发酵蔬菜微生物群落变化及与亚硝酸盐的关系

发酵蔬菜微生物群落变化及与亚硝酸盐的关系

【摘要】：蔬菜发酵是一个由微生物主导的过程,微生物的种群、数量与发酵食品品质、风味和营养等密切相关。蔬菜表面富含多种微生物。在发酵体系中形成独特的微生物群落结构。蔬菜发酵体系中的微生物除乳酸菌外,还有酵母、霉菌等。这些种群在发酵体系中的生长存在方式、演替规律、与乳酸菌种群的关系及其相互作用对蔬菜发酵如何产生效应,至今国内外尚没有系统、深入的研究。此外,这些微生物在发酵过程中以及腌渍品后期储藏过程中不可避免的产生亚硝酸盐。而亚硝酸盐含量超标问题又是限制蔬菜发酵产业的重要问题。因此,本文探究了发酵蔬菜细菌和真菌群落变化并开展了与亚硝酸盐形成、还原相关微生物鉴定的研究,为蔬菜发酵机制、质量控制及低亚硝酸盐含量工艺的建立提供理论依据。有研究表明在自然发酵过程中,食盐浓度、微生物发酵产酸、乳酸菌和辅料的抑菌作用是影响微生物群落变化的主要因素。本文采用PCR-DGGE非培养方法结合BIOLOG方法分析研究蔬菜发酵过程中细菌、真菌随发酵时间变化而演变的规律,并进行群体鉴定、个体鉴定及对群落结构和功能性进行分析,以期全面揭示微生物群落变化。通过DGGE方法对发酵蔬菜体系中细菌、真菌群落进行鉴定得出食盐浓度4%的发酵蔬菜细菌群落在发酵前后期相对丰富,尤以发酵后期细菌种类多,生物量大,发酵中期物种相对单一,而真菌群落在发酵前后期也相对丰富；食盐浓度6%的发酵蔬菜细菌群落在整个发酵期相对稳定,种类数相对少,真菌群落在发酵初期

物种相对单一但生物量高,到发酵后期物种丰富；食盐浓度8%的发酵蔬菜细菌群落于发酵前期种类有限,发酵中后期物种相对丰富,生物量大,而真菌主要存在于发酵前期。个体鉴定结果表明食盐浓度4%的发酵蔬菜细菌体系中最大的类群为γ变形杆菌纲微生物,包括假单胞菌(Pseudomonassp.)、沙雷氏菌(Serratiasp.)、泛菌(Pantoeadispersa)及松鼠葡萄球菌(Staphylococcussciuri)等芽孢杆菌属微生物,而真菌微生物主要有Wickerhamomycesanomalus、假丝酵母(Candidasp.)、季也蒙酵母(Mevcrozymaguilliermondii);食盐浓度6%的发酵蔬菜细菌体系中含有柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)和肠系膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)等乳杆菌目微生物以及肠杆菌(Enterobactersp.)、泛菌(Pantoeasp.)等γ变形杆菌纲微生物,真菌微生物主要包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、季也蒙酵母(Meyerozymaguilliermondii)

、汉逊德巴利氏酵母

(Debaryomyceshansenii)、毕赤酵母(Pichiasorbitophila)等；食盐浓度8%的发酵蔬菜细菌体系中包括沙雷氏菌(Serratiasp.)、拉恩氏菌(Rahnellasp.)等γ变形杆菌纲微生物以及松鼠葡萄球菌(Staphylococcussciuri),真菌微生物主要为假丝酵母(Candidaglaebosa)、毕赤酵母(Pichiasorbitophila)、Wickerhamomycesanomalus及马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)。对微生物群落结构特征分析表明,食盐浓度4%的发酵蔬菜在发酵后期细菌种类相对丰富,真菌种群在发酵第3d、第5d、第13d微生物种类相对丰富；食盐浓度6%的发酵蔬菜在整个发酵期细菌群落结构相对稳定且微生物种类远不及食盐

浓度4%的发酵蔬菜丰富,真菌群落在发酵初期物种相对单一但含量丰富,到发酵后期物种有所增加；食盐浓度8%的发酵蔬菜细菌群落结构为三种食盐浓度中最稳定的,所包含的微生物种类少,生物量低,真菌在发酵第3d微生物种群最丰富。通过BIOLOG方法探究发酵蔬菜群落功能多样性得出发酵蔬菜微生物群落碳源利用情况为食盐浓度4%的发酵蔬菜AWCD值呈先上升后平稳变化的趋势,食盐浓度6%的发酵蔬菜AWCD呈上升趋势,食盐浓度8%的发酵蔬菜对碳源的利用呈不规则变化；发酵蔬菜微生物群落多样性变化表现为食盐浓度和发酵时间对发酵蔬菜微生物群落丰富度和均匀度(Shannon指数)影响不大,mcIntosh指数变化以食盐浓度4%和6%的发酵蔬菜最为明显,simpson指数变化表明4%食盐浓度和8%食盐浓度的发酵蔬菜变化不明显,而食盐浓度6%的发酵蔬菜变化相对明显。借助DGGE图谱结合亚硝酸盐含量变化确定蔬菜发酵过程中的优势菌与亚硝酸盐生成、还原的关系。结果农明：食盐浓度4%的发酵蔬菜中,与亚硝酸盐形成相关的微生物可能足假单胞菌(Pseudomonassp.)、泛菌(Pantoeadispersa)、假丝酵母(Candidasp.)及松鼠葡萄球菌(Staphylococcussciuri),与亚硝酸还原相关的微生物可能为沙雷氏菌(serriatiasp.);在食盐浓度6%的发酵蔬菜体系中,肠杆菌(Enterobacteriaceaebacterium)、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、假丝酵母(Candidasaitoana)、毕赤酵母(Pichiasorbitophila)可能与亚硝酸盐的形成相关,假单胞菌(Pseudomonassp.)可能与亚硝酸盐的还原有关；而在食盐浓度8%的发酵蔬菜中,与亚硝酸盐形成相关的可能为德

巴利氏酵母(Debaryomycesoccidentalis)、毕赤酵母(Pichiasorbitophila)及假单胞菌(Pseudomonassp.)、沙雷氏菌(serriatiasp.)、松鼠葡萄球菌(Staphylococcussciuri)可能与亚硝酸盐的还原有关。【关键词】：PCR-DGGE群落亚硝酸盐形成还原 ??【学位授予单位】：山西大学 ??【学位级别】：硕士 ??【学位授予年份】：2013 ??【分类号】：TS255.5

??【目录】：中文摘要12-15ABSTRACT15-18第一章引言18-241.1研究背景18-191.1.1发酵蔬菜概述181.1.2发酵蔬菜的营养和功能性181.1.3自然发酵蔬菜存在的安全隐患18-191.2国内外发酵蔬菜研究进展19-201.2.1国内发酵蔬菜研究进展191.2.2国外发酵蔬菜研究进展19-201.3发酵食品微生物分析方法的研究20-211.3.1微生物的培养分离方法201.3.2化学方法(磷脂脂肪酸法)201.3.3BIOLOG201.3.4分子生物学方法20-211.4研究内容及科学意义21-241.4.1研究内容221.4.2研究意义22-24第二章食盐浓度对发酵蔬菜细菌微生物群落的影响24-482.1引言242.2试验材料24-262.2.1试验材料242.2.2发酵蔬菜总

DNA

的提取

242.2.316SrDNAV_3

片段的

PCR24-252.2.4DGGE252.2.5切胶回收,二次PCR及PCR产物回收252.2.6克降测序25-262.3试验方法26-312.3.1发酵蔬菜的制备和取样262.3.2发酵蔬菜总DNA的提取262.3.316SrDNAV_3片段的PCR扩增26-272.3.4变性梯度凝胶电泳(DGGE)27-282.3.5切胶回收

282.3.616SrDNAV_3片段的二次PCR及产物回收282.3.7细菌16SrDNAV_3片段的克隆测序28-302.3.8DGGE图谱分析方法302.3.9系统发育分析方法30-312.4结果与分析31-452.4.1发酵蔬菜总DNA的提取31-322.4.216SrDNAV_3片段的PCR32-332.4.3发酵蔬菜细菌16SrDNAV_3片段的DGGE图谱分析33-392.4.4发酵蔬菜微生物细菌群落结构特征39-412.4.516SrDNAV_3片段DGGE测序条带序列鉴定41-452.5讨论45-462.6小结46-48第三章食盐浓度对发酵蔬菜真菌微生物群落的影响48-603.1引言483.2试验材料仪器及方法483.2.118SrDNA的PCR扩增483.2.2DGGE483.2.3切胶回收二次PCR及PCR产物回收483.2.4克隆测序483.3试验内容与方法48-503.3.118SrDNA的PCR扩增48-493.3.2变性剂梯度凝胶电泳分离18SrDNA基因(DGGE)493.3.3切胶回收493.3.418SrDNA二次PCR及产物回收493.3.5克隆测序493.3.6DGGE图谱分析方法49-503.4结果与分析50-583.4.118SrDNADGGE图谱分析50-553.4.2发酵蔬菜微生物真菌群落结构特征55-573.4.318SrDNADGGE测序条带序列测定57-583.5讨论58-593.6小结59-60第四章探究不同食盐浓度下微生物的功能多样性60-704.1引言604.2试验仪器与方法60-614.2.1试验仪器604.2.2试验方法604.2.3测定指标60-614.3结果与分析61-684.3.1不同食盐浓度条件下发酵蔬菜微生物群落碳源利用程度61-634.3.2不同食盐浓度条件下发酵蔬菜微生物群落多样性指数变化63-684.4小结68-70第五章探究与亚硝酸盐形成、还原相关的微生物70-785.1引言705.2试验仪器与方法70-715.2.1试验仪器705.2.2试验方法

705.2.316SrDNAV_7-V_8片段DGGE70-715.3试验结果与分析71-765.3.1食盐浓度4%的发酵蔬菜亚硝酸盐硝酸盐含量分析715.3.2与食盐浓度4%的发酵蔬菜亚硝酸盐形成、还原相关的微生物分析715.3.3食盐浓度6%的发酵蔬菜亚硝酸盐硝酸盐含量分析715.3.4与食盐浓度6%的发酵蔬菜亚硝酸盐形成、还原相关的微生物分析71-725.3.5食盐浓度8%的发酵蔬菜亚硝酸盐硝酸硝酸含量分析725.3.6与食盐浓度8%的发酵蔬菜亚硝酸盐形成、还原相关的微生物分析72-765.4讨论765.5小结76-78第六章结论78-806.1结论78-80参考文献80-86附录86-94研究成果94-95致谢95-96个人简况及联系方式96-98 本论文购买请联系页眉网站。

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