大肠杆菌_ggt原核表达载体pGEX_4T_1_ggt的构建及其蛋白表达

有意义

安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.2007,35(30):9467-9469　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　孙红忠　责任校对　李洪

大肠杆菌γ2ggt原核表达载体pGEX24T21/γ2ggt的构建及其蛋白表达

胥俊峰,单建华,赵宁伟,殷志敏　(南京师范大学生命科学学院,江苏南京210046)

摘要　构建大肠杆菌γ2谷氨酰转肽酶原核表达载体pGEX24T21/γ2ggt及表达与鉴定目的蛋白,为进一步利用该酶催化合成茶氨酸等目的

α总DNA为模板,用PCR法在γ产物奠定了基础。以大肠杆菌DH52ggt编码序列上下游引入酶切位点并扩增出γ2谷氨酰转肽酶基因;将

γ2ggt编码序列克隆入原核表达载体pGEX24T21的相应酶切位点;用PCR鉴定重组质粒pGEX24T21/γ2ggt,并对插入基因片断测序;重组质粒pGEX24T21/γ2ggt转化大肠杆菌BL21(DE3),经乳糖诱导后用SDS2PAGE分析表达产物,并经Westernblot鉴定。获得大肠杆菌γ2谷氨酰转肽酶基因,并成功构建到原核表达载体pGEX24T21上,转化有pGEX24T21/γ2ggt工程菌BL21(DE3)经1g/L乳糖诱导1h后即开始表达目的蛋白,在诱导6h后表达蛋白量达到最高,随着时间的延长,目的蛋白没有被降解,此蛋白主要以包涵体形式存在,Westernblot鉴定了此目的蛋白。成功构建了大肠杆菌γ2谷氨酰转肽酶原核表达载体pGEX24T21/γ2ggt,并进行了目的蛋白的鉴定。

γ2谷氨酰转肽酶;克隆;表达关键词　

中图分类号　Q936　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2007)30-09467-03ConstructionandCharacterizationofRecombinantProkaryoticVectorpGEX24T21/γ2ggtXUJun2fengetal　(CollegeofLifeScience,NanjingNormalUniversity,Nanjing,Jiangsu210046)Abstract　TodesignandconstructanprokaryoticexpressionvectorpGEX24T21/γ2ggt,andtoexpressEscherichiacoliγ2glutamyltranspeptidase,theBglⅡandXhoⅠsiteswereincorporatedintotheγ2ggtencodingfragmentbyPCR.AfterdigestingwithBglⅡandXhoⅠ,theγ2ggtencodingfragmentwasclonedintotheprokaryoticexpressionvectorpGEX24T21atthecorrespondingBamHⅠandXhoⅠsites.ThepositiveclonesselectedwithPCRsequencedandtheex2pressionofγ2ggtinE.coliBL21(DE3)wasanalyzedwithSDS2PAGEafterinducedby1g/Llactosefor1to9hours.(DE3)harboringpGEX24T21/γ2ggtbegantoexpresstheγ2glutamyltranspeptidaseafter1hourinductionandkeptituntil6hwhenthetargetproteinreachedamaximum.NodegradationofproducedproteinwasobservedintheE.cells.T2mostlyinin2clusivebodiesandidentifiedbyWesternblotting.TheE.coliγ2ggtencodingfragmentvectorpGEX24T21andthiswasconfirmedbyPCRandsequencing.WesternblottinganalysisindicatedproteinwasfullyexpressedinE.coli.Itwilllayafoundationforfurtherstudyonbiosynthesisfunctionsofγ2glutamylγ2glutamyltranspeptidase;Clone;ProkaryoticexpressionKeywords　

,,[1]。,利用微生。广泛存在于微生

γ物中的γ2谷氨酰转肽酶(γ2glutamyltranspeptidase,2GGT,EC

2.3.2.2)具有转移γ2谷氨酰基团作用,可以将谷氨酰胺上γ2

[2-3]

(Acr)及甲叉双丙烯酰胺(Bis)购自Promega公司;四甲基乙二胺(TEMED)购自BioRad公司;考马斯亮蓝R2250购自

sanland公司;其余试剂均为国产分析纯。1.2　实验方法

γ1.2.1　引物设计与合成。根据NCBI公布的大肠杆菌k2122谷氨酰转肽酶基因序列设计引物,P1:5′2CGGCAGATCTATGA2

TAAAACCGACG23′,P2:5′2AGGTCTCGAGTTAGTACCCCGCC2GTTAAATC23′其中P1的5′端引入BglⅡ酶切位点,P2的5′端

谷氨酰基转移到乙胺受体上,催化合成茶氨酸。为了提高

微生物中γ2谷氨酰转肽酶的表达量,笔者从大肠杆菌k212中克隆出γ2ggt基因片段,转入原核表达载体pGEX24T21中,构建了重组质粒pGEX24T21/γ2ggt,并将其转化至大肠杆菌BL21

(DE3)中,以廉价、无毒的乳糖作为诱导剂,测定目的蛋白的

[4]

引入XhoⅠ酶切位点。以上引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

γα菌液为1.2.2　2ggt基因的扩增及鉴定。以大肠杆菌DH5α模板,直接PCR扩增ggt基因的序列。PCR反应体系:DH5

菌液1μl,10×PCRBuffer5.0μl,Mg2+2mmol/L,p1/p2各1.0μl,dNTP4.0μl,Taq酶0.5μl,超纯水补足50.0μl。PCR循环参数:94℃180s预变性;94℃40s,54℃45s,72℃120s,共30个循环;72℃延伸300s。取扩增产物1.0μl,于1%琼脂糖凝胶中电泳30min,电压强度5V/cm,凝胶成像分析系统观察结果。

1.2.3　连接与转化。PCR扩增的γ2谷氨酰转肽酶基因经胶

表达特性,为进一步将该酶应用于生产奠定基础。

1　材料与方法1.1　实验材料

α及1.1.1　菌株和质粒。质粒pGEX24T21,大肠杆菌DH5

BL21(DE3)均为实验室保存。

1.1.2　抗体与主要试剂。Anti2GSTpolyclonalantibody购自Novagen公司,IRDye800ConjugatedAffinityPurifiedAnti2MouseIgG(GOAT)购自Rockland公司;Taq酶,T4DNA连接酶购自TaKaRa公司;限制性内切酶XhoⅠ,BamHⅠ,BglⅡ购自NEB公

回收试剂盒抽提纯化后,用BglⅡ和XhoⅠ37℃双酶切过夜,载体pGEX24T21用BamHⅠ和XhoⅠ37℃双酶切过夜,酶切后的目的基因和载体分别经琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化回收;将回收的目的基因与载体以摩尔比5∶1的比例混合,16℃连接过夜,构建含有目的基因的重组质粒pGEX24T21/γ2ggt,Ca2

α。Cl2法转化大肠杆菌DH5

1.2.4　重组质粒pGEX24T21/γ2ggt的筛选与鉴定。挑取单个

司;小提质粒试剂盒购自Sigma公司;胶回收试剂盒购自

Promega公司;蛋白胨和酵母粉购自英国OXOID公司;卡那霉

素、氨苄青霉素购于Ameresco公司;IPTG购自Merck公司;丙

基金项目　国家教育部基金项目(2002SWXSBJBC22)。

作者简介　胥俊峰(1980-),男,江苏东台人,硕士研究生,研究方向:生

物化学与分子生物学。

收稿日期　2007207207

菌落于含50mg/L氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜后,小提质粒,以p1/p2为引物,以抽提的质粒为模板进行

有意义

9468　　　　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2007年

PCR反应鉴定,将扩增出目的基因的重组质粒由上海生工生白为表达的融合标签GST蛋白,初步说明重组的目的蛋白得到表达,但有部分被切去融合标签,与预期结果一致。从图3可知,乳糖诱导1h后即开始表达目的蛋白,在诱导6h后表达蛋白量达到最高,随着时间的延长,目的蛋白没有被降解。

超声破菌后重组蛋白主要以包涵体形式存在(图4)。

物工程技术服务有限公司进行测序,测序结果与NCBI数据库中公布的序列比对。

1.2.5　SDS2PAGE分析γ2ggt目的蛋白的表达。经DNA测序验证的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),挑取含重组原核表达载体的单个菌落接种于含50mg/L氨苄青霉素的LB培养基,37℃培养过夜后,按1%接种于新鲜的LB培养基(含

50mg/L氨苄青霉素),37℃继续培养至OD600约为1.0时,加

入乳糖至终浓度为1g/L诱导9h,每隔1h取1ml菌液作全菌SDS2PAGE电泳,考马斯亮蓝R2250染色。当诱导重组蛋白达到最佳表达时间后收菌,4℃、10000r/m离心10min,弃上清液。菌体沉淀用适量谷氨酰转肽酶裂解缓冲液重悬后,超声破碎菌体,4℃、12000r/m离心15min,分别取上清液和沉淀留样电泳。

1.2.6　Westernblot鉴定目的蛋白。将诱导表达的产物先行SDS2PAGE,然后以半干法电转移至硝酸纤维素膜上,取下硝

酸纤维素膜TBS短暂漂洗后经5%光明脱脂奶粉室温封闭1

h,TBST漂洗3次后,与GST Tag单抗孵育过夜,次日TBST漂

注:γ　图2　插入pGEX24T21122

2谷氨酰转肽酶

洗3次后,与IRDye800标记的羊抗鼠IgG孵育1h,最后TBST

3次洗膜经Odyssey红外激光成像系统扫描实验结果。2　结果与分析

γ2.1　2ggt基因的扩增结果　α进行PCR扩增,p2对E.coliDH5

胶电泳结果显示,明亮的条带,

(1)。

2.2　重组质粒pGEX24T21/γ2ggt

的构建与鉴定　PCR扩增产物经纯化试剂盒纯化后,进行BglⅡ和

XhoⅠ双酶切,空载pGEX24T21进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切处理,分别纯

　注:M.预染蛋白分子质量标准化;1.未诱导菌体蛋白;2～10.乳

糖诱导的菌体蛋白。

图3　重组大肠杆菌γ2

谷氨酰转肽酶的SDS2PAGE分析

化后,T4连接酶16℃连接过夜,转

α,挑取单个菌落,37化E.coliDH5

℃培养过夜后,小量提取质粒,进行PCR鉴定(结果未显示),有约

　注:M.DNAmarker;1.PCR1.8kbp单一的特异性DNA条带出

产物。

PCR扩增产物琼脂糖

现的质粒由上海生工生物工程技果见图2,与GenBank中的E.coli

k212γ2ggtcDNA序列以Blast进行

　注:M.预染蛋白分子质量标准化;1.未诱导菌体蛋白;2.乳糖诱

导的菌体蛋白;3.乳糖诱导菌体蛋白的上清;4.乳糖诱导菌体蛋白的沉淀。

图4　重组大肠杆菌γ2谷氨酰转肽酶的SDS2PAGE分析

γ图1　2谷氨酰转肽酶基因术服务有限公司进行测序,测序结

凝胶电泳分析

比较,结果完全一致。

2.3　重组蛋白的SDS2PAGE电泳分析　挑取重组质粒转化BL21(DE3)的阳性菌落,过夜培养,转接新鲜的培养基后,当

OD600约为1.0时,加入终浓度为1g/L的乳糖诱导,每小时

2.4　重组蛋白的Westernblot鉴定　Westernblot分析显示,

取样用SDS2PAGE分析,结果表明(图3)γ,2ggt基因在pGEX2

4T21中是融合表达的,由于载体pGEX24T21在融合标签GST

经乳糖诱导的转化有重组原核表达载体pGEX24T21/γ2ggt的菌体裂解物能与anti2GST单抗特异性反应,在90和25kU处呈现条带,而在65kU处未呈现条带,表明所表达的重组蛋白是目的蛋白(图5),与SDS2PAGE电泳结果一致。

3　讨论

后存在凝血酶酶切位点,宿主菌BL21(DE3)本身含有的凝血酶会在载体表达融合蛋白后切去部分融合标签,因此在90、

65、25kU处均有特征蛋白条带出现:分子质量约为90kU的

蛋白条带,为表达的γ2谷氨酰转肽酶与GST融合蛋白;65kU处的蛋白为切去融合标签的γ2谷氨酰转肽酶;25kU处的蛋

γ2谷氨酰转肽酶是生物转化法生产茶氨酸广泛采用的一种催化合成酶[4],作为生物体内谷胱甘肽代谢途径中的一

有意义

35卷30期　　　　　　　　　　　胥俊峰等　大肠杆菌γ2ggt原核表达载体pGEX24T21/γ2ggt的构建及其蛋白表达9469

酰转肽酶基因,分别酶切载体和扩增目的基因,连接和转化,直至将重组载体转化大肠杆菌后进行克隆筛选、测序鉴定等,证实了该重组载体的构建成功,并进一步通过SDS2PAGE和Westernblot分析与鉴定了重组蛋白的表达。研究结果表

明,重组大肠杆菌γ2谷氨酰转肽酶经1g/L乳糖诱导1h后即开始大量表达目的蛋白,在诱导6h后表达蛋白量达到最高。随着时间的延长,目的蛋白没有被降解,此蛋白主要以包涵体形式存在,表达目的蛋白由于宿主菌含有的凝血酶的

　注:M.预染蛋白分子质量标准化;1.未诱导菌体蛋白;2～10.乳

糖诱导1～9h的菌体蛋白。

图5　重组大肠杆菌γ2谷氨酰转肽酶的Westernblot

切割作用,表达产生的约90kU的融合蛋白部分被切割为65kU的γ2谷氨酰转肽酶和25kU的GST融合标签;Westernblot鉴定同样在90和25kU位置处,用anti2GST单抗能够检测到呈现的条带,与SDS2PAGE电泳结果一致。参考文献

[1]KAMATHAB,WANGL,DASH,etal.Antigensintea2beverageprimehuman

Vgamma2Vdelta2Tcellsinvitroandinvivoformemoryandnonmemoryan2tibacterialcytokineresponses[J].ProcNatlAcadSciUSA,2003,100(10):6009-6014.[2]TACHIKIT,YAMADAT.γ2Glutamyltransferbyglutaminasefrom

pseudomonasnitroreducensIFO12694andforthesynthesesoftheanineandylm,1998,62(7):12792[3]YAYAM,TT.expressionofPseu2

dom30lutaminesynthetase:anenzymeavail2coupledfermentationwithenergytransfer[J].,2006,70(2):500-507.SUKAS,MIYAKAWAN,etal.Enzymeproductionoftheanine,an

umamicomponentoftea,fromglutamineandethylaminewithbacterialγ2Glu2tamyltranspeptidase[J].EnzymeandMicrobialTechnology,2002,31:884-889.

[5]MEISTERA,ANDERSONME.Glutathione[J].AnnuRevBiochem,1983,52:

711-760.[6]TATESS,MEISTERA.Gamma2glutamyltranspeptidase:catalytic,structural

andfunctionaspects[J].MolCellBiochem,1981,39:357-368.[7]ALEKSANDRAMISICKA,IWONAMASZCYNSKA,ANDRZEJWLIPKOWSKI,

etal.Synthesisandbiologicalpropertiesofgamma2glutamyl2demorphin,apro2drug[J].LifeScience,1996,58(11):905-911.

[8]张毅,屈贤铭,杨胜利.乳糖作为诱导剂对重组目的蛋白表达的影响

[J].生物工程学报,2000,16(4):464-468.

个关键酶,它不仅可以催化γ2谷氨酰基化合物的水解反应

γ生成2谷氨酸,还可以催化γ2谷氨酰基化合物上的γ2谷氨酰基团转移至氨基酸、多肽、H2O等受体上

[6]

[5]

,利用这一性质,

γ氨基酸衍生物合成方面2谷氨酰转肽酶在药物合成设计[7]、

也有着重要的应用。为了获得高表达的目的产物,通常需要建立基因的高效表达系统。该实验将大肠杆菌k212的γ2ggt基因转入至原核表达载体pGEX24T21构建了重组质粒pGEX24T21/γ2ggt。原核表达载体pGEX24T21同时含有tac启动子和

lacI基因,tac是一个由trp启动子和lacUV5启动子融合而

成的杂合启动子,受lac阻抑物调控,度的阻遏蛋白,降低载体上tac,,IPTG达。由于IPTG,一些国家IPTG,因此其应用于生产合成茶氨酸所需的γ2谷氨酰转肽酶有一定的局限性,故该实验用无毒、价廉的乳糖[8]作为tac启动子的诱导剂来启动目的蛋白基因的转录,从而表达合成茶氨酸所需的γ2谷氨酰转肽酶。鉴于此,笔者利用基因工程技术构建重组原核表达质粒pGEX24T21/γ2ggt,在实验中通过PCR扩增大肠杆菌γ2谷氨

(上接第9464页)

1.3　自制暗场显微镜的方法和观察结果　在某些普通显微

要熟练掌握显微镜的使用技巧,还是较容易在40×物镜下观察和记录花粉的滚动过程和其立体形状。如果显微镜不具备摄像系统,可利用数码相机等自制一个摄像系统,制作方法见参考文献[2]。

(2)利用油镜油对花粉进行制片,不改变花粉的形态,并

镜的孔径光阑下面,有一个滤光片,在其中央用双面胶粘上一个小于孔径光阑口径的、不透光的圆纸板等物,就可将通过孔径光阑中央的光线遮挡住,这样就将一台明场显微镜改制成了一台暗场显微镜。利用它观察浸入油镜油中的花粉粒,整体呈乳白色,层次和结构较清楚(图3)。通过与明场显微镜下的花粉形态进行对比,

可获得不少新的结构信息。

能清楚地观察到其表面的形态和层次结构。如果能将显微镜进行一些结构改建,就可达到一镜多用的效果。若将花粉内的细胞核等结构或成分进行荧光等染色或进行光谱分析,将获得花粉内更多的结构和组成信息。随着光学显微镜的不断升级换代,光镜在观察花粉形状和结构信息等方面,将具有越来越多的电镜所无法取代的优势。

参考文献

　注:a为赤道光切面观的油松花粉;b为小叶女贞的赤道光切面

观花粉;c为海桐的赤道面观花粉。

图3　暗场显微镜观察到的花粉

[1]洪亚平.光镜下新鲜植物花粉的简易制片、观察和摄像方法[J].生物

学通报,2007,42(1):56-57.

[2]洪亚平,侯小改.低成本制作光学显微镜(正立、倒置)/解剖镜的实时

观察与记录系统[J].生物学通报,2007,42(4):51.

2　讨论

(1)每次制片后,可供观察花粉滚动的时间较短暂,但只

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