而造成柱塞杆的干磨。 每天使用后应将整个系统管路中的缓冲液体冲洗干净，防止盐沉积，整个管路要浸在无缓冲的溶液或有机溶剂中。长期不用也要定期开泵冲洗整个管路。要用HPLC级试剂 ，输液管前端要用烧结不锈钢沉子过滤流动相。要注意防止管路阻塞造成压力过高而损坏仪器。 压力下限应设置在0.5~1MPa，以防止储液器中的流动相被抽干或严重渗漏而引起柱塞的干磨，有柱后清洗功能的高压恒流泵还要注意保持清洗液，否则将失去柱后清洗效果。 (二)流动相使用的注意事项

必须使用HPLC级或相当于该级别的流动相，并要先经0.45um薄膜过滤。

过滤后的流动相必须经过充分脱气，以除去其中溶解的气体（如02），如不脱气易产生气泡，增加基线噪声，造成灵敏度下降，甚至无法分析。

几种脱气方法比较：

1、 氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好但成本高。 2、 加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。 3、 抽真空脱气法：易抽走有机相

4、 超声脱气法：一种较为常见的脱气法。流动相放在超声波容器中，用超声波震荡10~15

分钟，此法效果并不太好但操作简单。

如果管路中使用peek树脂部件，请不要使用下列流动相：浓硫酸、浓

硝酸、二氯乙酸、丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿和二甲基亚砜 。

特别注意HPLC使用过后的系统清洗：

含有缓冲盐溶液的流动相的清洗方法：

1、 先用100%的纯水冲洗，打开排放阀，用3~5ml/min的流量，洗二十分钟左右后停泵。 此举主要是针对吸液系统、泵头、进出口单向阀等体积较大的空间的清洗。

2、 再用5：95的甲醇/水清洗整个系统，关闭排放阀，用1ml/min的流量，洗30~60分钟后停泵。此举主要是用水清洗整个系统中的盐，用5%的甲醇主要是为了保护色谱柱。 3、 最后用100%的甲醇清洗整个系统，用1ml/min的流量，洗2分钟左右，然后关机。 如果流动相中不含盐，则使用上述第三步清洗即可。 (三)流动相的更换

在分析过程中，有时需要更换流动相进行分析。一定要注意前一种使用的流动相和所更换的流动相是不是能够相溶。如果前一种使用的流动相和所更换的流动相不能够相溶，那您就要特别注意了。要采用一种与这二种需更换的流动相都能相溶的流动相进行过滤、清洗。 较为常用的过滤流动相为异丙醇，但实际操作中要看具体情况而定，原则就是采用与这二种需更换的流动相都能相溶的流动相。一般清洗时间为30~40分钟，直至系统完全稳定。 如不进行以上“特别注意”上述步骤的操作，将会导致系统管路阻塞。严重时将引起流通池污染堵塞，不得不更换流通池。用户就要承担不必要的损失了。 储液器的注意事项：

保持流动相储液器的清洁是保证仪器正常使用的关键。要使用HPLC级的溶剂，对试剂含有缓冲盐及非HPLC级的流动相一定要用0.45?m过滤器除区去其中的微量物质。

仪器操作步骤

1）、过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。 2）、对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。

3）、打开液相色谱工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。

4）、 进入液相色谱仪控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。

3、 操作过程若发现压力非常高，则可能管路已堵，应先卸下色谱柱，然后用分段排除法检查，确定何处堵塞后解决。若是保护柱或色谱柱堵塞，可用小流量流动相或以小流量异丙醇冲洗，还可采用小流量反冲的办法（新柱不提倡），若还是无法通畅，则需换柱；

4、 运行过程中自动停泵，可能为压力超过上限或流动相用完；

5、 样品瓶中样品较少，自动进样器进样针无法到达液面，可采用调低进样针进样高度的办法，注意设置时不要使进样针碰到瓶底，微量样品分析应使用微量样品瓶；

6、 自动进样器进样针未与样品瓶瓶口对准时，需重新定位。

7、 泵压不稳或流量不准，可能为柱塞杆密封圈问题或seal wash垫圈问题，需更换； 8、 基线产生不规则噪声，可能原因为系统不稳定或没达到化学平衡（使其平衡，若用离子对试剂，在首次使用使需要足够的时间和溶剂体积，色谱柱才能达到足够的平衡），流动相被污染（更换流动相，清洗储液器、过滤器，冲洗并重新平衡系统），色谱柱被污染（为证明可能的原因更换系统的色谱柱或使用一根同类的被证明性能好的色谱柱），检测器不稳定；

9、 短期有规则的噪声，可能原因为泵压不稳或泵脉冲，调节溶剂不适当（如两种溶剂的互溶性问题），泵入口管路松或堵塞，泵太脏，泵柱塞磨损，检测器不稳定；

10、长期有规则噪声，可能原因为室温不稳（未使用柱温箱）或使用柱温箱不当； 11、基线漂移，可能原因为系统不稳或没有达到化学平衡，室温不稳（未使用柱温箱），流动相污染或分解，柱污染，检测池泄漏，系统泄漏，固定相流失（另选流动相，另选色谱柱），测定的波长选择错误（对溶剂有吸收），样品组分保留太长（用强度合适的溶剂清洗色谱柱），检测器不稳定；

12、每次进样时的保留时间不重复，可能原因为系统不稳或未达到化学平衡，由于气泡、各部件磨损等原因引起的泵压或泵脉冲输液不稳定，进样体积太大或样品浓度太高平衡被破坏，溶剂配比不合适，柱被污染；

13、无峰，可能原因为检测器选择错误，使用错误的流动相，样品降解；

14、色谱峰比预计的小，可能原因为进样体积错误，检测器灯故障，进样问题（瓶号错、进样体积不合适、进样错误、针头堵塞）；

15、峰变宽，可能原因为进样体积太大或样品浓度太高，过滤器、保护柱入口、柱入口或连接管路有部分堵塞，检测器时间常数设置错误，进样器问题（如阀漏、针头堵塞或损坏），柱或保护柱被污染，对流动相来说样品溶剂太强，使用错误的色谱柱，温度变化；

16、出现双峰/肩峰，可能原因为保护柱或柱入口部分阻塞，柱或保护柱被污染，柱性能下降，保护柱失效，进样体积太大或样品浓度太高（样品过载），平衡破坏；

17、前沿峰，可能原因为进样体积太大或样品浓度太高（样品过载），平衡破坏，对于流动相来说样品溶剂非极性太强（对于反相柱），柱或保护柱被污染，柱性能下降，保护柱失效；

18、脱尾峰，可能原因为柱或保护柱被污染，柱性能下降，保护柱失效，进样器问题（如阀漏等），检测器时间常数设置错误；

19、出现鬼峰，可能原因为流动相被污染，样品预处理时产生降解或混入杂质，先前进样的流出物，样品定量管清洗不当，注射器脏，柱被污染，进样装置被污染，流动相中含有稳定剂/稳定剂变化。

液相色谱常见问题及处理方法

一、HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法 1． 样品量不足，解决办法为增加样品量

2． 样品未从柱子中流出。可根据样品的化学性质改变流动相或柱子 3． 样品与检测器不匹配。根据样品化学性质调整波长或改换检测器 4． 检测器衰减太多。调整衰减即可。

5． 检测器时间常数太大。解决办法为降低时间参数 6． 检测器池窗污染。解决办法为清洗池窗。 7． 检测池中有气泡。解决办法为排气。 8． 记录仪测压范围不当。调整电压范围即可。 9． 流动相流量不合适。调整流速即可。

10． 检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。 二、为什么HPLC柱柱压过高

柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。1． 拆去保护预柱，看柱压是否还高，否则是保

护柱的问题，若柱压仍高，再检查；2．把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查；3． 将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池）。这时，如果柱压仍不下降，再检查；4． 更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。一般情况下，在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题，SGE提供的heodyne 7315型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。 三、液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？

1．筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。 2．存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子. 四、如何解决HPLC进行分析时保留时间发生漂移或急速变化 1． 温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定 2． 流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等 3． 柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡快速变化现象 4. 流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定 5． 泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。

6．流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合 五、HPLC仪器问题

1、我的HPLC泵压明显的偏高，请问可能的原因？

答：流速设定过高；流动相或进样中有机械杂质，造成保护柱、柱前筛板或在线过滤器阻塞；流动相粘度过大；柱温过低；缓冲盐结晶；压力传感器故障。 2、基线不稳，上下波动或漂移的原因是什么，如何解决？

答：a.流动相有溶解气体；用超声波脱气15-30分钟或用充氦气脱气 。

b.单向阀堵塞；取下单向阀，用超声波在纯水中超20分钟左右，去处堵塞物。 c.泵密封损坏，造成压力波动；更换泵密封。 d.系统存在漏液点；确定漏液位置并维修 e.流通池有脏物或杂质；清洗流通池 f.柱后产生气泡；流通池出液口加负压调整器

g.检测器没有设定在最大吸收波长处；将波长调整至最大吸收波长处

h.柱平衡慢，特别是流动相发生变化时；用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。 3、接头处为何经常漏液，如何处理？

答：接头没有拧紧；拧松后再紧，手紧接头以手劲为限，不要使用工具，不锈钢接头先用手拧紧，再用专用扳手紧1/4-1/2圈，注意接头中的管路一定要通到底，否则会留下死体积。接头被污染或磨损；建议更换接头。接头不匹配，建议使用同一品牌的配件。 4、进样阀漏液是如何造成的？ 答：a.转子密封损坏；更换转子密封 b.定量环阻塞；清洗或更换定量环 c.进样口密封松动；调整松紧度

d.进样针头尺寸不合适，一般是过短；使用恰当的进样针（注意针头形状） e.废液管中产生虹吸；清空废液管 六、谱图问题

1、 问：造成峰分叉的原因是什么，如何消除？

答：保护柱或分析柱污染；取下保护柱再进行分析。如果必要更换保护柱。如果分析柱阻塞，拆下来清洗。如果问题仍然存在，可能是柱子被强保留物质污染，运用适当的再生措施。 如果问题仍然存在，入口可能被阻塞，更换筛板或更换色谱柱。

样品溶剂不溶于流动相；改变样品溶剂，如果可能采取流动相作为样品溶剂。 2、 问：K'值增加时，拖尾更严重，这是为什么？ 答：反相模式，二级保留效应； a.加入三乙胺（或碱性样品） b.加入乙酸（或酸性样品） c.加入盐或缓冲剂（或离子化样品） d.更换一支柱子

3、 问：保留时间的波动有几种可能的原因？

答：温控不当；调节好柱温。流动相组分变化；防止流动相蒸发、反应等，做梯度时尤其要注意流动相混合的均匀。色谱柱没有平衡；在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱。 七、问：HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法 1． 样品量不足，解决办法为增加样品量

2． 样品未从柱子中流出。可根据样品的化学性质改变流动相或柱子

3． 样品与检测器不匹配。根据样品化学性质调整波长或改换检测器 4． 检测器衰减太多。调整衰减即可。

5． 检测器时间常数太大。解决办法为降低时间参数 6． 检测器池窗污染。解决办法为清洗池窗。 7． 检测池中有气泡。解决办法为排气。 8． 记录仪测压范围不当。调整电压范围即可。 9． 流动相流量不合适。调整流速即可。

10．检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。 八、问：毛细管色谱分流进样时，非线性分流的主要原因是什么？ 1 进样器温度太低，样品汽化不完全，发生分级分流。

2 进样器温度太高，某些组分可能发生热分解，也有的样品可能发生催化分解，或样品部分地被吸附在进样器内表面上。

3 在分流点以前样品没有混合均匀或混合不充分。 4 系统的进样垫、柱接头等地方漏气。

九、问：做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在？如何解决？ 答：原因可能有：

1． 泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理； 2． 比例阀失效，更换比例阀即可； 3． 泵密封垫损坏，更换密封垫即可；

4． 溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法； 5． 系统检漏，找出漏点，密封即可； 6． 梯度洗脱，这时压力波动是正常的。

十、问：做PGS/MS分析时，如何防止焦油状污染物进入毛细柱？

答：聚合物，尤其是一些含氮，硫及卤素的高分子裂解时，常有焦油状物质产生。为防止这种焦油状物质进入毛细柱造成污染而使柱性能下降，可采用保护预柱，即在裂解器与毛细柱之间接一填充预柱，通过控制预柱温度而使焦油状物质滞留在预柱内，预柱可置于GC气化室内，这样既容易控制温度，又减少系统的死体积，当然，预柱填料需经常更换。 十一、问：更换了另一种牌号的ODS柱，虽然分离情况仍可以，但保留时间不能重现，为什么？

答：这是因为被分析物可能具有形成氢键的能力。尽管过去几年来，填料的制造技术有了极

大的提高，但不同的厂商的ODS填料表面硅醇基的浓度不同。正是这些硅醇基可能与样品发生相互作用。因此，同一被分析物中的各组分在不同牌号的ODS柱上的相对保留时间就可能不同。在流动相中加入少量竞争物，如三乙基胺（TEA），将会使硅醇基的成键能力饱和，从而能保证不同牌号柱子上的相对保留时间具有较好的重现性。 十二、问：购买的HPLC柱验收测试时柱压过高，请问为什么？

答：柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。

1． 拆去保护预柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查； 2． 把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查；

3． 将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池）。这时，如果柱压仍不下降，再检查；

4． 更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。

一般情况下，在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题，SGE提供的Rheodyne7315型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。 十三、问：高温毛细柱的使用寿命一般为多长？

答：毛细柱寿命锄决定于柱子本身的性能外，在很大程度上取决于使用情况，如使用温度、样品状态，进样量等，如果在其使用温度范围内，样品干净，色谱柱不被污染的情况下，柱子寿命一般在2-3年之间。

十四、问：BPX70毛细柱是否可用于GC/MS分析？

答：完全可以。BPX70为极性柱，使用温度范围宽（25-260C），程序升温可达290C，流失低，适合于分析脂肪酸甲酯的的各种位置和几何异构体，药物异构体，碳水化合物等。因BPX70为交联柱，故用于GC/MS很稳定，污染后可清洗再生。

十五、问：如毛细管柱被污染，柱效和分辨率降低，有何方法使它恢复？是否可通过老化来解决？

答：根据柱污染程度可采取不同的方法来解决，如果污染不严重，污染物沸点不是太高，可通过老化来解决，但老化温度不可超过柱子的最高使用温度，且一般要较长时间（8-30）小时，如果污染较严重，或通过老化仍不能使柱性能恢复，那就必须采用溶剂清洗，通常是用5倍柱容积的溶剂（如正戊烷，二氯甲烷等）通过色谱柱。当然，清洗熔剂用的越多，对柱

性能的损坏越大，清洗完后，在通载气老化一定时间，如果柱性能恢复，便可继续使用。 必须指出：只有交联柱才能清洗，对于非交联柱，清洗柱子会彻底失效，因为固定液被洗掉了，至于清洗用熔剂的选择，可参考说明书。[/hide]

色谱常见故障及排除方法

1、柱压升高T

色谱柱入U滤片被流动相或样品中颗粒堵住。样品组分在滤片上沉淀堵住滤片。 卸下入口接头的滤片，使用1：1的硝酸溶液超声清洗5min，再用水、甲醇清洗除去水份。样品及流动相使用0．45µm滤膜除去微量杂质。使用流动相作溶剂配制样品。 2、新柱柱效低 F

柱外死体积大.样品在流动相中溶解不好，影响传质过程。 更换连接管，重新连接色谱柱，降低死体积。使用合适的流动相或使用流动相溶解样品。 ? 3、旧色谱柱柱效低，分离不好，柱入口床层塌陷。Qt5e(,

填料被流动相溶蚀而流失。 用同型填料填补柱效可部分恢复。对硅胶质填料，流动相PH值在2—7范围内，否则可能被溶蚀。 l 4、旧色谱柱柱效低分离不好，有时出现双峰。v

入门填料被污染变质所致。 用强溶剂冲洗。刮除被污染的床层，用同型的填料填补柱效可部分恢复。污染严重，则废弃或重新填装。 5、新柱接到仪器上后，柱头漏液。E

柱接头与仪器之间连接管的压环变形量不够。 用扳手顺时针方向拧紧1／4圈直到不漏液为止。 ,

6、新柱接到仪器上后，启动仪器没有柱压降。Zm

柱放置时间过长柱内充装的液体己挥发干。 继续开泵，用流动相将柱内气体置换掉。 xL7 7、新柱接到仪器上后，检测器出口不断有小气泡出现。S\\T

①同上。② 流动相脱气不彻底特别是MeOH／H20体系由于氢键作用很容易出现气泡。 ①同上。②配好流动相后一定要进行脱气处理。 k

8、新柱接到仪器上后柱压降不断增加，甚至超过仪器的耐压限。f

柱入口滤片被固体颗粒堵塞(或被毒菌堵塞)。更换或清洗柱入口滤片；用0．45µm过滤膜过滤流动相除去微小颗粒物。 X9Ks=x 9、进样次数增加柱压降逐渐增加。.

①样品中含有不溶于流动相的微小颗粒物。②样品在流动相中析出微小结晶。 ①用0．45µm过滤膜过滤样品。②推荐使用流动相溶解样品。 bx 10、使用—段时间后，柱效下降，分离不好。p

①柱填料被流动相溶解而流失。②柱填料被样品杂质污染。 ①推荐使用予柱。如柱床层塌陷，用相同型号填料填补。②推荐使用保护柱或用强溶剂冲洗色谱柱除去污染杂质。 K1)0j 11、柱使用一段时间后，柱效下降出现双峰。

柱入口床层被污染使柱填料变质。 用强溶剂冲洗除去杂质。 c,=O 12、柱使用—段时间后，柱效下降，出现峰拖尾。

柱入口床层被污染。 用强溶剂冲洗20-30ml，若效果不明显应废弃。 13、进样量增大与峰面积增加不成正比．即进样量与峰面积不是线性关系。

样品在流动相中的溶解度小，只有部分样品被流动相冲如色谱柱中而另一部分则沉积在柱人口端。 ①用流动相溶解样品。②样品的浓度不宜太大。④进样量不宜过大。 14、使用缓冲液作流动相时，柱压降升高很快。 M

霉菌生长所致。 ①在流动相中加入有毒物质或加叠氯化钠防止霉菌生长。②实验结束后先用纯水后用MeOH各冲洗20-30ml后关机。

15、用5µm颗粒填料柱时， 以MeOH／H20作流动相柱压较高。

MeOH与水之间由于氢键作用黏度增大。 可用乙腈／水体系使柱压降低，分离效率更好。 16、长时间放置的色谱柱，出现双峰。

柱床层出现干裂。 柱放置时，最好使用相应的溶剂充填好，防止受大的机械震动，如床层干裂应废弃掉。

17、流动相洗涤强度由弱渐强时出现很多杂质峰

强溶剂将弱溶剂洗不出的杂质冲出来。 不影响柱的性能。 18、柱使用一段时间后保留值逐渐缩短

柱中固定相流失所致。 ①更换色谱柱。②检查所用的色谱条件是否合适。 TM< 19、在U V色谱图中，*近死时间处出现负峰。WF`2TK

①进样时压力波动所致。②样品溶剂比流动相的UV吸收值低。 ①采用阀进样。 ②用流动相溶解样品。

简述液相色谱单向阀故障判断和排除

通常情况下，液相色谱高压输液泵的单向阀有输入单向阀和输出单向阀，单向阀的基本工作原理：液体只从阀的一端进去，另一端出来，即液体呈单向流动。

单向阀中最关键的部件是宝石球和宝石球座，宝石球是非常光滑的球体，球座为园矩形，它有光滑面和毛面之分，安装时，宝石球应放置在球座的光面上，可以达到非常好的密封效果。当柱塞杆抽动时，宝石球上浮，单向阀被打开，液体进入单向阀；当柱塞杆推动时，液体被排出单向阀，同时宝石球下浮回到球座，封堵被排出的液体，使液体不能回流。 单向阀故障通常有两种情况：

1、单向阀被堵死，其外在表现为：液体出不来，无压力显示。

这种情况往往是宝石球和球座粘住了，流动相进不去，当然也出不来。一般也是用过缓冲液作流动相，由盐存在粘住的，或者流动相较脏、粘度高而引起的。 2、单向阀被污染，其外在表现为：压力波动大。

这种情况通常都是球座上有细微的固体颗粒，固体颗粒有可能是盐析出，尤其是在使用缓冲液作流动相后，导致宝石球和球座密封性不好，流动相有回流现象。 处理方法：

当确认是单向阀故障后，将单向阀小心拆卸下来，将入口单向阀和出口单向阀分别标注，然后置于预先加入纯净水的玻璃烧杯中，注意将宝石球向上放置，按以下顺序进行：纯净水超声清洗10分钟以上，纯净水最好事先加热至50℃左右，这样效果更好；换甲醇超声清洗15分钟。 检查：

将单向阀按原样装上，注意不要将进口阀和出口阀装错，先用针将泵中空气抽出，按正常操作顺序开启泵，检查有无泄漏点，检查泵压是否正常。此时流动相一般为甲醇。如果还有压力不稳或测不到泵压，请重复以上处理操作。 预防措施：

1、流动相一定要先超声，再经0.45微米膜过滤。

2、使用盐缓冲液作流动相后，先要用纯净水冲洗管路，将盐冲洗干净，才能在流动相中加入一定比例的甲醇或乙腈等有机溶剂，决不能直接使用有机溶剂冲洗。

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