反转录TAKARA D6210A

TaKaRa Code：D6210A

PrimeScript II

1st Strand cDNA Synthesis Kit

（50次量）

宝生物工程(大连)有限公司

目 录

内 容

●制品说明 ●制品内容 ●保 存

●1st-strand cDNA合成反应 ●RT-PCR反应 ●RNA样品的制备 ●相关制品

页 码

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●制品说明

本制品是使用PrimeScript II RTase从Total RNA或Poly（A）＋ RNA合成1st Strand cDNA的试剂盒。含有1st Strand cDNA合成所需的全部试剂。

以结构复杂的RNA或长链RNA为模板进行cDNA合成时，cDNA合成受到抑制的主要原因是RNA高级结构与反转录酶的非特异性结合。并且，由于反转录酶的错配引起的非特异性延伸，对RT-PCR或全长cDNA的合成极为不利。PrimeScript II RTase是对PrimeScript RTase进行进一步改良的反转录酶，本反转录酶可以极大限度地抑制RNA高级结构与反转录酶的非特异性结合。

本制品使用了PrimeScript II RTase，利用Oligo dT从PolyA开始进行延伸反应，使用标准反转录温度42℃，不仅能维持PrimeScript RTase原有的卓越的cDNA合成效率和cDNA合成速度，同时可以合成本底低、纯度高、完整性好的cDNA。另外，反转录反应液配制时所产生的非特异性延伸是抑制cDNA合成的主要原因，本制品能有效控制这一现象。反应液配制后，冰上放置直至反转录反应开始，不会发生抑制cDNA合成的现象。

合成的1st Strand cDNA可广泛应用于2nd Strand cDNA合成、杂交、PCR法扩增等。特别适用于全长cDNA文库制作、高纯度全长cDNA合成等。

●制品内容（50次量）

PrimeScript II RTase（200 U/μl） 5×PrimeScript II Buffer RNase Inhibitor（40 U/μl） dNTP Mixture（10 mM each） Oligo dT Primer（50 μM） Random 6 mers（50 μM） RNase free dH2O

50 μl 200 μl 25 μl 50 μl 50 μl 100 μl 1 ml

【引物序列】

引物名称

Random6 mers

Oligo dT PrimerPd（N）6序列

TaKaRa独自开发设计的dT区域的序列﹡1*1：该序列与TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0（TaKaRa Code: DRR019A）

中的Oligo dT Adaptor Primer不同，不含有M13 Primer M4序列。

●保 存： -20℃。

●1st-Strand cDNA合成反应

1. 在Microtube中配制下列混合液。

试剂

Oligo dT Primer（50 μM） or Random 6 mers（50 μM） dNTP Mixture（10 mM each） 模板RNA

RNase Free dH2O

使用量

1 μl

1 μl（0.4～2 μl）*2

1 μl

Total RNA：5 μg 以下 Poly(A)＋ RNA：1 μg 以下

Up to 10 μl

2．65℃保温5 min后，冰上迅速冷却。

*2：2 kb以下的cDNA合成时，Random 6 mers的使用量为1～2 μl；2 kb以上的cDNA

合成时，Random 6 mers的使用量为0.4～1 μl。也可使用Gene Specific Primer，此时，其在反应体系中的终浓度为0.1 μM。

（注：上述处理可使模板RNA变性，提高反转录效率。） 3．在上述Microtube管中配制下列反转录反应液，总量为20 μl。

试剂

上述变性后反应液 5×PrimeScript II Buffer RNase Inhibitor （40 U/μl） PrimeScript II RTase（200 U/μl） RNase Free dH2O

4．缓慢混匀。

5. 按下列条件进行反转录反应：

（30℃ 10 min） （使用Random 6 mers时）

42℃（～50℃ ）﹡3 30～60 min

*3：PrimeScript II RTase对具有复杂二级结构的模板同样具有良好的延伸性能，通常可在42℃下

进行反应。使用特异性下游引物进行反转录时，有时会因错配而产生非特异性扩增。此时可将反转录温度升到45～50℃，可能会减少非特异性扩增。

6．95℃ 5 min﹡4（酶失活）后，冰上冷却。

*4：进行长片段cDNA扩增时，为了避免1st cDNA链的破损，请进行70℃、15 min的失活反应。

使用量

10 μl 4 μl

0.5 μl（20 U） 1 μl（200 U） Up to 20 μl

●RT-PCR反应

1st Strand cDNA合成反应液，可直接作为PCR反应的模板使用，其加入量为PCR反应液量的1/10以下。模板加入量会对PCR的扩增效率有影响，建议参照PCR酶的说明书，进行最适模板量的研讨。 在RT-PCR反应中，产生非特异性扩增或无扩增产物时，将cDNA合成反应液用RNase H处理可改善PCR扩增情况。

【推荐使用的PCR酶】 高扩增效率： 长链PCR扩增：

TaKaRa Ex Taq、TaKaRa Ex Taq HS TaKaRa LA Taq、TaKaRa LA Taq HS

高保真PCR扩增： PrimeSTAR HS DNA Polymerase

●RNA样品的制备

本试剂盒是将RNA合成cDNA的试剂盒。RNA的纯度会影响cDNA的合成量，而制备RNA的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用RNA操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。

【使用器具】

尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列（1）或者（2）方法进行处理。 （1）干热灭菌（180℃，60 min）

（2）用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12小时。然后在120℃下高压灭菌30分

钟以除去残留的DEPC。

RNA实验用的器具和仪器建议专门使用，不要用于其它实验。

【试剂配制】

用于RNA实验的试剂，需使用干热灭菌（180℃，60 min）或用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装（也可使用RNA实验用的一次性塑料容器），使用的无菌水需用0.1%的DEPC处理后进行高温高压灭菌。

RNA实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。

【制备方法】

使用简单的RNA纯化方法即可获得满足于RT-PCR反应的RNA（只需少量的RNA便可进行RT-PCR反应）。但为了保证实验的成功率，建议使用GTC法（异硫氰酸胍法）制备的高纯度RNA。 从培养细胞、组织中提取Total RNA时，使用RNAiso Plus（TaKaRa Code: D9108）。

●相关制品

【相关试剂盒】

高效率、高灵敏度、长链2 Step RT-PCR试剂盒：

PrimeScript RT-PCR Kit（TaKaRa Code: DRR014） 高灵敏度的长链One Step RT-PCR试剂盒：

PrimeScript® One Step RT-PCR Kit Ver.2（TaKaRa Code: DRR055） 【相关PCR酶】

高灵敏度、高扩增量的PCR酶：

TaKaRa Ex Taq （TaKaRa Code: DRR001）

TaKaRa Ex Taq Hot Start Version（TaKaRa Code: DRR006）

长链DNA扩增酶：

TaKaRa LA Taq ®（TaKaRa Code: DRR002）

TaKaRa LA Taq ® Hot Start Version（TaKaRa Code: DRR042）

高保真酶：

PrimeSTAR® HS DNA Polymerase（TaKaRa Code: DR010）

MEMO

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宝生物工程（大连）有限公司

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