园林植物遗传实验指导

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东北农业大学园艺学院

目 录

目录

实验一 观赏植物生物学性状调查 .................................................................................... 1 实验三 花粉贮藏及花粉生活力的测定............................................................................. 5 实验五 植物根尖细胞染色体制片技术与观察 ................................................................. 8 实验六 花粉母细胞减数分裂制片法 .............................................................................. 11 实验七 花粉管生殖细胞的有丝分裂 .............................................................................. 12 实验八 园林植物多倍体的诱导与鉴定........................................................................... 14 实验九 植物总 DNA 的提取 ......................................................................................... 17 实验十 植物总RNA的提取 ........................................................................................... 20 实验十一 PCR扩增技术 ................................................................................................ 22 实验十二 植物RAPD分析技术 ..................................................................................... 24 实验13植物染色体标本制备及核型分析 ....................................................................... 27 实验14植物染色体分带技术 ......................................................................................... 49 实验15植物诱导染色体结构变异 .................................................................................. 54 实验16荧光原位杂交实验 ............................................................................................. 55 附录 ................................................................................................................................ 57

I

实验一

实验一 观赏植物生物学性状调查

一、目的要求

掌握观赏植物生物学性状调查的目的、内容和方法，通过调查填写调查表，根据调查表比较同种观赏植物不同品种间观赏性状的差异，并学会利用花卉品种分类检索表为调查到的花卉进行品种鉴定。

二、材料用具

1、材料

各类观赏植物（草花、灌木、乔木、藤本）。 2、用具

钢卷尺、游标卡尺、皮尺、标杆、记号笔、铅笔、小卡片、细线、统计表等。

三、实验内容

观测不同植物品种的观赏与经济性状，包括株型、花、果实、抗性等特征，对其进行比较和评价。数量性状一般按三级记载。具体观测性状如下：

1、株型：包括株高、枝下高、冠长、冠幅（株幅）、冠形、分枝角度、分枝数、枝叶的特征、植株生长情况等。

2、花的特征：包括花期、花型、花朵大小、花色、花香、开花数量等。 3、结实情况：包括果实的形状、大小、多少等。

4、抗性：包括抗寒性、抗热性、抗旱性、抗病性、抗虫性、耐阴性等。 5、特殊的经济价值或观赏价值。

（一）木本花卉生物学性状调查

1、试验材料的选择

根据实验的时间地点选择正值花期的木本花卉，春季可选木兰、樱花、榆叶梅、梅花、碧桃等，夏秋季可选紫薇、石榴、黄花槐、夹竹桃、桂花、洋紫荆、大叶醉鱼草、木芙蓉等，要求该木本花卉有2个以上品种的成年植株，通过品种性状调查，比较品种间观赏性状的差异。试验植株应选择个体差异小的，既具有相同树龄和相同繁殖栽培方式。每个品种应有10个以上个体的重复。每个供试植株进行编号，用细线把写有标号的卡片系在树体明显位置，同一品种的供试植株编为一组。 2、调查测量

按照由远及近、由外而内、由大到小的顺序进行测量。首先远观树形及长势，然后测量树高、树径、冠幅，接着进行主枝主干、一二年生枝、叶片、花、果实与种子的观察测量。对于乔木株高的测量需用带有尺寸的标杆，标杆从树冠内部向上伸至与树同高，标杆与地面间的距离用皮尺测量。冠幅的测量采用两个标杆垂直指向树冠最外围东西南

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北四个方向的枝条末端，测量标杆间的距离。叶片大小采用叶长乘叶宽的方式表示。 3、填写调查纪录表

根据表1的内容对木本花卉测量数据进行纪录，室外实验纪录应用铅笔，避免沾水而字迹模糊，回到室内后整理。

表1 木本花卉品种性状调查记载

编号 1 2 3 4 5 6 7 生态型 生长势 树高 冠形 树冠幅度 树皮颜色 皮孔密度 记 载 内 容 植株情况 ａ.乔木; ｂ.小乔木; ｃ.灌木状 ａ.强壮; ｂ.中等; ｃ.衰弱 ｍ 干高 ㎝ 地径 ㎝ 胸径 树冠紧密度 东西向 ｍ; 南北向 ｍ 主干、主枝状况 开裂方式 备注 ㎝ 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 一年生枝 二年生枝 平均长度 嫩枝色泽 毛被物 平均长度 色泽 叶片大小 叶片质地 叶脉 叶缘 叶缘波曲度 叶尖 新叶叶色 叶柄平均长 花序是否具伸长总轴 每花序着花量 整株着花密度 香气 每百朵鲜花重 花序总梗长度 花梗长 ㎜ 花萼 花瓣开裂 花瓣形状 皮孔形状 一、二年生枝条性状 ㎝ 节间平均长 ㎝ 皮孔密度 ㎝ 节间平均长 ㎝ 皮孔密度 叶的性状 叶 形 叶片触觉 侧脉、网脉明显度 锯齿形状 叶面凹曲度 叶基部 成年叶叶色 叶柄色泽 花的性状 花序类型 最多 朵 最少 朵 平均 朵 ｇ ～ ㎝ 柔毛 ａ.有; ｂ.无 色泽 色泽 裂瓣深度 花冠形状 实验一

27 28 29 30 31 32 花冠直径 雄蕊 是否结实 果实颜色 成熟期 种子形状 花色 子房 果实种子性状 果实形状 果实大小 鲜果千粒重 种子千粒重

（二）草本花卉生物学性状调查

1、试验材料选择

根据实验时间选择正开花的草本观赏植物植株，同一个种的不同品种，要求所选植物为同一批种苗的不同品种，相同培育方法，每个品种应该有10株以上重复。春季实验可选用报春、雏菊、金盏菊、瓜叶菊、水仙、石蒜、郁金香、风信子等，夏秋季可选用大丽菊、百合、萱草、蜀葵、金鱼草、天竺葵、美女樱等。每个植物个体编号，每个品种记为一组。 2、调查测量

草本花卉的性状调查重点在花与叶尤其是花，在草花的品种分类上经常用到花期、花色、花型、花大小、花瓣数、雄蕊数量以及株型、叶形、分枝等作为分类标准。不同的花卉具有不同的分类标准，在进行花卉生物学形状调查统计之前应就所选择的实验花卉的品种分类标准编制相应的调查表，表2为基本格式。调查测量根据相应花卉表格的内容进行，叶的性状部分如果出现异型叶应分别测量（比如毛茛科、报春花科、菊科的部分花卉存在基生叶与茎生叶的区别）。 3、填写调查纪录表

根据表2的内容（或针对实验花卉另外编制的调查表）对木本花卉测量数据进行纪录，室外实验纪录应用铅笔，避免沾水而字迹模糊，回到室内后整理。对调查表中主要的性状差异进行分析。

四、作业

选择几种花卉种类进行调查统计，对统计结果进行分析，利用品种分类检索表为调查到的花卉进行品种鉴定。或者对已知品种名称的花卉通过调查的性状编制品种分类检索表。

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表2 草本花卉生物学特性调查表

编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

生态型 生长势 株高 冠形 分枝 叶片大小 叶片质地 叶脉 叶缘 叶缘波曲度 叶尖 花序类型 记 载 内 容 植株情况 a匍匐； b.直立； c.莲座状； d.倾卧； e.缠绕 a.强壮； b.中等； c.衰弱 cm 冠幅 树冠紧密度 叶的性状 叶形 叶片触觉 叶色 叶面凹曲度 叶基部 花的性状 每花序着花量 最多 朵 整株着花密度 花香及程度 花梗长 花萼 花瓣开裂 花瓣形状 花冠直径 花期 雄蕊 柔毛 色泽 色泽 裂瓣深度 花瓣数量 花冠形状 花色 子房 a.有; b.无 花序总梗长度 ～ cm mm 最少 朵 cm 备注 侧、网脉明显度 平均 朵 4

实验二

实验三 花粉贮藏及花粉生活力的测定

为了避免杂交工作时失误，使用外地寄来的花粉、贮藏的花粉、新采的花粉，授粉前必须测定花粉的生活力，这样有利于对杂交结果的分析。因此我们必须掌握花粉贮藏及花粉生活力测定的原理和技术

一、实验目的

掌握花粉贮藏及花粉生命力鉴定的方法和原理。

二、实验材料

唐菖蒲等植物的花粉。

三、仪器及药品

载玻片、盖玻片、解剖针、镊子、毛笔、干燥器、小指形管、标签、记号笔、显微镜、天平、烧杯、培养皿、滴管、玻璃棒、量筒、电炉、石棉网、冰箱；

凡士林、无水氯化钙、蔗糖、琼脂、蒸馏水、硼酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、碘、碘化钾、氯化二苯基四氮唑（ TTC ）。

四、实验原理

花粉在低温（ 0 ～ 2 ℃）、干燥、黑暗等条件下代谢强度降低，花粉贮藏的原理就是要创造这样低代谢的环境条件，从而延长花粉的寿命。

花粉的形态、花粉中酶的活性以及积累淀粉的多少（淀粉质花粉）通常与其生活力密切相关，因此可以利用花粉的形态观察、过氧化物酶、脱氢酶的活性高低、淀粉的含量以及在人工培养基上花粉管萌发的情况作为鉴定花粉生活力高低的标准。 鉴定花粉生活力的方法很多，概括起来主要有如下几种：

1、直接测定法 将待测花粉直接授粉，然后统计结实情况。此法最准确，但需时较长，且实验结果易受气候条件的影响。也可在授粉后隔一定时间切下柱头，在显微镜下压片检查花粉的萌发情况，根据萌发率的高低来鉴定花粉的生活力。

2、形态观察法 直接在显微镜下观察花粉的形态，根据品种花粉的典型性（如具有正常的大小、形状、色泽等）判断花粉的生活力，即形态正常的花粉有生活力，而一些小的、皱缩的、畸形的花粉不具有生活力。此法简便易行但准确性差，一般只用于测定新鲜花粉的生活力。

3、染色观察法 1 ）碘－碘化钾染色法：以碘－碘化钾溶液（ 0.3g 碘＋ 1.3g 碘化钾溶于 100ml 蒸馏水）染色后于显微镜下观察，花粉被染成蓝色者表示具有生活力，花粉呈黄褐色者不具有生活力。 2 ） TTC 染色法： TTC 染色是一种鉴定去氢酶活性的组织化学反应，凡具有生活力的花粉在其呼吸过程中都有氧化还原作用，当 TTC 渗入有活力的花粉时，其去氢酶在催化去氢过程中与 TTC 结合，使无色的 TTC 变成 TTF

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而呈现红色。

4、培养基发芽法 在培养基上进行花粉的人工萌发，鉴定待测花粉萌发率的高低。此法若采用适宜的培养基能较精确地测定出花粉的生活力，但不同植物的花粉萌发条件存在较大的差异，所以很多时候测定的结果也只是相对可靠。

五、实验步骤：

1、花粉的贮藏：

（1）将采集的花粉进行干燥（凉干或放入盛有无水氯化钙的干燥器中干燥），一般以花粉不相互黏结为度。

（2）将干燥的花粉装在指形管中（不要太多，一般以五分之一体积或更少为宜），瓶口塞以纱布，瓶外贴以标签，注明花粉种类、采收日期。

（3）将指形管放入无水氯化钙控制一定湿度的干燥器中，干燥器置于 0 ～ 2℃ 的冰箱内。

2、花粉生活力的测定：

（1）染色观察法 ——TTC 染色法

① 配制 TTC 染色液：称取 0.5g TTC 溶于 100ml 磷酸盐缓冲液（ 100ml 蒸馏水中溶解 0.832g Na2HPO4·2H2O 和 0.273g KH2PO4，pH7.2）中，装入棕色瓶备用。 ② 制片：取少量花粉于载玻片上，滴入1～2滴 0.5 ％ TTC 染色液，用镊子搅拌均匀，盖上盖玻片，于 35 ～ 40℃ 条件下净置 15 ～ 20min 。

③ 观察统计：在显微镜下观察三个不同的视野，凡被染成红色或玫瑰红的都是有生活力的花粉，黄色或不着色者为没有生活力的花粉。 （2）培养基发芽法 —— 固体培养基

① 配制培养基：称取 1g 琼脂， 5g 蔗糖，量取 94ml 蒸馏水，装入烧杯，加热使琼脂融化呈透明状（注意补充水分，以保持培养基的浓度），即配成 5% 浓度的培养基。同法配制 10% 、 15% 、 20% 浓度的培养基。

② 制片：用滴管吸取少量培养基，趁热滴在载玻片的凹槽内，放置片刻，使其凝固。 ③ 播种花粉：将少量花粉均匀地撒播在培养基上，注意不可过多，否则难以观察。 ④ 培养与观察：将制备好的片子放在垫有湿润滤纸的培养皿内，于 20 ～ 22℃ 的温箱中培养；待花粉萌发后于显微镜下观察并统计发芽率。观察时每片随机取三个视野，统计花粉总数及发芽数，计算平均萌发率（花粉总数不少于 100 粒）。

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实验三

六、作业及思考题：

1、按下表统计实验结果。

表1染色法测定结果记载表

花粉来源

各视野中花粉数量及生活力 花粉总数 红色 黄色 生活力 花粉总数 红色 黄色 生活力 花粉总数 红色 黄色 生活力 平均生活力 表2培养基法测定结果记载表

花粉来源 培养基浓度 第一组 发芽数/总数 各视野中花粉粒数量及发芽率 第二组 发芽率 发芽数/总 发芽率 第三组 发芽数/总数 发芽率 平均生活(％) 力

2、绘一幅花粉粒发芽形态图。

3、比较不同方法、不同浓度（培养基法）测得花粉生活力的高低，分析其原因。

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实验五 植物根尖细胞染色体制片技术与观察

一、目的要求

学习和掌握植物细胞有丝分裂制片技术；观察植物细胞有丝分裂过程中染色体的形态特征及染色体的动态行为变化。根尖染色体压片法，是观察植物染色体最常用的方法，也是研究染色体组型、染色体分带、染色体畸变和姊妹染色单体交换的基础。

二、实验原理

有丝分裂是植物体细胞进行的一种主要分裂方式。有丝分裂的目的是增加细胞的数量而使植物有机体不断生长。在有丝分裂过程中，细胞核内的遗传物质能准确地进行复制，然后能有规律地均匀地分配到两个子细胞中去。植物有丝分裂主要在根尖，节间，茎的

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实验五

生长点，芽及其它分生组织里进行。将生长旺盛的植物分生组织经取材，固定，解离，染色，压片等处理即可以观察到细胞内的有丝分裂图象。如若需要进行染色体计数，则需进行前处理，即取材之后采用物理的或化学的方法，阻止细胞分裂过程中纺锤体的形成，使细胞分裂停止在中期。这时，染色体不排到赤道板上，而是散在整个细胞质中。这十分便于对染色体的形态，数目进行观察。

三、试剂和器材

1、材料

大蒜(2n=16)；洋葱(2n=16)等根尖为实验材料。 2、试剂

无水酒精，70%酒精，冰醋酸，对二氯苯或秋水仙素，醋酸钠，碱性品红，石炭酸，甲醛，山梨醇，中性树胶或油派胶（Euparal），二甲苯。

（1）卡诺固定液的配制：用3份无水酒精，加入1份冰醋酸（现配现用）。 （2）染色液的配制：

配方Ⅰ.石炭酸品红（Carbol.fuchsin），先配母液A和B。

母液A：称取3g碱性品红，溶解于100mL的70%酒精中（此液可长期保存）。 母液B：取母液A 10mL，加入90mL的5%石炭酸水溶液（2周内使用）。 石炭酸品红染色液：取母液B 45mL，加入6mL冰醋酸和6mL 37%的甲醛。此染色液含有较多的甲醛，在植物原生质体培养过程中，观察核分裂比较适宜，后来在此基础上，加以改良的配方Ⅱ，称改良石炭酸品红，可以普遍应用于植物染色体的压片技术。

配方Ⅱ：改良石炭酸品红。取配方Ⅰ石炭酸品红染色液2-10ml，加入90-98ml 45%的醋酸和1.8g山梨醇（sorbitol）。此染色液初配好时颜色较浅，放置二周后，染色能力显著增强，在室温下不产生沉淀而较稳定。

（3）解离液配制：1M HCl或者盐酸酒精解离液（1份浓盐酸加95%酒精1份） 3、器材

恒温培养箱，显微镜，水浴锅，载玻片，盖玻片，单面刀片，镊子，培养皿，量筒，吸水纸，小烧杯或青霉素瓶。

四、操作方法

1、生根：

先将种子浸泡若干小时，然后转入垫有湿润滤纸的培养皿中，或将大蒜或洋葱的鳞基，置于盛水的小烧杯上，置于25℃温箱中。

植物根尖是植物的分生组织，取材容易，操作方便。植物根尖细胞分裂旺盛，因此，它是细胞有丝分裂相制备与观察的理想选取部位。大蒜，洋葱易于在水培，沙培，土培条件下生根。注意在暗处培养。 2 取材：

待根长至l.5～2.0 cm时，上午9～11点，在细胞分裂旺盛期切取根尖（顶端0.5～1.0 cm）。

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不同的植物在不同的环境条件，其细胞分裂高峰的时间不同。大蒜和洋葱的细胞分裂高峰期通常是在上午9～11点，下午15～17点左右。 3 前处理：将根尖放入饱和对二氯苯溶液中浸泡3～4h

细胞分裂中期由于纺锤体的牵引，在制片时染色体经常互相缠绕、重叠，不利于对有丝分裂中的染色体的观察和计数，用理化因素进行预处理，可以改变细胞质粘度，抑制或破坏纺锤丝的形成，促使染色体缩短和分散等。前处理的方法一般采用低温处理和化学药剂处理。

(1)低温处理： 将根尖放入盛有蒸馏水的烧杯或其它容器内，放在1～4℃的冰箱或其它低温条件下处理24h。不同的植物对低温的敏感程度不同，效果也不同。对低温较为敏感的植物是小麦。

(2)化学药剂处理：常用的药剂有饱和对二氯苯溶液；0.02%～0.1%的秋水仙素水溶液； 0.002～0.004 mo1/L 8—羟基喹啉等。对二氯苯和8—羟基喹啉对不同的植物效果也不相同。植物染色体数目多，个体小的适合于使用对二氯苯；而染色体中等长度的更适合于8—羟基喹啉，同时能使缢痕区更为清晰。秋水仙素溶液对纺锤体的抑制效果最好，一般在室温条件下处理2～4h可达到理想的效果。如果处理时间过长，染色体会变得更短，不利于对染色体结构进行研究。

4 固定：在青霉素瓶中放入卡诺固定液5ml，放入预处理的根尖10-20条，用塞盖紧，室温下固定12-24小时。经过固定的材料若不及时使用，可直接转入70%酒精中，保存时间最好不超过二个月。（也可以经过90%酒精换到85%酒精中各半小时，再换入一次70%酒精，0-4℃冰箱中保存。）

固定是指用化学药剂将细胞迅速杀死的过程。固定的目的是为了把细胞生活状态的真实情况保存下来，避免在对细胞操作中使生活状态发生改变。植物常用的固定剂是Carnoy固定剂，用3份95%的乙醇和1份冰乙酸配制成的。这二种药品都具有迅速穿透细胞致细胞死亡的特点，但是乙醇是脱水剂，可使细胞脱水变形；冰乙酸又是一种膨胀剂，可使细胞膨胀改变生活状态，把这二种药品按照3:l配制使用，既可达到迅速杀死细胞又可保持细胞真实生活状态的目的。 固定的时间可根据被固定的材料大小而定，根尖组织固定4～24h可达到固定效果。固定时间过长，可去掉细胞中的一些脂肪油滴等，便于染色体观察。但是由于固定时间过长，材料易变脆，变硬，给实验操作带来一定困难。

5 解离 ：先将固定后的根尖用蒸馏水换洗3-4次，1M HCl放在60℃恒温水浴解离8－10min或者盐酸酒精解离液（1份浓盐酸加95%酒精1份）解离10min。

解离的目的是将分生组织细胞之间的果胶质和纤维素等物质破坏掉，便于在制片过程中细胞容易散开。常用的解离方法有二种:

(1)酸解： 将l mol/L HCl放在60℃恒温水浴锅中预热，当HCl温度达到60℃时，将根尖放入HCl溶液中。解离时要注意观察，如果解离时间过长，分生组织会与伸长区脱离，这时分生区已经被解离过软，很难操作，而且染色效果不好。

(2)酶解： 酶解时根尖的伸长区要去掉，只留下分生区。酶的浓度以果胶酶和纤维素酶分别为2%～3%为宜，等量混合后使用。酶解温度与解离时间成反比，但是温度不得超过45℃，否则酶会失去作用。

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实验五

6 水洗与低渗

解离后的材料要用清水或蒸溜水冲洗4～5次；酶解的材料洗后还要在水中浸泡10～15min。水洗的另一个作用是后低渗，对于压片有好处。水洗时一定要洗净，否则会影响染色效果。 7 染色与压片

（1）剔除根冠，在生长锥处切下小块组织，用镊子或解剖针将其碾碎，尽量铺开，除去大块渣滓。

（2）加一滴改良苯酚品红染色5—8分钟，可在酒精灯上加热几秒钟后继续染一段时间。 （3）用镊子取盖玻片与染色液面呈450角徐徐放下，排净气泡，并在盖玻片上铺少量吸水纸。

（4）左手拇指，食指固定盖玻片防止其水平移动， 右手以铅笔的橡皮头垂直敲击多次或用解剖针柄轻敲，用力要均匀，或用拇指用力按压盖片。可使细胞舒展，染色体散开。如材料形成均匀一薄备状即可进行镜检。一个解离良好的材料，只要用镊子尖轻轻的敲打盖玻片，分生组织细胞就可铺展成薄薄的一层。 8 镜检

压好的片子要先放在低倍镜下观察，寻找不同分裂时期的典型细胞分裂相，然后，再转换成高倍镜观察。注意观察细胞核内染色质与染色体结构的特点。选择典型的细胞分裂相绘图。

五、作业：

1 观察染色体数目，绘制你所看到的图象，并说明属于有丝分裂哪一时期。

实验六 花粉母细胞减数分裂制片法

一、实验目的

了解植物花粉形成中的减数分裂过程，观察此过程中染色体的动态变化，学习并掌握制备减数分裂玻片标本的方法和技术。

二、实验材料

唐菖蒲、瓜叶菊等园林植物材料

三、用具和试剂

解剖针、镊子、单刃刀片、盖片、载片、显微镜。卡诺固定液、70%酒精、醋酸地衣红、加拿大树胶、滤纸。

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四、实验原理

高等植物性细胞形成过程中，都是先由有性组织(如花药和胚珠)中的某些细胞分化为孢母细胞(2n)，进一步由这些细胞进行连续二次的分裂，即减数第一次分裂和第二次分裂，最终各自产生四个小孢子和卵细胞与三个退化的极体(n)。

在减数分裂过程中，可以辨认染色体的形态和数量上的变化，从而为遣传学研究中远缘杂种的分析，常规的组型分析，以及三个基本规律的验证提供直接或间接的依据。

五、实验步骤

1．取材：选取发育到适当时期的花蕾是观察花粉母细胞减数分裂的关键性步骤。减数分裂

的植株形态和花蕾大小，依植物种类和品种而不同，须经过实践记录，以备参考，通常应从最小的花蕾起试行观察。水仙减数分裂一般在球茎未萌动前。

2．固定：剖开球茎，用镊子取出小花序，用卡诺固定2-24小时，然后保存在70%酒精中，放在冰箱内保存备用。

3．染色压片：取固定好的花蕾置于载片上，吸去多余的保存液，用解剖针将花药横切，滴上一滴醋酸地衣红溶液，用针头轻压花药，挤出花粉母细胞，去除空壳，立刻置于低倍镜下观察，如有清楚的分裂图像，可加上盖片，在盖片上覆一层吸水纸。用拇指轻压盖片，使成堆的花粉母细胞散开，勿使盖片错动。注意观察减数分裂不同时期典型的花粉母细胞及其动态变化。 4．脱盖片 5．封片

六、作业

1． 绘制你所看到的图象，并说明是减数分裂的哪一时期? 2． 试说明减数分裂与有丝分裂有何不同，其遗传意义何在?

实验七 花粉管生殖细胞的有丝分裂

一、实验目的

学习观察植物花粉管生殖细胞的有丝分裂的技术。

二、实验原理

单倍体的花粉粒萌发后进行两次有丝分裂，第一次形成粉管细胞和生殖细胞，生殖细胞在花粉管生长时进行有丝分裂，形成两个雄配子。这次有丝分裂由于在减数分裂之后，染色体数目比根尖有丝分裂少一半，可以更清楚地观察到，因而对一些植物染色体数目的观察便更为方便。

三、材料

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实验七

唐菖蒲、瓜叶菊等花序。

四、仪器和药品

硼酸(H3BO3)；硝酸钙(Ca(NO3)2·4H2O)，硫酸镁(MgSO4·7H2O)， 硝酸钾(KNO3)，丙酸、蔗糖(化学纯)、乳酸、地衣红、培养皿。

五、试剂配制

1．乳酸-丙酸-地衣红

母液：50ml乳酸加50ml丙酸加2克地衣红，过夜后过滤。 工作液：用蒸馏水及母液配制成40%及60%两种浓度。 2．花粉培养液

母液：H2BO3 0.10g；Ca(NO2)2·4H2O 0.30g；MgSO4·7H2O 0.20g；KNO3 0.10g加水到100ml。

培养液：母液1ml；蔗糖1.0g；水9ml。

六、实验步骤

1．采集新鲜成熟的花粉。

2．花粉培养：在十分清洁的载玻片上滴一滴培养液，轻轻撒播花粉于培养液的表面，漂浮不要沉没，否则不易发芽，载玻片事先放在有湿滤纸的培养皿中，避免培养液干掉。 3．观察：每隔一定时间镜检花粉管生长情况，用调节聚光镜的方法观察细胞核的状况。一般在12小时后可以看到生殖细胞的粉管细胞，在12-30h可以看到生殖细胞的有丝分裂。

4．染色制片：看到适当时期后，用吸水纸吸去培养液(别搅动花粉管)加一滴乳酸-丙酸-地衣红(不要太猛)，盖上盖玻片，待花粉染色后(或微加热)，进一步观察有丝分裂，其余步骤同根尖涂用法。

七、作业：

1．比较生殖细胞有丝分裂与根尖有丝分裂的异同，绘制两幅生殖细胞有丝分裂图象，并说明是哪一期。

2．说明所看到的材料染色体2n=?

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实验八 园林植物多倍体的诱导与鉴定

一、实验目的

了解秋水仙素诱导植物多倍体的原理和鉴定多倍体的依据；学习并掌握植物多倍体诱导与鉴定的方法和技术。

二、实验材料

唐菖蒲、瓜叶菊等园林植物的种子或幼苗。

三、仪器及药品

仪器：显微镜、电子天平、镜台测微尺、目镜测微尺、目镜测微网、培养箱、镊子、刀片、游标卡尺、钢卷尺、载玻片、盖玻片、培养皿、量筒、烧杯、容量瓶、滴管等。

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实验八

药品：秋水仙素、酒精、蒸馏水、碘、碘化钾、对氯二苯、卡诺固定液、卡宝品红溶液等。

四、实验原理

目前，人工诱导植物多倍体常用秋水仙素溶液进行处理。秋水仙素（ colchicine ）又称秋水仙碱，是从百合科植物秋水仙中提炼出来的一种植物碱，分子式为 C22H25O6N，溶于酒精、氯仿和冷水中。秋水仙素诱导多倍体的机理，在于其抑制细胞分裂时微管的聚合过程，阻止纺锤丝的形成，使已分裂的染色体不能迁向细胞的两极，细胞中间也不形成新的核膜，从而形成一个核内染色体加倍的细胞；加倍细胞继续分裂便形成多倍体的组织器官，进而发育成为多倍体植株。

随着植物染色体倍性的变化，其形态和特性也会发生相应的变化。与二倍体相比，多倍体植株常表现叶片宽厚、表面粗糙、叶柄粗短，茎粗枝少，气孔数目减少、保卫细胞变大，叶绿素增加；花、果实、种子等器官较大、花瓣较多、花色浓艳，花粉量减少、花粉粒增大、花粉育性降低，开花和结实期延迟等。因此，除准确地进行花粉母细胞或根尖分生组织细胞的染色体计数外，也可根据形态特征和生长特性对多倍体进行间接的鉴定。

五、实验方法与步骤

1、多倍体的诱导

（1）秋水仙素溶液的配制 称取 1g 秋水仙素粉末，先溶于少量酒精中，然后加冷水定容至 100ml ，配成 1 ％质量浓度的母液，装于棕色瓶内， 1 ～ 4 ℃冰箱保存备用，使用时再稀释成所需要的浓度。 （2）秋水仙素处理

常用浸渍法、滴液法、涂抹法、注射法、离体法等。可根据处理的组织器官采用其中的一种。

① 浸渍法：可浸渍幼苗、新梢、腋芽、插条、接穗、种子等。对种子进行处理时，先用清水浸种（发芽慢的种子应催芽），使种子处于萌动状态；然后用 0.1% ～ 0.5% 的秋水仙素溶液浸泡种子，一般处理 24h 左右；浸泡后用清水洗净，略阴干后播种，为了促进生根，可在处理液中加入适量的生长素。

② 滴液法：对幼苗进行处理，待子叶展开时，将 0.1% ～ 0.5% 的秋水仙素溶液滴在生长点上，每天早中晚各滴一次，连续处理 2 ～ 3d 。为使药液不会很快蒸发，提高处理效果，可在幼苗生长点处放一脱脂棉球，将秋水仙素溶液滴在棉球上。如天气干燥、蒸发快，中途可滴加蒸馏水保持药液浓度；处理结束后，用清水冲洗数次，将植株上残存药液充分洗净，注意加强管理，并经常观察记载。

③ 涂抹法：用羊毛脂、琼脂或甘油将秋水仙素按一定浓度配成乳剂，涂抹在幼苗或枝条的顶端，处理时间 24 ～ 48h ；处理部位要适当遮盖，以减少蒸发和避免雨水淋洗。 ④ 注射法：采用微量注射器将一定浓度的秋水仙素溶液注入植株的顶芽或侧芽中。 ⑤ 离体法：在组织培养过程中，将适量的秋水仙素加入培养基，经短期培养后，再转入无秋水仙素的培养基中继续培养，便可获得多倍体。此法诱变率高，易得到同质纯合的

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多倍体。 2、多倍体的鉴定

一般采取先间接鉴定，再直接鉴定的方法。 （1）间接鉴定法 常采用的鉴定方法有 3 种。

① 外部形态鉴定：观察四倍体与二倍体幼苗，从叶片厚度、颜色深浅、植株生长强弱等方面加以区别。一般多倍体表现为茎粗壮，叶厚而皱，叶色变深，生长速度减慢，花器变大等。

② 气孔鉴定：借助刀片和镊子撕取一小块叶片下表皮（应呈透明薄膜状），置于载玻片上，滴一滴蒸馏水或 I 2 -KI 溶液，加上盖玻片，在显微镜下观察气孔的密度，并用目镜测微尺测量气孔保卫细胞的长 度 × 宽度 ；统计气孔保卫细胞中叶绿体的数目。测定 50 个气孔的大小及其保卫细胞中叶绿体的数目，计算平均值。多倍体的气孔一般比二倍体长，单位面积气孔数比二倍体少，保卫细胞内叶绿体数目比二倍体多。 测量气孔长度的方法：先求目镜测微尺每小格的长度换算值。在显微镜下看准目镜测微尺与镜台测微尺前后两个完全重叠的刻度，数出双方两个重叠刻度间所包括的小格数目，依下式将目镜测微尺每小格换算为实际长度微米（ μ ）。

目镜测微尺每小格长度（ μ ）＝镜台测微尺小格数×每小格的长度（ μ ） / 目镜测微尺小格数。

用目镜测微尺量出气孔长、宽的格数，乘以换算值即得实际长度（ μ ）。当变换显微镜的目镜、物镜的放大倍数时，须重新调整换算值；不同的显微镜，即使用同样的放大倍数观察，也必须分别测算其换算值，不能彼此代用。 气孔的密度用目镜测微网测量，计算单位面积气孔的数目。

③ 花粉粒鉴定：将四倍体与二倍体的新鲜花粉撒于载玻片上，于显微镜下观察花粉的形态和大小；测定 100 个花粉粒的直径，计算其平均值。多倍体产生的花粉一般比二倍体大。

通过以上间接方法，初步鉴定出多倍体的可能植株，进一步进行直接鉴定。

（2）直接鉴定法 直接用 诱变 植株的根尖细胞或花粉母细胞制片染色，在显微镜下检测染色体的数目是否真正加倍。

六、实验结果分析

１、统计不同药液浓度、不同处理方法及不同处理时间处理后多倍体植株的诱导率。 供试材料 药液浓度 处理方法 处理时间 处理试材数 变异株数 诱变率 备注 2、观察变异植株（四倍体）与对照植株（二倍体）的形态特征，将观测结果 供试材料 染色体数目 叶片形态 气孔密度 气孔(长×宽) 16 保卫细胞叶绿体数 花粉粒直径 备注 二倍体(2X) 四倍体(4X)

实验八

七、作业及思考题

1、说明四倍体与二倍体叶片形态及气孔的区别？解释造成这种不同的原因？

2、你认为利用秋水仙素诱导多倍体的技术要点有哪些？

实验九 植物总 DNA 的提取

一、实验目的

了解植物 DNA 提取的主要方法及其原理，掌握 SDS 法或 CTAB 法抽提唐菖蒲等园林植物总 DNA 的基本程序和操作要求。

二、实验原理

核酸分子是基因工程研究的主要对象，核酸样品的质量直接关系到基因研究一系列试验的成败。核酸包括 DNA 和 RNA 两种分子，在细胞中它们都是以与蛋白质结合的状态存在。真核生物的染色体 DNA 为双链线性分子，原核生物的 “ 染色体 ” 、质粒及真核细胞器 DNA 为双链环状分子。一般地说，总 DNA 主要是指基因组 DNA （ genomic DNA ），即细胞核内的染色体 DNA 分子。植物总 DNA 的抽提常采用两种方法： SDS 法和 CTAB 法。

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CTAB 法：简便、快速， DNA 产量高，但纯度稍次，适用于一般分子生物学操作。 CTAB 是一种非离子去污剂，植物材料在 CTAB 的处理下，结合 65℃ 水浴使细胞裂解、蛋白质变性、 DNA 被释放出来。 CTAB 与核酸形成复合物，此复合物在高盐（ >0.7mM ）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（ 0.1 ～ 0.5mM NaCl ）下， CTAB- 核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后， CTAB- 核酸复合物再用 70 ％ ～ 75% 酒精浸泡可洗脱掉 CTAB 。再经过氯仿 / 异戊醇（ 24:1 ）抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化 DNA ，最后经异丙醇或乙醇等 DNA 沉淀剂将 DNA 沉淀分离出来。 SDS 法：离子去污剂，过程长，纯度高。

三、主要仪器及试材

（1、植物材料

唐菖蒲的球茎、叶片、花瓣 2、主要仪器及试剂

离心机、紫外分光光度计、水浴锅、离心管、移液枪等。

SDS 提取缓冲液（ 100mM Tris-HCl ， pH8.0 ； 50mM EDTA ， pH8.0 ； 0.5M NaCl ； 10mM β- 疏基乙醇，使用前加入）、 20 ％ SDS 、 5M KAC 、 CTAB 提取缓冲液（ 2% CTAB ， 1.4M NaCl ， 20mM EDTA ， 100mM Tris-HCl ， pH8.0 ）、氯仿 / 异戊醇（ 24:1, v/v ）、 4M NaCl 、无水乙醇、 75% 乙醇、 TE 缓冲液。

四、实验方法与步骤

（一）CTAB 法提取唐菖蒲球茎 DNA

1、植物组织的破碎：取 0.2-0.4g 新鲜的唐菖蒲球茎，在液氮中研磨至粉末状，转入 1.5ml 离心管中。

2、细胞的破碎：迅速加入 1ml 预热（ 65 ° C ）的提取缓冲液， 65 ° C 水浴中保温 30min 以上，每 5 min 上下颠倒 1 次。

3、核酸的分离： 12000g 离心 5 min ，吸取上清液约 600μl ，加入等体积氯仿 / 异戊醇（ 24:1 ），上下颠倒数次，至下层液相呈深绿色为止。

4、12000g 离心 5 min ，取 450μl 上清于一新 1.5ml 离心管，加入 1ml 95% 乙醇和 45μl 10M NH 4 AC ，混匀，室温放置 10min 。

5、12000g 离心 10min ，去上清，用 75% 乙醇浸洗沉淀，自然干燥约 30 min 。 6、核酸的溶解：加入 50μl TE 或无菌水（含 20μg/ml RNase ），置于 4℃ 过夜，待 DNA 溶解后，检测 DNA 浓度及质量。

4、核酸的纯化：加入等体积的异丙醇室温下沉淀 DNA ；用 70% 的乙醇清洗沉淀；沉淀经室温干燥后溶于 500 m lTE 中。 （二） SDS 法提取唐菖蒲叶片 DNA

1、取 0.2 ～ 0.4g 新鲜的唐菖蒲叶片，加入液氮研磨成粉。

2、将冻粉转移至 1.5ml 离心管中，加入 800μl 提取缓冲液， 100μl 1 ％的 PVP 溶液，轻轻晃动使粉末充分散开。

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实验九

3、加入 100μl 20 ％ SDS ，充分混匀， 65℃ 水浴 30min ，其间轻轻摇晃 2-3 次。 4、加入 160μl 5M KAC ，充分混匀，冰浴放置 30min 。

5、4℃ 下 12000r/min 离心 15 min ，取上清至新管，加入等体积的氯仿 / 异戊醇（ 24:1 ）抽提，轻轻颠倒数次，放置片刻。

6、4℃ 下 10000r/min 离心 10 min ，吸取上层水相到另一离心管中，加入 2/3 体积 -20℃ 预冷的异丙醇，混匀，室温静置 30min ，观察沉淀生成。

7、4℃ 下 8000r/min 离心 10 min ，倾去上清液，用 75% 的乙醇洗涤沉淀，吹干。 8、用 100μl TE 充分溶解， -20℃ 存放备用。 （三） DNA 的定量和纯度测定

核酸的纯度和浓度可以用紫外分光光度计测定， OD 值代表光密度，下标数字表示光波长， DNA 样品 OD 260 /OD 280 值为 1.8 ， RNA 样品 OD 260 /OD 280 值为 2.0 ，表明样品纯度较好。若低于此值，则样品中可能有蛋白质污染。在 OD 260 的读数用于计算样品中的核酸浓度， OD 值为 1 相当于大约 50μg/ml 双链 DNA 、 40μg/ml 单链 RNA 。

五、实验注意事项

1 ．核 DNA 分子呈极不对称的线性结构，一条染色体为一个 DNA 分子。其长度与直径的比例极不对称，使其对机械力十分敏感，分离纯化过程中 DNA 分子的断裂是很难避免的，尽可能保持 DNA 分子的完整性是 DNA 分离技术的关键。因此操作过程中动作应尽量轻柔， 转移用的枪头最好是剪过的， 避免剧烈振动可获得较长的 DNA 分子。 2 ．尽量取材幼嫩叶片，如太老，酚类物质多，必须用 10mM 的 β-ME 处理。 3 ．所用试剂必需灭菌，带手套操作。

六、实验结果处理

记录提取的 DNA 样本的 OD 值并计算样本浓度。

七、作业

1 ．试说明影响 DNA 提取质量的因素。 2 ．提高 DNA 产量的措施 。

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实验十 植物总RNA的提取

一、实验目的：

1、了解真核生物基因组RNA提取的一般原理。 2、掌握Trizol提取RNA的方法和步骤。 3、了解RNA纯度的检测。

二、实验原理

Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀

浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解蛋白质和其它成分,使蛋白质与核酸分离,失活RNA酶,同时能保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA

三、实验材料、试剂与设备

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实验十

唐菖蒲等园林植物材料 移液器，冷冻高速离心机，低温冰箱，台式高速离心机，液氮罐，陶瓷研钵，1.5ml离心管。

1、无RNA酶的无菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃ 2小时）装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。

2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 3、氯仿:异戊醇 [24 : 1 （v/v)] 、氯仿。 4、异丙醇、无水乙醇、70％乙醇。 5、Trizol试剂。

四、操作步骤

1、取植物嫩叶，液氮研磨，每1.5ml tube分装0.1克样品；

2、每管加入0.5ml Trizol液，迅速混匀，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。 3、室温下静置5分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离

4 、加入0.5ml的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒，室温静置3分钟 5、 10000r/min离心5分钟

6、取上清液（水相）转入一新的离心管，加入等体积异丙醇，室温放置3分钟，10000r/min离心5分钟。

7、弃去上清液，加入至少1ml的70%乙醇，涡旋混匀，4℃下10000r/min离心5分钟。 8、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于20微升TE或DEPC处理过的水中，必要时可55℃-60℃水溶 10分钟。

RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃

五、检测

1、DNA的紫外分光光度计检测 2、琼脂糖凝胶电泳检测

六、作业：

1、RNA酶的变性或失活剂有那些？其中在总RNA的抽提中主要可用哪几种？ 2、怎样从总RNA中进行mRNA的分离和纯化。

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实验十一 PCR扩增技术

一、实验目的

掌握PCR扩增技术。

二、实验原理

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，

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实验十一

合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

三、实验步骤 1、引物设计与合成

根据GenBank上发表的烟草XXX基因

1.PCR扩增

① 引物的稀释

将引物短暂离心后，进行稀释，保存于-20℃(引物贮存浓度为100μmol/l，使用浓度为10μmol/l)

② PCR扩增反应体系 采用25μl的反应体系

DNA模板template 1μl Primer 1（10μmol/l） 1μl Primer 2（10μmol/l） 1μl 2×Master Mix 12.5μl

超纯水 补至25μl（9.5μl）

2×Taq PCR Master Mix的组成

0.1U Taq Polymerase/μl 500μM dNTP each 20 mM Tris-HCL (PH8.3) 100 mM KCl 3 mM MgCl2

③PCR扩增条件

预变性 变性 退火 温度℃ 94 94 51 时间 8min 30s 30s 35 循环次数

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园林植物遗传实验指导

延伸 最后延伸 72 72 1.5min 5min 调整好反应程序，将上述混合物稍加离心，置于PCR仪上执行扩增。

2.结果检测

琼脂糖凝胶电泳检测（5μl）

四、注意

1、PCR反应在一个没有DNA污染的干净环境中进行。

2、所有试剂都应没有核酸和核酸酶的污染，操作过程中应戴手套。 注：KCl可促进引物退火，提高扩增产物质量。

Tris调节反应体系PH值，Taq酶在偏碱性环境中发挥活性。

实验十二 植物RAPD分析技术

RAPD（Randomly Amplified Polymorphic DNA），意为随机扩增多态性DNA，是利用PCR技术进行随机扩增，把扩增的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据DNA条带的多态性来反应模板DNA序列上的多态性。RAPD同AFLP、SSR等分子标记一样都基于PCR扩增，只是RAPD分析只需要一个引物，其引物长度一般为10个核甘酸，其序列是随机的，不同核甘酸序列的引物均有商品出售。

单引物扩增是通过一个引物在两条DNA互补链上的随机配对来完成。由于基因组DNA的差异，使引物与模板的结合位点及这些位点之间的距离不同，使PCR扩增后的片段大小表现出多态性。在基因组DNA分子内可能存在或长或短被间隔开的颠倒重复序列，如果这些序列与引物能碱基配对，则在两条单链上就会出现该引物的结合位点，结合位点的数量取决于这种重复序列的多少。不同DNA分子中这种颠倒重复序列间隔的长短不同，扩增条带的大小就不同，即表现出多态性。

10碱基引物理论上有410 种组合，不同引物检测的模板序列不同，用足够多的引物可覆盖基因组全序列，检测位点多，可以在完全不知道分子生物学背景的情况下对基因组进行分析，是研究植物系谱关系、起源与进化、遗传多样性及分子标记辅助育种的

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实验十二

简单易行的方法；此外，外源基因转化后，转基因植株与非转基因植株相比，外源基因插入的部位导致基因组DNA序列不同或重排，当引物适宜时，扩增条带的长短就会不同，RAPD技术可以检测出对照植株和转化植株PCR产物带型的区别。

由于随机引物短，与模板结合的退火温度低，易出现碱基错配，因此在实验中要严格操作程序及条件，使RAPD分析的结果较为稳定。因其费用较低，方便易行，模板DNA用量少，不需要同位素，安全性好，继RFLP之后得到广泛应用；且操作上比AFLP、SSR等分子标记较为简便易行，因此，多数种类的栽培植物在资源多样性、分子标记等方面都有大量RAPD的研究报道。

本实验目的是学习RAPD技术的原理，掌握RAPD的操作及分析方法。

一、试材及用具

试材:植物基因组DNA。

用具:PCR仪，1μL、10μL、20μL、100μL微量移液器及吸管，PCR管（200μL或500μL）及管架，1.5 mL离心管及管架，离心机，记号笔，磁力搅拌器，高压灭菌锅，电泳仪，电泳槽，电炉，三角瓶，紫外透射仪、凝胶成像系统。

药品:10核苷随机引物、dNTP、琼脂糖、耐热DNA聚合酶［TagDNA聚合酶，与酶一起的还有两种药品，分别是10× PCR Buffer（500 mmol/LKCL、pH 9.0的100 mmol/L Tris-Cl、1.0%Tritonx?100）和25 mmol/L MgCl2。 其他的药品和缓冲液有:

10 mg/mL的溴化乙锭（EB）贮存液:在100 mL蒸馏水中加入1g EB，在磁力搅拌器上搅拌数h，使其完全溶解，转至棕色瓶中避光4 ℃保存。EB是强诱变剂，称量时要戴手套和口罩。一旦接触了EB，立即用大量水冲洗。

1× TAE电泳缓冲液:50× TAE浓缩贮存液含Tris碱242g；冰醋酸57.1 mL；pH 8.0的0.5 moL/L EDTA 100 mL；加600 mL蒸馏水，在磁力搅拌器上搅拌，最后加蒸馏水定容至1000 mL。

6× 凝胶加样缓冲液:0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃保存。

二、方法步骤

1、高压灭菌

把所用的吸头、PCR管、离心管等用具在高压灭菌锅中121℃（约1.1 kg/cm2 ）高压灭菌30 min。

2、PCR反应物的混合

所用反应体系为:25μL反应体系中，10× PCR Buffer2.5 μL，2.0 mmol/L MgCl2 ，0.2 mmol/L dNTP,，各引物0.1 μmol/L，TaqDNA酶1.5 U，各品种DNA模板浓度为20~50 ng，加重蒸水（dd H2O）补充到25 μL。

按照该反应体系，先在1.5 mL离心管中冰浴混合除模板以外的各成分，充分混匀，稍离心，分装到各PCR管中，然后把各品种的DNA模板分别加入到各管中，盖严管盖，在管外壁上做好标记，稍离心，放入PCR仪中。

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园林植物遗传实验指导

3、PCR扩增

PCR反应在DNA扩增仪中进行，所用程序为，94℃预变性4 min，94℃变性30 s，36℃退火30 s，72℃2 min，44个循环后72℃延伸10 min。反应结束后, 取出管子，置4℃冰箱中保存。

注意问题。在进行大量扩增前需对该物种确定扩增的优化体系，尤其是没有文献报道过的植物种类，如Mg2+ 适宜的浓度，TaqDNA酶的用量，退火温度等，各因子设计出梯度，通过检测扩增带的稳定性和亮度来确定优化的反应体系。 4、琼脂糖电泳检测扩增产物

制胶。根据PCR反应管的数量和电泳槽的大小估算琼脂糖胶的体积，称1.6~2.0 %的琼脂糖溶解于1×TAE电泳缓冲液中，在电炉上加热使琼脂糖充分溶解，待溶液温度降到60℃，加入EB，使EB的终浓度为1 μg/mL，摇匀，倒入带有梳子的胶床中，避免产生气泡，室温下约30 min胶自然凝固。

点样。取出扩增DNA的管子，取7 μL扩增产物与2μL加样缓冲液混合；轻轻拔出琼脂糖胶上的梳子，把琼脂糖胶放入电泳槽中，倒入1× TAE电泳缓冲液使液面高出胶面约1 cm；移液器插上10 μL吸管吸入DNA样品后，尖端插入加样孔底部，缓慢把DNA样品加入到点样孔中。

电泳。加样完毕后，正确连接电泳槽和电源，黑线连阴极，红线连阳极，打开电源，正确设定电压及时间，时间的选择取决于胶的长度和电压大小。一般用不高于5v/cm的电压，电泳约2 h，待溴酚蓝离胶边约1~1.5 cm时停止电泳。

检测和照相。小心取出凝胶，置于紫外透射仪上，紫外灯下检测扩增片段的有无及分离情况，在凝胶成像仪上照相，图片保存于计算机中，待统计分析。

注意问题。两电极间电压不应超过5v/cm，电压越高，迁移越快，但分离效果相对较差；扩增带如果不是细亮清晰而呈形状模糊或条带粗亮相连，可能是DNA加样量太多或电压过高或琼脂糖浓度偏低等，在重新电泳时做适当的调整。 5、RAPD条带分析

把RAPD每个反应重复2次。以两次重复中稳定出现的亮带作为统计对象，有电泳带记为1，无电泳带记为0，录入计算机Excel表格中。利用STATISTIC软件，采用UPGMA方法（非加权类平均法:Unweighted Pair Group Method using Arithmetric Averages）对所用品种或材料进行聚类分析。S为两样品间的遗传相似度，D为遗传距离，S=2Nxy/(Nx+Ny)，D=1-S，Nxy为本两个样品共享的RAPD标记数，Nx、Ny分别为X样品和Y样品分别具有的RAPD标记数。

注意问题。对电泳结果的判读同PCR条件是否优化及引物数量是否足够等一样，会影响RAPD 结果的可信度。对电泳结果的判读主要是一些弱带的取舍问题，弱带取舍主要看其重复出现的几率，可进行重复实验；也可在难取舍的弱带位置上出现的电泳条带都不统计，这样可能丢失了一些多态性信息位点，对研究材料的系谱关系等影响不大，但当研究分子标记或构建基因连锁图谱时就不可取。 三、作业思考题

1．RAPD分析的基本原理是什么？主要有哪些应用？ 2．对于一种植物材料，进行RAPD分析的主要步骤有哪些？

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实验十二

实验13植物染色体标本制备及核型分析

一、实验目的

1、掌握植物根尖、茎尖及叶片去壁低渗染色体制片技术；

2、掌握植物染色体显微照象技术及组型分析技术；通过显微摄影，获得某植物染色体自然核型图，并能用国内外通用的植物核型分析标准，确定该植物染色体模型图、核式公式及类型；

3、掌握植物有丝分裂制片技术，通过大量的制片观察，能比较快速准确地判断细胞有丝分裂前、中、后、末期的染色体图象，并对其典型制片照像，收集核型分析及有丝分裂过程观察的染色体制片素材； 二、实验内容

1、植物染色体制片技术训练，独立完成植物根尖、茎尖及幼叶的取材、预处理、低渗、酶解、固定、制片、染色等去壁低渗染色体制片全过程，并获得图象清晰、完整、高度分散的染色体典型图象制片；

3、植物染色体核型分析技术训练，用国内外植物染色体核型分析标准，确定该新资源植物种的染色体组型公式、类型、核型图及核型模式图；

4、细胞有丝分裂典型时期识别技能训练，通过大量的染色体图象观察，能比较快速准确地判断细胞有丝分裂前、中、后、末各个时期的。 三、实验材料

1、蚕豆根尖，2n=2x=12;

2、某新资源植物茎尖、幼叶或子房，如显齿蛇葡萄、泥蒿、鱼腥草等有开发潜力的新资源植物种的茎尖、幼叶或子房。 四、实验器材

1、设备：普通生物显微镜、NIKON数码摄影显微镜、NIKON数码相机、计算机图象处理系统、培养箱、恒温水浴锅、喷墨彩色打印机等；

2、用具：载玻片、盖玻片、眼科镊子、不锈钢剪刀、单面刀片、磨口三角瓶、移液管、试剂瓶、凹型孔白瓷板、玻璃板、烧杯、天平、电炉、染色缸、扩大镜、游标卡尺、滤纸片、玻片标签纸等；

3、药品：8－羟基喹啉、秋水仙素、氯化钾、甲醇、冰乙酸、纤维素酶、果胶酶、对二氯苯、氯化钠、柠檬酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氢氧化钡、甘油、盐酸、胰蛋白

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园林植物遗传实验指导

酶、尿素、氯化钙、EDTA、Giemsa、洋红、地衣红、卡宝品红、锡夫（Schiff）试剂。 附试剂配制

?0.002mol.L 8－羟基喹啉配制：取8-羟基喹啉0.29g，先用少许乙醇溶解，用鲜蒸馏水定溶1000ml。

?0.01%秋水仙素配制：称取1g秋水仙素，用少许乙醇溶解后，用鲜蒸馏水定溶至100ml。 ?饱和对二氯苯溶液配制：鲜配鲜用，称取5g对二氯苯结晶，用40-45℃蒸馏水100mL溶解，振摇5min，静置1 h，取上清液，10-20℃下预处理。

?0.075mol.LKCL溶液配制：称KCL 5.592g，加少许鲜蒸馏水溶解后，定溶至1000ml。 ?2.5%混合酶配制：常用浓度2.5%，取纤维素酶、果胶酶各1g，分别溶于20mL蒸馏水中，配成5%的纤维素酶及果胶酶，再等量混合，配成2.5%浓度混合酶，溶后用0.1 mol.L 盐酸或0.1 mol.LNAOH调pH值为5.5左右，鲜配鲜用或棕色瓶4℃下保存备用。

?2XSSC溶液配制：2XSSC溶液即0.3 mol.L 氯化钠与0.03 mol.L 柠檬酸钠Na3C6H5O7溶液。称氯化钠17.53g, Na3C6H5O7 8.8233g,加少许鲜蒸馏水溶解后，定溶至1000ml。 ?Sorensen磷酸缓冲液配制。A液：0.067mol.L磷酸二氢钾溶液，称取KH2PO4 9.118g，用少许鲜蒸馏水60℃下溶后，定溶至1000ml。B液：0.067mol.L磷酸氢二钠溶液，称取Na2HPO.12H2O,23.995g,用少许鲜蒸馏水60℃下溶后，定溶至1000ml；根据使用时pH值的要求按下例比例混合。

pH值：6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 7.0 7.1 7.2 7.3 7.4 A液： 68.7 62.8 57.0 51.0 44.8 38.8 33.0 27.6 22.3 18.2 B液： 31.3 37.2 43.0 49.0 55.2 61.2 67.0 72.5 77.7 81.8 ?Giemsa母液配制：：取Giemsa 1g，甲醇66ml，优质甘油66ml；先将Giemsa加适量甘油充分研磨60min，无颗粒时倾尽全部甘油充分磨匀，然后在56℃下，保温2h，冷却后再加入甲醇（GR或AR），充分混合，盛入棕色瓶内，4℃下保存备用，保存的时间越久越好。 ?Giemsa染液：染色前鲜配鲜用，按Giemsa母液：Sorensen磷酸缓冲液=1：10稀释后用。

?45%醋酸溶液配制：95%冰乙酸，稀释成45%浓度。所需浓度（45%）=冰乙酸体积／溶液体积=45ml冰乙酸×0.95／（45+50），

⑴0.1mol.L盐酸溶液配制：用滴定管量取浓盐酸8.25ml，加蒸馏水至1000ml。 ⑵饱和氢氧化钡溶液配制：鲜配鲜用，称取5-8g氢氧化钡，用100mL煮沸的蒸馏水溶解，

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振摇充分溶解，待冷却后过滤，配成5%-8%的饱和氢氧化钡水溶液。

⑶1mol.L磷酸氢二纳溶液配制：称取Na2HPO.12H2O156.01，用少许鲜蒸馏水60℃下溶后，定溶1000ml。

⑷0.85%生理盐水溶液配制：称取0.85g氯化钠溶于100ml蒸馏水中。

⑸0.01%胰蛋白酶溶液配制：取活性单位1：250胰蛋白酶0.1g，Hank’液100ml，先用少许Hank’液溶解胰蛋白酶，然后再将余液加入，置于37℃水溶液中溶解1h，（时间长短取决于溶解度，待溶液全部透切清凉为止）。溶解后用除菌过滤器过滤，无菌分装，密封，贴好标签，置于-20℃冰箱中保存，使用前用0.1 mol.LNAOH调pH值为7.6-7.8。 ⑹Hank’原液配制：称取1.4g氯化钙溶于30-50ml的重蒸馏水中；取1000ml的烧杯及容量瓶各一个，先加入重蒸馏水800 ml于烧杯中，再分别称取氯化纳80.0g、Na2HPO4.12H2O，0.6g、氯化钾4.0g、KH2PO4 0.6g、MgSO4.7H2O 2.0g、葡萄糖10.0g（含1分子水时为11.0g），均在前一药品完全溶解后，方可加入后一药品，直到完全溶解后，定溶至1000ml；用滤纸过滤后，加入氯仿2ml防腐，充分混匀后，分装，贴好标签，4℃下保存。Hank’缓冲液配制：Hank’原液100ml，重蒸馏水896ml，0.5%酚红4ml，混匀后，在5.28×10Pa下灭菌，4℃下保存。使用前用0.1 mol.LNAOH调pH值为7.6-7.8。

⑺Dhank’溶液或0.02íTA钠盐溶液配制：氯化钠8g，绿化钾0.20g，磷酸氢二纳0.073b，磷酸二氢钾0.20g，无水葡萄糖2.00g，EDTA20mg。重蒸馏水加至1000ml。

⑻铁醋酸洋红染液配制：先将50 mL 45%的醋酸水溶液放入150mL的锥形瓶中煮沸，然后慢慢地加入0.5-1g洋红粉末（注意不要一下倒入，以防溅出），过1-2min后，加入一锈铁钉，再过几分钟后取出铁钉（使染色剂略含铁质，以增强染色性能），继续用微火加热1h后，冷却过滤，即可使用，保存于棕色瓶中（避免阳光直射）。如无洋红也可用地衣红代替，配制方法同前。此液常用于植物细胞核，特别是花粉母细胞的涂抹和压碎法染色，效果良好。

⑼席夫（Schiff）试剂配制：称0.5g碱性品红溶于煮沸的重蒸水（或蒸馏水）中，搅动使充分溶解，冷却至50℃时，过滤于—棕色细口瓶中，加入10mLlN HCl，冷却至25℃左右，加入1g偏亚硫酸钾或钠（Na2S2O5或K2S2O5），振荡使溶解，密封瓶口，置于黑暗和低温处过夜，次日检查，如染色液透明无色或呈淡茶色，即可使用。如颜色较深，可加入少量优质活性炭（0.5-2g），振荡1min，置4℃冰箱中过夜，经过滤后即可使用。此液配

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好后，应紧塞瓶塞，外包黑纸，贮藏于冰箱中。

⑽卡宝品红（Carbor fuchsin）试剂的配制: 称3g碱性品红，溶于100ml70%的乙醇中，称为A原液（此液可以长期保存），取10mlA液，加入90ml15%的石碳酸溶液（两周内使用），称为B原液。使用前，取B原液10ml，加入90ml45%的醋酸和1.8克山梨醇，充分溶解后备用。此液适用于植物核型分析、染色体形态观察。 五、实验原理

凡是细胞处于活跃增殖状态或经过某种实验处理后进入细胞分裂状态的任何植物组织，如植物根尖、茎尖、幼叶、花蕾、幼花粉、幼胚、核型胚乳、愈伤组织、居间分生组织、茎形成层等细胞分裂状态的植物组织均可以作为染色体分析的实验材料；通过8-羟基喹啉、秋水仙素、对二氯苯等预处理药剂处理，来降低细胞质的粘度，促进染色体缩短分散，障碍纺锤体形成；通过纤维素酶、果胶酶酶解去壁，使分生细胞的原生质体能从细胞壁里压出来，经过精心制片，使染色体周围不带有细胞质或仅有少量的细胞质，获得图象清晰、完整、高度分散的染色体典型图象。

各植物种的染色体数目都是恒定的，二倍体植物体细胞内都含有两组相同的染色体(chromosome)，每一条染色体都有两条染色单体（chromatids）。细胞有丝分裂时，每一条染色单体分向细胞两极，形成子细胞；细胞分裂间期染色单体复制，纵裂并向的两条染色单体往往通过着丝粒（centromere）联在一起。着丝粒在染色体上的位置是固定的，呈现出一个淡染色区间。着丝粒的两端是染色体的“两臂”，着丝粒不在中央的染色体，就必然有长臂（q）、短臂（p）之分。由于着丝粒位置不同，可以把染色体分成中部着丝粒染色体（m）、近中部着丝粒染色体（sm）、近端部着丝粒染色体（st）及端部着丝粒染色体（t）。有些染色体除了着丝粒之外，还有一段稍窄的淡染色区，叫次缢痕；次缢痕的远端突起，为随体（satellite）。

所谓核型（karyotype）就是指：一个细胞内的染色体按照一定的顺序排列起来，所构成的染色体图象；通常是将显微摄影得到的染色体照片粘贴或染色体核型分析系统软件处理生成的染色体图象。所谓组型（idiogram）就是指：通过许多细胞染色体测量，取其平均值绘制成的染色体模式图；通常是用染色体相对长度（relative length）、臂指数（am index）、着丝粒指数（centromere index）等形态特征参数来描述染色体模式图。人类染色体研究早在1960年就召开了专门的国际会议，确定了人类染色体核型分析的国际标准，即Denver命名标准；但植物染色体核型分析至今还没有一个专门的国

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际标准；1984年8月，我国第一次全国植物染色体学术讨论会上，李懋学、陈瑞阳（1984）所作的“关于植物核型分析的标准化问题”报告，经过与会代表的充分讨论，成为大家的约定标准，被同行所承认。由于染色体是基因的载体，核型代表了种属的特征，所以染色体组型分析对于探讨植物生命奥秘、生物起源、物种间亲缘关系、远缘杂种鉴定等方面都有重要意义。 六、实验方法

（一）植物染色体制片技术及方法 1、取材

一般来讲，凡是能进行细胞分裂的植物组织或单个细胞，都可以作为染色体制片材料；如根尖、茎尖、幼花、幼胚、愈伤组织及正在分裂的大、小孢子母细胞等；正确取材就是强调取材部位一定要准确，取材数量一定要少而精、切忌多而杂，材料新鲜、尽可能是活材料。 ?根尖

用能见根冠的根尖材料作为实验材料比较适宜；植物根尖不同部位的细胞，其分裂细胞频率有明显的差别；根冠是由不同分化程度的薄壁细胞组成，且常含淀粉粒，根冠细胞已经停止细胞分裂，染色体制片时应该切除根冠；但因根冠很容易识别，且根冠后1-2mm长的根段就是根尖分生区细胞，所以，根冠是确定根尖分生细胞区的重要标志；染色体制片时，比较重视能见根冠的根尖材料作为实验材料比较适宜。根尖分生细胞区多为等直径的分裂细胞，其细胞质浓，细胞核大、细胞核体积约占整个细胞体积的3/4，是染色体制片的好材料；染色体制片取材如果不是在根尖分生细胞区取材，即使制片全过程每一环节都作得很好，也是徒劳的。根尖分生区上端是伸长区，该区的细胞主要是细胞体积增加，基本上已停止分裂。所以，根尖染色体制片的取材部位是根冠末端1-2mm的根段为宜。以洋葱为例，根冠区约0.5mm，分生区1－2mm，3mm之后为伸长区。物种不同根冠及分生区的长度也不同，一般而言，用于染色体制片的根尖长度，以根冠末端1-2mm为宜。

植物体细胞染色体的研究中，根尖分生组织是主要的染色体制片材料；因为它取材方便，分生区易于区别，如果用种子发芽取根，还不受季节的影响，这是其他材料所不及的。根尖材料获得的方法很多，常有种子发芽、鳞茎水培、扦插取根、引发气生根等。 ①种子萌发取根：生长健壮的根尖不仅细胞分裂频率较高，而且染色体形态也比较平

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直，也就是所谓的“硬染色体”；而根尖生长势差的材料，不仅细胞分裂频率低，而且染色体形态也多是扭曲的，也就是所谓的“软染色体”。所以，种子萌发取根，不仅要求种子的饱满度、生活力等品质性状好，还要求种子萌发条件最佳，获得最佳的“硬染色体”。

②鳞茎水培：洋葱、水仙、蒜、风信子等材料多用此方法；在水培过程中，注意经常更换新鲜的同温水，是获得良好材料的关键。

③扦插取根：扬、柳、桑、葡萄、菊花等扦插繁殖植物多用此方法；在扦插繁殖过程中，注意保湿通气，可以获得良好的根尖材料。 ?茎尖

用能见生长锥的茎尖材料作为实验材料比较适宜；茎尖一般包括有生长锥和叶原基两部分，广义上讲的芽，还包括有幼叶和腋芽原基。生长锥是茎的顶端分生细胞组织区，不同植物或同一植物的不同发育阶段，其生长锥的大小和形状都有较大的变化，他们可以是下凹、园丘、园锥或极端伸长（如禾本科）等多种不同的形状；生长锥的宽度，因物种不同也不同；丁香生长锥宽度<40μm，苏铁生长锥宽度达300μm。生长锥不同部位的细胞，其细胞分裂的频率及细胞周期长短有明显的差异。一般来讲，生长锥则面的叶原基细胞比生长锥中心区细胞的分裂周期短一倍左右；如曼佗罗生长锥中心区及叶原基区细胞分裂周期分别为76、36h，菊花生长锥中心区及叶原基区细胞分裂周期分别为140、70h。也就是说，生长锥则面的叶原基细胞也是染色体制片取材的好材料。茎尖取材以生长锥顶开始1.0-1.5mm为宜，休眠芽不宜用作染色体制片的材料。茎尖取材工作是比较繁复的，需要细心地剥掉全部幼叶，用扩大镜观察，能见生长锥时方可。

物种不同，生长锥的形状及宽度，因物种不同也不相同，且易受季节影响；所以，茎尖取材技术难度比根尖取材技术要高。茎尖的正确取材，更需要强调取材部位一定要准确，取材数量一定要少而精、切忌多而杂，应在扩大镜下，尽可能地剥除幼叶、尽可能地减少木质分子结晶的干扰。 ?幼叶

幼叶是叶原基顶端分生细胞继续分裂发育形成的小叶，其发育早期主要是细胞分裂使叶原基伸长、增加体积、形成叶轴，所以幼叶可以作为染色体制片的材料。幼叶的分生组织，按其分布位置可以分为顶端分生组织、近轴分生组织、边缘分生组织、居间分生组织及板状分生组织等。一般来讲，顶端分生组织的细胞分裂使整个叶原基伸长、形

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成锥形的叶轴，是没有分化的细胞，但其分裂活动停止较早；居间分生组织的细胞分裂活动停止较晚，是染色体制片取材的好材料；边缘分生组织的细胞分裂形成扁平的叶片，其分裂活动依物种叶片厚度不同而不同。幼叶的取材大小，依物种而异，但总原则是幼叶越小越好，一般以含有叶轴的幼叶5－10mm长为宜，子叶则以1.5－3mm为宜。 ?花蕾

花蕾是指花芽分化始期至减数分裂之前的幼蕾，包括花辨原基、雌蕊原基及雄蕊原基正在细胞分裂的花芽。

花蕾是仅次于根尖染色体制片的理想材料，它的最大优点是在植物孕蕾阶段，可以直接从植株上取得大量的制片材料，幼小的花药和子房，往往比根尖更便于制片操作，且细胞分裂指数比根尖材料高；花蕾的取材时间，通常需要定期镜检作出选择，其方法是取幼小花药或子房在植物孕蕾期，多数植物在开花前10d以上；其方法是取含有幼小花药和子房的小花3－5mm左右方可。 ?花粉

是指花粉母细胞减数分裂后，所形成的小孢子至发育成为雄配子体过程中的花粉粒，植物小孢子形成后，要经过1-2次有丝分裂，形成具有两核或三核细胞花粉。如百合科、石蒜科、鸭跖科、茄科等植物为两核细胞花粉，禾本科、菊科等植物为三核细胞花粉，极少数植物是两核和三核细胞兼有，如堇菜属植物。利用小孢子有丝分裂过程来观察染色体，有独特的优点：其一、是染色体数目减半后的细胞，染色体数目是单倍数，为染色体记数或核型分析提供了极大的方便；其二、花粉分裂细胞数目多，可以同时获得大量的实验材料；其三、一般都不需要进行预处理和细胞解离，操作简便。因此，对难以获得种子或种子发芽困难的植物来说，是比较理想的材料来源。取样时间，与减数分裂取材时间相当，多数植物在开花前3－12 d，主要以植物的某些形态特征为参考依据。如小麦在麦穗伸出旗叶1-4cm,玉米雄花序抽出3cm左右，棉花花蕾10-13mm,芍药花蕾直径1.5-2cm,银杏花药呈黄绿色时等形态特征，都是处于减数分裂后第一、二次有丝分裂时期，是染色体制片最佳取样时期。 ?愈伤组织

是指人工培养条件下产生的愈伤组织。在一块愈伤组织中，细胞分裂比较集中的部位，通常难以确定，受培养条件的影响较大，因此，准确取材比较困难。一般来讲，以转移到新鲜培养基上，经3-7天培养后的材料比较适宜；在解剖镜下观察，细胞个体小，

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细胞核大，细胞质浓的愈伤组织分生细胞是染色体制片最佳取样材料，而细胞体积较大、比较疏松透明的细胞群，因细胞老化，而难以获得理想的染色体。 2、预处理 ?目的及作用

植物有丝分裂中期染色体高度浓缩，形态和结构都比较清楚，但因纺垂体的作用，染色体紧密地排列在赤道板上，很难将其分开,尤其是染色体数目较多的植物材料，很容易产生染色体严重重叠；而且因细胞分裂中期维持的时间短，一般仅10-30min，使中期染色体细胞出现频率不高。为了克服上述矛盾，常用化学或物理方法对材料进行预处理。这些方法的作用机理及其作用是：①阻止或破坏纺垂体微管的形成，由于没有纺垂体的作用，细胞有丝分裂过程，被阻抑在细胞分裂中期阶段，从而累计比较多的处于细胞分裂中期的染色体图象。②促进染色体浓缩变短，减少染色体之间相互缠绕重叠，有利染色体的高度分散。③改变胞质粘度，促进染色体清晰，促进细胞质清洁。所以预处理是否适宜，是染色体制片技术中最关键的操作步骤；如果预处理的效果良好，即使是初学者也不难制作出优良的染色体标本，反之，如果预处理失败，即使是很有经验的人也难以制作出好的制片。 ?处理药剂

可以用作染色体预处理的化学药品，主要有生物碱、甙类、酸类及其他物质；最常用的化学药品有秋水仙素、8－羟基喹啉及对二氯苯。

①秋水仙素（Colchicine）：是从石蒜科秋水仙素属秋水仙(Colchicum autumnale)种子或鳞茎中提取的一种生物碱，其分子式为C22H25NO6·1.5H2O，分子量为399.45。纯秋水仙素为针状结晶，商品多为白色或淡黄色粉末,融点155℃，易溶于水、酒精、氯仿及甲醛中,但在热水中的溶解度差，不溶于苯。剧毒,易引起眼睛失明或中枢神径麻醉，使用时一定要要注意安全。秋水仙素预处理的有效浓度为0.001-1%，常用浓度为0.05-0.2%。 ②8－羟基喹啉（8-hydroxyquinoline）：白色结晶或粉末, 其分子式为HO8H3N：CHCH：CH，分子量145.17。溶于酒精，难溶于水,需60℃、2－3h才完全溶解。8－羟基喹啉不仅具有秋水仙素的预处理的效果，而且所显示的染色体缢痕及随体的结构，往往比秋水仙素更为清晰，尤其在处理中、小型染色体比秋水仙素好，能使染色体、缢痕及随体的图象更清晰。常用浓度为0.002mol/L，少数学者使用0.004mol/L浓度，但使用者不多。 ③对二氯苯（p-dichlorobenzene）:为一种苯的衍生物，其分子式为C6H2CI2，分子量为

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147.00。商品对二氯苯为无色结晶，大块时呈白色，具有特殊臭味，常温下可以升华挥发；易溶于乙醇、乙醚、苯等有机溶剂，难溶于水；易燃、有毒，通常用作防腐剂。对二氯苯比秋水仙素远为价廉而易得，药剂配制及使用方便，易于广泛使用。对二氯苯在水中的溶解度很低，多用饱和水溶液进行预处理；所以，对不同植物预处理时仅需要考愈处理的时间长短，不需要考愈浓度。对二氯苯应用范围广泛，对大染色体、小染色体植物预处理都有效。对二氯苯不仅对纺锤体微管的组装有较强的阻抑作用，还可能对其他微管蛋白或某些细胞器有分解作用，能很大程度上改变细胞质粘度，称之为细胞质清除作用。因此，使染色体易于分散，尤其是对染色体数目多的细胞，染色体分散效果好。但对二氯苯对细胞代谢活动有较大的毒害作用，预处理温度太高或时间太长，都容易导致染色体断裂、粘连等类似于辐射畸变的效果，曾被用作植物的化学诱变剂。因此，严格控制预处理时间、温度条件是非常重要的。一般采用鲜配鲜用的方法，即称取5g对二氯苯结晶，用40-45℃蒸馏水100mL溶解，振摇5min，静置1 h，取上清液，10-20℃下预处理。 ?处理方法

预处理的方法往往容易被忽视，但预处理失败的实验多是预处理的方法使用不当而致。就材料本身而言，预处理的方法有离体处理、非离体处理和低温三种。

①离体处理：即将处理器官或组织从母体上切除下来，浸没在预处理液中。该处理方法的主要特点是药物作用迅速，短时简便，良好的预处理效果是在细胞的某些合成作用受到抑制，而前期分裂过程又能正常进行的条件下获得的。由于被处理的材料小，离开了母体，细胞代谢的能源被中断，加上处于严重缺氧和有毒的恶劣环境中，一旦处理时间太长或毒害太大，细胞将会因缺氧中毒、死亡。所以，预处理的技术性强，操作要求高。多用培养皿铺2层滤纸，加一浅层预处理液，均匀摆齐，让少部分材料能露出预处理液的液面，也可以用指形管沉没材料的方法进行处理。一般来讲，提高预处理效果，应该做到：被处理的材料忌多，根尖或茎尖每管不超过15个，每皿不超过30个；切取的材料忌大，根尖或茎尖长2－3mm；注意避光通氧，采用经常更换预处理液或振摇的方法完成预处理过程；预处理温度不宜太高，20℃为宜，一般不超过25℃；预处理时间依物种不同而不同，一般1－3h。

②非离体处理：预处理材料没有与母体分开，仅仅是把要预处理的部分浸入预处理液中，如带有种子种根、鳞茎、根状茎、茎节的根尖，只将根尖分生区浸没在预处理液中进行

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处理。由于分生组织没有离开母体，耐药抗毒性强，允许延长相应的处理时间，但也正因为如此，药物的作用也相应减慢。所以，处理的持续时间便随之延长。如果处理得当，非离体处理比离体处理积累的中期分裂细胞更多。非离体处理的药物多是秋水仙素，因预处理时间过长，则可能导致染色体数目加倍，产生多倍化细胞。处理的方法是，把分生区组织浸没在预处理液中，20℃条件下，多数植物一般不超过25℃，大染色体类型材料处理12－20h、小染色体类型材料处理4－5h。如果需要将预处理材料保存7天以上时，用非离体处理比较好。

③低温处理：低温也可以阻抑纺锤体微管的组装，与预处理药物有异曲同工的效果。但是，低温作为一种预处理的方法，并不能适用于所有植物。这是因为不同植物的分生组织细胞对低温的反应是不同的，其细胞的合成、代谢及分裂都有不同的临界低温，尤其在离体条件下情况十分复杂。至今，用低温预处理获得较好效果的报道仍然很少。成功的例子主要是禾本科农作物，如小麦、黑麦、大麦用1-4℃低温，水稻、玉米用6-8℃低温预处理能获得较好的效果。低温也有抑制纺垂体形成的作用，将活体材料或离体材料浸入蒸馏水，置于4℃冰箱中处理20-40h，有一定的预处理效果。 3、前低渗

?目的与作用：自20世纪50年代在人类及哺乳动物染色体制备研究中的低渗和火焰干燥法发明以来，就有许多学者试图将人类染色体标本的0.075mol.LKCL低渗技术引入到植物染色体标本制备上，但都没有进展。直到1979年，陈瑞阳等人在前人工作的基础上，通过37科422个物种广泛试验，才创建了一套完整的去壁低渗技术。低渗的目的是促使分裂细胞膨胀，细胞膜的淋巴细胞膨胀，使染色体从细胞膜内释放出来，能使细胞质和染色体上部分蛋白质丢失。植物染色体标本制备中的前低渗，其主要作用有两个：①促进质壁分离，有利于用酶去壁。②促进细胞质粘度改变，有利于染色体图象清晰。★为什么说前低渗是染色体标本制作的关键技术？

?处理药剂：一般多用氯化钾作为前低渗药剂，KCL为白色结晶,分子量74.67，易溶于水，常用浓度0.075mol.L，也可以用双重蒸馏水前低渗，但比氯化钾低渗效果差些。 ?处理方法：去掉预处理液，用0.075mol.L氯化钾低渗液浸没材料，25℃下处理30min。如果因时间或工作的原因，需将预处理材料保存几天或一段时间，则前低液处理时间不宜太长，一般不超过10min(6－8min)，用甲醇：冰乙酸=3:1鲜固定液固定4h,转入75%乙醇，再转入50%乙醇中保存备用。酶处理之前，用蒸馏水冲洗多次，并浸泡30min。

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4、酶解去壁

?目的与作用：Gill(1974)在压片前应用纤维素和果胶酶对细胞壁进行解离，Mouras(1978)等人用烟草愈伤组织经纤维素处理获得染色体，Omura和Kurata(1978)在水稻染色体研究中应用了纤维素酶、果胶酶处理取得了一些进展，陈瑞阳提出了植物染色体标本制备的酶解去壁低渗方法。酶解去壁的作用：①生物解离处理替代理化解离处理，减少了染色体变形、畸变，呈现出真实的硬染色体。②去掉细胞壁纤维、果胶及胞质对染色体数量影响，使染色体分散空间更大。③有利染色体着丝点随体等图象完整清晰。酶解去壁是染色体标本制备的关键技术，因为它直接影响到单细胞的得率，酶解不足或过度都会导致染色体制片失败，被处理材料的大小、数目，酶的质量、浓度、pH值及处理温度都会影响到酶的处理效果。

?处理药剂：纤维素酶，有国产及进口两类商品；进口纤维素酶因纯度高，而价格贵；国产纤维素酶实用、价格便利，商品多为综色，1g装。果胶酶，也有国产及进口两类商品；国产果胶酶浅灰色粉末，10g装，均溶于水。常用浓度2.5%，100余个根尖约100mL2.5%纤维素酶及果胶酶液用量方可。

?处理方法：将纤维素酶及果胶酶按5%的浓度充分溶解，再按1：1等量混合，配成2.5%浓度混合酶，鲜配鲜用。吸除前低渗液后，加入混合酶液；25℃下处理2－4 h，因物种不同，处理的时间也不同，但均以被处理材料一触即破为度。处理结束后，注意酶液回收，4℃下保存可以再次利用；回收酶液的活性单位及浓度会有所下降，再次利用时，处理的时间会有所延长；需要10多小时处理时，应注意防止酶液干燥。 5、后低渗

?目的及作用：后低渗是染色体分散的关键步骤，其主要作用是：①使细胞吸水膨胀，让染色体随之分散到细胞质内，有利于染色体分散。②新鲜双蒸馏水进入细胞，使细胞体积增大，细胞质浓度降低，有利于染色体标本清洁程度提高。③后低渗处理时，混合酶已将分裂细胞的细胞壁酶解，原生质又充分吸水，所以细胞显得比较娇嫩，应该向被处理材料中加入（25±0.5）℃鲜双蒸馏水为宜。

?处理方法：混合酶液回收以后，用（25±0.5）℃蒸馏水清洗2－3次。如果用吸管回收酶液或吸掉清洗液时，被处理材料也有被吸出危险，应该放慢操作速度或者适当减少清洗次数。清洗完毕后，向被处理材料中缓慢加入新鲜双蒸馏水，浸没材料为度，（25±0.5）℃下浸泡30 min，让细胞吸水膨胀。

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后低渗处理后，常有悬液法及涂片法两种染色体标本制备方法。涂片法是先固定再涂片，被广泛使用，而悬液法是先制备细胞悬浮液再固定滴片。 6、固定

?目的及作用：固定的主要作用是①迅速杀死细胞，保留分裂图象。②使染色体核蛋白变性、沉淀，呈现出染色体真实形态及结构。③使细胞质原生质体蛋白变性、沉淀，有利于染色体背景清晰。

?处理药剂：①卡诺氏Ⅰ：冰乙酸：无水乙醇=1:3，比较适宜于动物染色体标本制片；卡诺氏Ⅱ：冰乙酸:氯仿:无水乙醇=1:3:6，比较适宜于油脂类含量较多的生物。②冰乙酸：甲醇=1：3，通用于多数生物染色体标本制片，近来普遍采用。

?涂片制备法的材料固定方法：将低渗后的材料直接用固定液，固定30min以上。固定液宜现配现用，固定时间依物种不同而有些不同，固定30min-20h，材料粗大宜长，反之则反，4℃低温下固定的效果更佳，一般为30min。 7、涂片

酶解效果好时，组织一触即破，多用涂抹制片方法。将材料放在预先洗净、用蒸馏水浸泡，并冷冻的清洁玻片上，滴一滴固定液，然后用镊子取一根尖留取分生细胞区，迅速将材料敲碎涂抹，并去掉大块组织残渣。酶解效果不好时，可以用镊子柄垂直敲打；滴45%醋酸1-2滴后，再次敲打，借助醋酸液表面张力把分裂细胞分开、把染色体引开，并除掉大块组织残渣。涂抹或敲碎涂抹制片的玻片均应自然干躁或火焰干躁。火焰干燥是指载有分裂细胞材料的载玻片在酒精灯火焰上微微加热烤干的办法，火焰干燥对分裂细胞有分色的作用。为了加强细胞分色，还可以在材料处滴加1滴甲醇冰乙酸固定液后，再火焰干躁，其细胞分色效果更好。火焰干躁时，玻片离火焰3cm左右，来回晃动，千万不要离火焰太近，防止炸片导致细胞破碎。涂片干燥后进入下一步染色。

悬液法先制备细胞悬液：倒去后低渗处理的双蒸馏水，用镊子将材料挟碎、搅拌，形成细胞悬液，再固定、去沉淀及滴片：①固定：向细胞悬液中加入鲜配的甲醇冰乙酸固定液1-2mL，置20min，细胞悬液中出现大块组织沉淀时，将上层细胞悬液，倒入另一个小瓶中，去掉沉淀物；去掉沉淀物的细胞悬液净置30min，能见细胞沉淀时，用吸管轻轻地吸去上清液，留1mL左右细胞悬液为染色体标本滴片备用。取一张预先洗净、用蒸馏水浸泡，并冷冻的清洁载玻片，用吸管滴2-3滴细胞悬液滴在玻片上，立即将玻片一端抬起，并轻轻吹气，使细胞迅速分散，然后在酒精灯火焰上微微加热烤干或自然干燥。

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8、染色

?目的及作用：染色的目的是尽量使染色体及细胞核染色，而细胞质不染色或淡着色，以便于观察。因染色体被染色，呈现出原有的形态结构及数目，能进行植物染色体核型分析；因生物染色体上富含A－T或G=C碱基数量及分布差异或其它原因，经染色在染色体上可以产生着色深浅不同的染色体显带，为植物核型分析补充了一项很好的分类指标，进行染色体带型分析。 ?常用药剂

用于植物染色体染色的方法很多，各种染色方法都有其自身的特点及其适用的材料，下面简介国内外常用的几种染色剂。

①洋红（Carmine）：洋红是从胭脂虫(Coccus cacti)的雌虫中直接提取的一种染料，为非结晶的紫褐色物质。但因所用的胭脂虫的种类不同，洋红的品质也往往有些差异。在胭脂虫的提取物中加入铝或钙而成为深红色的洋红，洋红并不是真正的化合物，而是一种混合物。洋红中具有染色活性的洋红酸（Carminic acid），为一种二元酸，有一定比例能溶于水，在它的等电点Pp=4.0-4.5时几乎不溶于水。如果溶于等电点酸性的一边，则成为一种类似碱性染料的性质，可以使染色质着色；如果溶于碱性溶液中，则具有酸性染料的性质，可以使细胞质着色。洋红酸的染色能力不是很强，通常铁-乙酸洋红、乙酸-盐酸洋红、丙酸-铁-洋红。乙酸或丙酸洋红的配制和染色都比较方便，对细胞壁的穿透能力较强，能使染色体核仁均可以着色，很适于植物小孢子母细胞及小孢子的染色，但它的染色强度和分散效果不及其他染料。所以不及其他染色剂应用广泛，通常只作临时染色观察之用。

②地衣红（Orcein）：地衣红是从一种地衣红（Lecanora parella）及染料衣(Rocella tictoria)中提炼出来的紫红色染料。地衣红与过氧化氢、氢氧化氨作用，可以获得无色

的母物地衣酸（Orceinic acid）,天然产物的地衣红与人工合成的地衣酸对染色体有同样的染色作用，但后者不如前者，地衣红溶于水及酒精，其配制方法与乙酸洋红相同，但无需加铁媒染，也无需回流（药剂配制见附录）。先配成2%母液，再稀释成1%后使用。地衣红对染色体及细胞核着色能力明显优于洋红，为目前国内外应用十分广泛的一种染色体和细胞核的染色剂。

③碱性品红（Basic fuchsin）：为一种三苯甲烷类的碱性燃料，商品碱性品红几乎都是由副品红（pararisaniline）或蔷薇苯胺（rosaniline）组成。碱性品红所含的所有成

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分均溶于水，更易溶于乙醇。碱性品红用于染色体染色，有两个重要的配方，即卡宝品红（Carbol fuchsin,也称苯酚品红或石炭酸品红）及锡夫（Schiff）试剂。卡宝品红，是目前国内外应用最为广泛的一种优良的核和染色体的染色剂，它既具有乙酸洋红的染色简便、快速的特点，又具有乎尔根（Feulgen）反应分色清晰的优点，且染色剂耐保存、稳定性好、制片色泽持久，这些都是前两种方法所不及的，该染色剂在我国的推广应用最为普遍。该染色剂配制后立即使用，染色较淡，放置2周后，染色能力会明显加强，而且放置的时间越长，染色的效果会越好。在常温下，此液可以存放两年而不会变质。卡宝品红对染色体的染色效果，与盐酸的解离条件密切相关，解离的时间太短，细胞质也会有不同程度的着色、分色效果不理想；在合适的解离条件下才有最佳的染色效果，染色体呈红色，细胞质无色或极淡红色，着色之前，最好将材料中的残余盐酸冲洗干净，否则卡宝品红将不易着色。锡夫（Schiff）试剂是Feulgen R与Rossonbeck H于1924年创造的一种DNA的细胞化学鉴定方法，也称为乎尔根（Feulgen）染色方法。锡夫（Schiff）试剂的配制，该方法的优点是只对细胞核和染色体着色，染色也比较均匀、背景清晰，但染色时间长，少数植物染色十分困难，因过度软化，而染色体分散困难。 ④卡宝品红（Carbor fuchsin）: 卡宝品红是3%的碱性品红与15%石碳酸或45%醋酸等试剂配制而成，具有染色快、着色深、适应性广的特点，是多数植物根尖、幼芽、花药以及细胞愈伤组织染色的好染料。

⑤姬母萨（Giemsa）：最初用于DNA原位分子杂交(parldue, 1970)。随染色体分带技术兴起及发展，Giemsa染色愈加广泛应用。是一种含有不同氧化程度的噻嗪类复合染料，噻嗪类染料与磷酸基结合着色，有4个甲基亚甲兰和3个甲基天青A，2个甲基天青B协助噻嗪染料使染色体着色。因为它不仅仅使染色体着色，还可以把DNA复性过程中，DNA上“碱基种类(富A－T，还是富G－c)，从着色带纹上区分，称染色体显带。Giemsa染色，因材料不同，着色速度差异很大，从几分钟到数小时不等。进化阶段低的植物种或固定时间长的材料易于着色，而进化阶段高的植物种或固定时间短的材料不易于着色。从染色体染色效果来看，上述四种染色剂中，染色效果最好的是Giemsa，其次是卡宝品红，依次才是地衣红、锡夫（Schiff）试剂、洋红。

?染色方法：因染色剂不同，染色方法也有些微小差异。但都有两种染色方法，其一、制片后玻片材料染色，一般都要待被染色材料干燥后，取染色剂染色。如取Giemsa、卡宝品红或地衣红染色稀释液，浸没材料区、严防气泡干扰，染色15 min或者更长一点的

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时间，稀释液的稀释倍数见药剂配制附录。待染色时间足够后，自来水冲洗玻片，注意水流量不能太大，冲洗时，材料面面对自来水缓慢冲洗；待多余染料冲洗完毕后，让染色体玻片自然干躁或火焰干躁，加盖盖玻片后，用显微镜观察。其二、材料整体染色，在染色体常规压片方法中还比较流行用材料整体染色方法，各种染色剂的整体染色方法见附录。Giemsa染色，一般按Giemsa母液：缓冲液=1：20稀释（pH为7.6时），浸没材料区染色15 min。地衣红染色，一般按母液：鲜蒸馏水=1：1稀释，浸没材料区染色15 min。

上述1-8步都是用植物活体材料直接去壁低渗，再固定进行染色体标本制片的方法，称为活体材料制片法。为了方便野外材料采集，又提出了预先固定材料的去壁低渗方法，即需要染色体制片的材料，可以分批采集，经过预处理后就用甲醇冰乙酸固定，集中染色体制片的方法。如果采集的材料能在1周之内进行染色体制片，可以在甲醇冰乙酸固定液中保存，超过1周还不能进行染色体制片时，应把固定后的材料，用剃度酒精处理，保存在70%的酒精中，备用。

预先固定材料的去壁低渗方法与活体材料直接去壁低渗方法，大同小异。大体步骤为：正确取材→预处理→甲醇冰乙酸固定→前低渗→酶解去壁→后低渗→涂片或悬液法滴片→染色，方法同前。

预先固定材料的去壁低渗方法与活体材料直接去壁低渗方法的比较：活体材料直接去壁低渗法的最大优势是活体原生质，半渗透性很好，吸水速度快，染色体因低渗作用而分散到细胞质内，所以染色体分散程度高，容易获得比较好的染色体图象。但它的不足之处是不便于野外材料采集，每一批材料采集后，都要立即染色体制片，需要制片的材料很多时，时间紧张，工作也显得比较累。预先固定材料的去壁低渗法的最大优势是方便野外材料采集，需要进行染色体制片的材料可以分批采集，集中染色体制片。但因先固定再酶解，细胞质失去半渗透性，染色体难以随低渗作用分散到细胞质内。所以，低渗吸水的时间需要很长的才会使细胞软化膨胀，染色体分散的效果也没有活体材料直接去壁低渗方法的好。 9、实验观察

染色体标本玻片干躁后，先用低倍镜找分裂细胞区，在分裂细胞区内寻找典型分裂相细胞。当找到含有红色条状物质的细胞轮郭图象后，再用高倍镜观察染色体，把染色体数目齐全、分散度高、重叠很少的图象，记录其染色体数目、坐标及图象，作实验报告，尽可能地观察到染色体的长臂、短臂、着丝点位置及某些染色体次缢痕、随体；图

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象十分清晰的玻片，在材料面右边帖上标签，说明材料名称，制片时间，工作者姓名。据实况加分，并交玻片。 10、封片

染色体标本玻片制好后如果来不及观察或照相时，需要暂时封存。暂时封存先在盖玻片四周各放麦粒大石蜡一块，再用烧热的解剖针迅速溶化石蜡，使盖玻片四周严密封闭。封好的玻片可放在冰箱内保存7-10天。如果玻片染色不太理想，可以水解或用固定液退色后，改用卡宝品红染色5-10min。发现有图象清晰、完整、高度分散的染色体典型图象制片后，应制成永久玻片，将玻片在二甲苯中脱水1小时，凉干后，在典型分裂图形处滴上1滴中性树脂或达马胶，盖上盖玻片封片，制成永久玻片。 （二）植物染色体组型分析技术

由于国际上还没有一个植物染色体核型分析的共同标准，国内有关染色体的统计、测量、命名、图表格式等项工作，各人所采用的方法和标准也不尽相同，在染色体研究工作中，就有一个急需解决的问题，即核型分析的标准化问题。1984年8月，在辽宁兴城召开全国第一次全国植物染色体学术讨论会上，李懋学、陈瑞阳联名（1984）作了“关于植物核型分析的标准化问题”报告，经过与会代表的充分讨论，根据大多数代表的意见形成大家约定的标准，被同行所承认。 1、核型分析的约定标准 ?染色体的数目

由于减数分裂价体难以保证准确，所以，仅除苔藓和蕨类因材料所限而用减数分裂细胞记数外，一般以体细胞染色体数目为准。统计的细胞数目应在30个以上。其中85%以上的细胞具有恒定一致的染色体数目，即可认为是该植物种染色体数目。如果观察材料是混倍体，则应如实记录其染色体数目变异范围及各类细胞的数目及百分比。 ?染色体的形态

作为核型分析的染色体，一般以体细胞分裂中期的染色体作为基本形态，如果减数分裂粗线期的染色体分散良好，着丝粒清晰者，也可以用作核型分析。核型分析的细胞数目以5个以上的细胞为准，不仅要求有一定的数量，更要求有高质量的染色体图象，才会保证核型分析准确。 ①染色体长度

染色体绝对长度（或实际长度）：均以微米(μm)表示, 一般宜在放大照片或图象上

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进行测量, 换算成μm长度。染色体绝对长度=放大染色体长度(mm)/放大倍数×1000。绝对长度值只在有些情况下才有相对的比较价值；在许多情况下，它不是一个可靠的比较数值，因为预处理条件和染色体缩短的程度不同，即使是同一个物种，不同的实验者测得的绝对长度往往有明显的差异。所以，绝对长度的稳定性不是很理想，仅作为相对长度计算的基础，一般都不列入核型分析表中。

染色体相对长度：均以百分率表示，计算相对长度值的方法，在过去的文献中也有多种公式，现以levan(1964)的公式计算为准。染色体相对长度(%)=染色体绝对长度(μm)/染色体组总长度(μm)×100；每对同源染色体长臂的相对长度(%)=染色体长臂的绝对长度(μm)/染色体长臂的总长度(μm)×100。相对长度是稳定的可以比较的数值，近年来，国内外多数核型研究的文献中，往往只用相对长度值，将相对长度值列入核型分析表中，这种简化是可取的。

染色体相对长度系数（I、R、L）：这是郭辛荣等人（1972）提出的对染色体长度分类的方法，即染色体相对长度系数（I、R、L）=染色体长度/全组染色体平均长度。I、R、L<0、76时为短染色体（S）；76≤I、R、L≤100时为中短染色体（M1）；0.1≤I、R、L≤125时为中长染色体（M2）；I、R、L≥126时为长染色体（L）。

染色体长度比：是指核型中最长染色体与最短染色体的比值，即染色体长度比=最长染色体/最短染色体。在Stebbins(1971)的核型分类系统中，它是衡量核型对称或不对称的两个主要指标之一。 ②臂比

臂比的计算公式为：臂比=染色体长臂／短臂，臂比列入核型分析表中。 ③着丝粒位置

据染色体臂比，参照levan(1964)的染色体命名规则，经过讨论，略加修改，即取小数点后两位数值，以严格区分，并列入核型分析表中。着丝点在染色体上的位置是固定的，由于着丝位置不同，可以把染色体分成几种形态种类（见表9-1）。

表 据臂比进行染色体命名标准

臂比值 着丝点位置 染色体命名 简记符号 1.00 正中部着丝点 正中着丝点染色体(median point) M 1.01-1.70 中部着丝区 中部着丝粒染色体(median point) m 1.71-3.00 近中部着丝区 近中着丝粒染色体(submedian point) sm

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3.01-7.00 近端部着丝区 近端着丝粒染色体(subterminal pont) st 7.01以上 端部着丝区 端部着丝粒染色体(terminal pont) t ∞+ 端部着丝点 端部着丝点染色体(terminal pont) T 此命名规则的特点是将染色体的一半长度分为两粒四区，这四区是等分的。Levan等人在分析了其他各种着丝粒命名法之后指出，这种命名发是比较合理的。现已被全世界广泛采用。

其他常用的命名：为了便于阅读文献时参考，下面把其他常用的着丝粒命名法，如着丝粒指数和短臂差值Levan等（1964）的命名规则对照列于表9-2。臂比=长臂/短臂，即r=L/S，差值=长臂-短臂,d=L-S，染色体全长为10；着丝粒指数=短臂/染色体全长×100 i=100S/C;三者的换算公式分别为d=10(r-L)/(r+L); r=(10+d)/(10-d); I=100/(r+L) ×5(10-d.)

④臂指数或N.F值（number fundamental）: 臂指数(N.F)=(中部着丝粒染色体+近中部着丝粒染色体数目)×2+（端部着丝粒染色体+近端部着丝粒染色体数目）×1，即把中部和近中部着丝粒染色体计算为2，把端部和近端部着丝粒染色体计算为1，两者的总和为总臂数。

?核型的表述格式

包括核型计算的基本数据、染色体序号、模式照片、核型图、核型模式图、核型公式及核型分类7个内容。

①核型测定数据表：核型分析中各项测定的平均数值，应列表报道，列表内容要简明实用，其格式和项目见表9-3

表 染色体相对长度、臂比和类型 序号 相对长度 臂比 类型

（短臂+长臂=全长） （长臂/短臂）

1 9.934 10.099 20.033 1.017 m 2 6.954 8.278 15.232 1.188 m ? n

表中染色体序号一律用啊拉伯字母，相对长度和臂比均取小数点后两位数，第三位数四舍五入。染色体绝对长度变异范围、染色体长度比、核型类别等内容在表下单列说明。随体的长度一般不计算在染色体全长内，列表时，在具有随体或次缢痕的染色体应

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在表中该染色体序号上标上“*”号。

②染色体序号：一律按染色体全长，由长到短按序编号。如果两对染色体长度完全相等，则按短臂长度顺序排序。性染色体及B染色体一律排在最后。二型核型（bimodal karytype）,如中国水仙、芦荟等植物，则长染色体群按L1、2?顺序排列，短染色体群按S1、2?顺序排列。异源多倍体，根据其亲本的染色体组分别排列。如普通小麦按A、B、C三组分别编号排列，而不是全部21对染色体统一顺序排列。如果核型中有差异明显而恒定的杂合染色体对时，则应分别测量每一成员的长度值和臂比值，分别列于表中，编号可在任选其中一成员为准，并附加说明。

③模式照片：一般每种材料应附一张有代表性的中期染色体的完整照片，并标明一个以微米为长度单位的标尺，便于目测染色体大小，尽量少用放大倍数。

④核型图（karyogram）：将于模式照片同一细胞的染色体剪下或复制粘贴，参考染色体长度和臂比值，进行同源染色体配对，然后按表格中的染色体序号顺序排列。即为该细胞的核型图。⑤核型模式图(idiogram)：用表中所列各染色体的相对长度均值绘图，横坐标为染色体序号，纵坐标为染色体相对长度（%）

⑥核型公式：综合核型分析的结果，将核型的主要特征以公式形式表示。它简明扼要、便于记忆和比较。如牛角椒2n=24=20m+2sm(SAT)+2st(SAT).

⑦核型分类。据Stebbins(1971)参照生物界现有核型分析资料，根据核型中染色体长度和臂比两项主要特征，区分核对称和不对称性程度，将其分成12种类型（表9-4）。

表 12种核型类型分类表

最长染色体/最短

染色体

臂比大于2：1的染色体比值

0.0 1A 1B 1C

0.0-0.50

2A 2B 2C

0.51-0.99

3A 3B 3C

1.0 4A 4B 4C

<2：1 2：1—4：1 >4：1

该分类法在分析和讨论核型进化的一个方面是有参考价值的，可以作为核型表述的一项内容。

?关于具有小染色体的植物核型分析

所谓小染色体，是指其长度在2微米以下而又不容易分辨着丝粒的染色体。植物界中，具有此类染色体的种类很多，有的整个属或整个科均有。以往，这类植物所提供的惟一

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细胞学信息就是染色体数目。为了核型研究的范围，对这类植物提供比单一的数目更多一些有用的核型信息，初步拟定如下几个方面进行核型的分析比较。 ①染色体数目；

②具有随体染色体的数目； ③每对染色体的相对长度值； ④染色体长度比；

⑤如果含有大小差别明显的染色体，可以分大、小群分别统计其数量和长度，以及各自所占染色体组全长的百分比。 2、染色体组型分析步骤 ①染色体数目确定；

②显微照相：检查摄影装置，让光路选择拉杆向外拉出一级；普通相机调准ASA胶片感光盘，并装入胶卷或数码相机先调到Bab照相模式；接通电源；选择自动暴光方式；画幅选择；屈光度调节；取景聚焦；选择滤光镜；将选取的5-10个染色体分散良好的中期细胞分别显微照相，没一个分裂细胞照1-3张，并同时将镜台测微尺在同样倍数下拍照。 ③冲洗放大或放大打印：普通相机为了增加反差，可以用D-19冲卷，按显微摄影技术显影、定影、冲洗、考片。放大前，应该先用镜台测微尺底片校正放大倍数。例如：镜台测微尺每一小格为1×10mm欲放大2000倍，1×10mm×2000=20mm，测微尺每一小格20mm，即为2000倍，或者将20mm长线表为10μm，如此类推计算出照片的准确扩大倍数。数码相机，将照片输入计算机，选定需要打印的照片，每张相纸打印4-6张照片。 ④剪贴或粘贴：用眼科剪刀，爰沿染色体边缘将每一条染色体剪下放在小培养皿内，数码照片采用复制粘贴方式，粘贴在同一条线上。

⑤染色体配对：首先目测配对，根据染色体的长短和形态特征，进行同源染色体配对。有条件的情况下，可以采用染色体组型自动分析系统完成染色体配对及测量工作。 ⑥染色体序排：按染色体序号排列方法将一个细胞内所有染色体进行排队，编号。染色体配对后核型图翻拍。

⑦染色体测量：按染色体核型分析方法，完成染色体数目、绝对长度、相对长度、臂比、染色体长度比、臂指数等各项测定工作。 ⑧列染色体相对长度、臂比及类型分析表 ⑨绘制核型模式图。

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