抗 CD20 嵌合抗体的表达与活性检测

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：中国生物工程杂志$H;98<;E:LOH9EQE.R，&""?，&?（#）=GS=>

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研究报告

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摘要关键词

抗!"#$嵌合抗体的表达与活性检测

师明磊胡显文#陈惠鹏高丽华李世崇

（军事医学科学院生物工程研究所

北京

!"""#!）

表达了基因重组抗$%&"嵌合抗体并对其生物学活性进行了初步鉴定。设计合成轻、重链

可变区序列；提取血液’()，通过’*+,$’得到人!、重链恒定区序列。运用重叠延伸-./!的轻、连接可变区与恒定区，将轻、重链基因连接至0-’12双表达载体。将质粒以阳离子脂质体转,$’，

共获得#株表达较高的克隆，表达量约为&6.75。扩大培养阳染$34细胞，15-2)挑选阳性克隆，性克隆89:;+$%&"+!<=，收获上清，以蛋白)进行亲和层析纯化表达蛋白。2%2+,)/1检测表明纯

化纯度达到>?@，蛋白相对分子量与理论值吻合。以$%&"A细胞’8B;、表明%8CD;、’86ECF检测，该抗体能与$%&"抗原特异性结合，体外杀伤试验说明抗体能够杀伤$%&"A淋巴瘤细胞。

非霍奇金淋巴瘤

$%&"

单克隆抗体

嵌合抗体

载体0-’12（。%3?$QE9:LOH）"感受态大肠杆菌、（%EC0FE9）*8[酶、,RNE\LF:酶、%()连接酶、*G多聚核苷酸激酶（、限制性内切酶!"#-、*G,(W）!"#--、限制性内切酶$%&’---、()"-均为*8W8’8产品，

*"+$-、,#-.-、/01-、/-2-为(1<公司产品。质粒提取、酶切产物回收分别采用,$’产物回收、

,NE6L.8公司];^8ND,QCF2_X;9;0NL0F%()];^8ND,$’0NL0F%()0CN;‘;O8:;E90CN;‘;O8:;E92RF:L6、

FRF:L6、];^8ND%()OQL89+C0试剂盒，’()提取试剂

。*N;^EQ（-9Z;:NE.L9）%&#

抗体轻、重链可变区的合成

=，G］

根据文献报道［及计算机模拟，我们设计合

非霍奇金淋巴瘤（9E9+3ED.P;9’FQR60HE68，

是最常见的血液系统恶性肿瘤，也是发病率增(35）

长最快的恶性肿瘤之一，我国每年约有=SG万人死于该病。目前的放、化疗对(35有部分疗效而副作用极大，因此研制更加高效低毒的药物很有意义。约T?@S>"@是<细胞淋巴瘤，而(35患者中，

$%&"是<淋巴细胞和<淋巴瘤细胞表面专有的膜表面蛋白，不表达于造血干细胞、原始<细胞、正常

!］

血浆细胞以及其它正常组织［。因此研制抗$%&"的单克隆抗体就可能专一性地杀伤<细胞和<淋巴瘤细胞，达到更好的治疗效果。美国/L9L9:LOH和-%1$公司开发的89:;+$%&"嵌合抗体于!>>#年获得是第一个用于肿瘤治疗的治疗性抗U%)批准上市，

体，由于其在非霍奇金淋巴瘤治疗中表现出较好的疗效和较低的毒副作用，已经成为美国销售额最大的抗肿瘤药物。本研究旨在研制抗$%&"嵌合抗体，并对其生物学活性进行初步检测。

成轻、重链可变区序列如下（见下页页首），该序列不仅在$%’=区与’;:CJ;68\不同，其U’G区采用人基因序列，因此人源化程度也较’;:CJ;68\更高。

异于’;:CJ;68\的部分用下划线标出。

因现有碱基合成水平只能精确合成T"个碱基以下的基因序列，过长则误差较大，为便于化学合成，根据以下原则设计合成基因的寡核苷酸片段：相邻的&条寡核苷酸片段间约有&"碱基互补，寡核苷尽量保证各互补寡酸片段长度一般长约#?个碱基，

核苷酸片段互补序列的退火温度一致。用重叠延伸

?］

重链可变区寡核苷酸片断［。,$’方法组装合成轻、

%材料与方法

%&%

载体、菌种及相应试剂

，0/1X+*18FR质粒0V$!>质粒（*8W8’8）

（，0O%()=Y!（质粒（，双表达,NE6L.8）A）-9Z;:NE.L9）

收稿日期：&""?+"!+&#

修回日期：&""?+"?+&G

电子信箱：HCIJ;89KL9M:F;9.HC8IEN.IO9#通讯作者，

总体顺序：下同）和&，!）将片段!（_5!或_3!、=和

$）+=="，+"（

师明磊等：抗’>+=嵌合抗体的表达与活性检测

,"

进行重叠延伸&’(，得到!，"和#，$和%分别混合，

)*+，,*!，"*#，$*%。+）将)*+和,*!，"*#和$*%分别混合进行重叠延伸&’(，得到)*!和"*%。,）混合)*!和"*%，重叠延伸&’(

得到基因全长。

@基因重组4*,&A#B@C抗体的:D$EF表达载体%&’(@

:D$EF=&/&+,-)*&/8;:-8++&)*58/,)-G&,31，2/34&*’8*8+8H.8*/8

!>I引物

&’(主要引物见表)。

+E

中国生物工程杂志*[HA3<H1OB?[A1@1S>

表!%&’()!

"#$主要引物"*+,)*-./*"#$

功能碱基!"#,酶切位点$%&’,,,酶切位点!"#,酶切位点$%&’,,,酶切位点

-1@a;$W1aC;PP$

引物名称!"#!".!/#!/."上"下/上/下-"#,,-".,,*"#,,*".,,-/#,,-/.,,*/#,,*/.,,

碱基序列

$%&’(’!"!#$#’())’((((*’))()*’)’((’(*&+%$%&’(’##$"!!((()’(((**’)*(())(****&+%$%&’(’!"!#$#’()))(())’)**(*’(*(()*&+%$%&’(’##$"!!’)’)’*))()’**)(***(()&+%$%&((*))’))))))’**’’))()&+%$%&(*’’*’*(*(****()(()’’)&+%$%))**’’)))’**’*))(*’*&+%

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$&)()$$#!""’*((’**()(()*(((*(()(**’**(())()(()*&+

说明-"上游引物-"下游引物-/上游引物-/下游引物*"上游引物*"下游引物*/上游引物*/下游引物

()*,酶切位点01234序列

重叠片段

+,-.,酶切位点

!"#,酶切位点01234序列

重叠片段

/#0$,酶切位点剪接供体

"上游引物重叠延伸引物"下游引物/上游引物重叠延伸引物/下游引物

轻链可变区基因；引物合成及序列测定由上海博亚公司完成-"：-/重链可变区基因；*"轻链恒定区基因；*/重链恒定区基因；

!01细胞系及培养条件!06表达蛋白的纯化及初步测定

培养条件为.7879*/5&06细胞为本室保存，

，含$=加强型小牛血清),<*5）:6;培养基（

［］

（，培养于$=*5;、/>?@1AB）+CD温箱E。F3GH、.3IJH、F3K1IL、MIN43O细胞均购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心，/"EP购自中国药品生物制品检定所，培养条!<7*由健康人血液分离，件均为F!7,6EQP培养基（，含$=胎牛血清),<*5）（，培养于$=*5;、/>?@1AB）+CD温箱。!02

转染#34细胞及筛选阳性克隆

转染采用,ARHON1SBA公司生产的"HT1UB?O3KHAB（按照试剂盒说OK）;PPP阳离子脂质体转染试剂盒，明书操作。对照采用空T,F8V载体及鲑精.W’转染*/5细胞。采用)Q6X（VHSK3）$PPS9K@加压筛!选，加压约6PJ后，挑出单克隆孔，以直接竞争

用无血清培养上清直接包被8",V’挑选阳性克隆，

W#W*(7酶联板QD过夜，+=<V’封闭后加入/F!

标记山羊抗人,S)（，孵育后加入(7<试剂显/Y"）色，Q$PAK测5.值。以无血清F!7,6EQP培养基为

C］

阴性对照［。!05

单克隆的扩大培养及蛋白收获

选择表达水平最高的基因重组*/5工程细胞系3AOH&*.;P&6<+于6PPPK@转瓶中用含;=小牛血清的.7879:6;培养基培养，待细胞长满瓶壁时，换为无血清培养基，隔天收液，可连续进行收液+Z$次。

利用蛋白’对,S)的特异性吸附作用，采用A!N1OBHA’VBT[3N1LBQ:3LO:@1\分离介质（’KBNL[3K进行亲和层析，纯化表达蛋白。操作方<H1L?HBA?BL）

法参见产品说明。纯化后，以紫外分光光度计测定按6]Q$’;XP&P]CQ’;EP推算蛋白’;EP和’;XP值，

X］

浓度［。以V.V&!’)8测定蛋白的纯度、分子量。!07

细胞89:;<检测产物的特异性

以*.;PY细胞F3GH、均为<IN4HOO.3IJH、F3K1IL（淋巴瘤细胞）检测表达抗体对*.;P的结合能力；以人白血病细胞株/"EP以及(淋巴瘤细胞株MIN43O、

均!<7*检测表达抗体与*.;P^细胞的结合情况，以!N1OBHA’洗脱缓冲液)@>&/*@为阴性对照。操

作时以细胞直接包被W#W*(7酶联板（经多聚赖氨酸处理），待细胞附于底部后，以戊二醛固定，+=孵育后充分洗涤，再加<V’封闭后加入表达抗体，入/F!标记山羊抗人,S)（，孵育后加入(7</Y"）试剂显色，Q$PAK测5.值。

!0!=检测产物对#>?=@细胞的杀伤作用

_，6P］

根据文献报道［，抗体与*.;P结合以后，能够引起细胞凋亡，从而达到消除肿瘤细胞的作用，

因此，我们将该抗体直接加入*.;PY细胞F3K1IL的培养体系中，观测抗体的杀伤细胞作用。在_E孔板中培养细胞，保持各孔细胞数目相等，将抗体稀释至P]$、$、$PS9K@+个浓度加入至相应细胞!孔，以’AAB‘HA-、+CD作用;Q[后，!,双染（’AAB‘HA

-）.557，.7（

师明磊等：抗(=.5

嵌合抗体的表达与活性检测

)-

，荧光显微!使凋亡细胞绿染；"#使死亡细胞红染）

$$］

镜下观测染色情况［。

!结

!"#

果

抗体基因片段的克隆及表达载体的构建

经过%&’"(%、重叠延伸"(%等一系列基因克隆与扩增，测序并修改错误碱基，最终得到完全正确的基因片段，见图)。测序结果证明，所调取抗体恒定区重链为#*+$型，轻链为!

型。

图>（5）,CDE’挑选阳性克隆结果图$各%&’电泳条带

()*+$

,-./0123421.0)/567892:%&’

$：,-./01；.：!23(2$-)401；)：!24.501；4：(266)01；

7：(,).401；8：!,)/401

!"!转染;<=细胞及筛选阳性克隆

直接竞争9,#:;挑选阳性克隆，共筛选-.孔单克隆，其中有.5余株有表达，$<)、$<4、$=)、.;.、.=4、);.、4>$5等-株表达水平较高。细胞单克隆形态见图4（?）。因各单克隆生长速度不同，因此只能分批进行筛选。图4（0）是第一批9,#:;筛选阳性克隆照片，阳性克隆率约.7@。选用羊抗人#*+（23,）作为二抗，检测无血清培养上清呈阳性结果，说明我们研制的抗体中含有人轻重链恒定区，

是人源化的基因工程抗体。

图>（6）表达670)?;%!@嵌合抗体的细胞克隆()*+>（6）;.--/-27.9.A31.99)27670)?;%!@

670)528B

()*+>（5）F29)0)G./-27.99.-./0.85B,CDE’

!"$

表达蛋白的纯化及初步测定

将)次收获上清约$A7,纯化后，得到蛋白溶

液约.7BC。根据紫外检测法测得蛋白浓度推算该单克隆表达水平约为.B*D,。由于能够与"EFGHIJ;亲和柱结合，因此可以进一步判定该蛋白为抗体类物质。

图7为在非还原和还原条件下的:=:’";+9结

果，非还原条件下蛋白质的分子量约$75K=?，和人体内的#*+$的分子量一致。在还原条件下，有.条电泳带，分子量分别为.)K=?和7$K=?，与设计轻重链分子量吻合。表明我们得到的蛋白质是#*+$

型的完整抗体分子。

图HE%E?F’I,检测蛋白

$：还原型:=:’";+9；.：标准蛋白$，6-A4，88A.，4)，)$，.5，$4A4K=?；)：标准蛋白.，..，$-，$$A8，-8，7)K=?；4：

非还原型:=:’";+9

()*+H

J.9K-02:E%E?F’I,

$：EHLMNHL:=:’";+9；.：O?EK$，6-A4，88A.，4)，)$，.5，$4A4K=?；)：O?EK.，..，$-，$$A8，-8，7)K=?；4：JFJ’EHLMNHL:=:’";+9

1I!"#

中国生物工程杂志6N*E(@*/<ODNE/F/KP

间接细胞$%&’(检测抗体对)*!+的亲和性

表!,-./0!

BC

’()*+(,-*’(./,0

BG5BHBG3JH5G>II

Q/FR&4S/RH

&554

各检测孔吸光度(.123.-450260-578/29

&C5GHIBBG1HJ5GIB1

D/E<:/F5GB135GIII5G5HI

!"#$%检测结果见表&。以’()*、+(,-*、

其各检测孔与阴性对照孔’(./,01种细胞为抗原，

相比，说明该抗体可与2+345值均有明显差别，

6+&57细胞发生结合。检测表达抗体与6+&58细胞结合情况的实验表明该抗体与9,:;(<基本不结合、与=">5以及?@A6部分结合（资料未显示），与文献报道相符，说明该抗体能够与6+&5抗原发生特异性结合。

!":

基因工程抗体对)*!+;细胞的杀伤作用

实验结果发现，在抗体浓度为5、5G4、4、45KL.F!的条件下，引发了不同程度的细胞凋亡与死亡，并且随着抗体浓度的增加，杀伤效应也随之增强，见图>

。

图<

BC?D<

蛋白浓度依次为+、-=>：+":、:、:+?@A/引起的细胞凋亡荧光显微照片；!

细胞凋亡死亡百分数随抗体浓度的增加而增加0：

-=>：AC5326/E23287292A093C58729212650//-828921C1，83290C452450493-9C24+，+":，:+?@A/；!

0：970832823-9C2426>0-9750//C4530-1C4?-/24?FC97970->>C9C2426-49C.2>G52450493-9C24

H讨论

达水平存在较大差异，往往导致完整抗体分子表达

B&］

。本试验采用双表达载体表达抗体分水平极低［

国内外许多研究表明，针对6+&5的抗体可有效杀伤@淋巴瘤细胞，对多种@淋巴细胞功能紊乱的疾病有较好疗效。与鼠抗相比，嵌合抗体既保留了鼠源可变区的高亲和性，又具有人MD段的多种

免疫杀伤功能，降低了人抗鼠抗体反应的发生率，改善了临床治疗效果。与其它小分子基因工程抗体相比，嵌合抗体作为完整抗体分子，在体内半寿期更长，并具有人MD段的多种免疫杀伤功能。

提高完整抗体分子的表达量必须同时提高轻链和重链的表达。目前表达抗体分子有两种方式：一类是将轻、重链基因分别连接至不同表达载体，一类是轻、重链基因连在同一载体上但处于不同的表达单元中。使用这两种表达方式，由于轻重链表

子，使轻重链基因处于同一表达单元之中，从而有利于轻重链基因表达水平相当，且同一细胞同时表达轻重链，有利于完整抗体分子的正确折叠。

抗体在体内通过多种途径发挥免疫杀伤作用，其完整与确切的作用机理至今仍不完全清楚。目

J，B5］

报道抗6+&5嵌合抗体的作用机前国内外文献［

理主要包括：抗体依赖的细胞毒作用、补体依赖的细胞毒作用以及抗体与6+&5分子结合引起的直接效应（包括抑制细胞生长，改变细胞周期以及凋亡）。抗6+&5嵌合抗体还可通过致敏肿瘤细胞协助增强传统细胞毒性药物的疗效。细胞因子对改善它的疗效也有一定作用。本实验研制的嵌合抗体已初步证明具有杀伤细胞的活性。

W）:;;E，:E（

参考文献

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DC

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：CEF!;!史与现实市场3中国生物工程杂志，:;;G，:G（!:）H#IJ，9+&’H/，42’?*HK，&12.39+%’2"%,1&8+’,.,?>，：CEF!;!:;;G，:G（!:）

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/j5i4.html