2008CHO细胞无血清结团灌流培养：

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（４）：５３～５８

檪檪殏

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檪檪殏

（广州铭康生物工程有限公司　广州　５１０７３０）

技术与方法

利用搅拌式生物反应器进行批次或批次—补料的规模化细胞培养，是当前生产基因工程药物的主要方式。随着工程化单克隆抗体的出现和应用的日益广泛，原来的生产工艺已成为阻碍产量迅猛增长的瓶

１］

颈［，改用连续灌流的培养方式已越来越受到重视。

因为它在节省设备投资和提高生产效率等方面有着明

２］显的优势［。为了方便地实现灌流培养中的细胞截

留，最常用的方法是采用微载体培养，并通过过滤或沉降的方法使细胞和培养基分离。但微载体本身价格昂贵，成本高，操作及处理复杂，为此，采用细胞的结团培

３，４］

。养已开始引起人们的兴趣［

如何使细胞迅速地、良好地结团，以及如何能长期截留细胞进行灌流培养是能否将结团培养工艺真正用于规模化生产的关键。本试验中，我们既利用了ＣＨＯ细胞在培养中能自然结团的能力，又设计了一套超

５］

声—沉降柱二合一的灌流系统，已申请发明专利［，它

不仅可以进一步促进细胞结团，而且能有效地截留细胞进行长期灌流培养，试验结果令人满意。

收稿日期：２００８０１０８　　修回日期：２００８０１１６通讯作者，电子信箱：ｙａｎｇｑｉｎ１６＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ

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中图分类号　Ｑ８１３．１

ＣＨＯ细胞无血清结团灌流培养：

超声沉降柱二合一灌流系统

李　智　肖成祖　杨　琴　黄小乐　梁倩茹　陈小飞　郑敦武　陈晓铭

摘要　利用ＣＨＯ细胞能在培养过程中自然结团的特性，采用超声—沉降柱二合一灌流系统能促进细胞结团和加强截留的特性，用无血清培养基连续灌流培养基因重组ＣＨＯ细胞ＭＫ３Ａ２株，分?泌表达ｒｈＴＮＫｔＰＡ获得了成功。培养周期为７７～１１０天，细胞结团率为９０％左右，直径在２８５～?

７

５７０ｍ之间，细胞截留率保持在９５％左右，成活率为８５％以上，细胞密度达到２×１０／ｍｌ左右，μ

ｒｈＴＮＫｔＰＡ生产率平均为８９ｍｇ／Ｌ／ｄ，最高时达２１６ｍｇ／Ｌ／ｄ。结果表明，使用该灌流系统进行细胞?结团培养可以取代微载体培养用于动物细胞制药的规模化生产。

关键词　结团培养　无血清培养基　ＣＨＯ细胞　ｒｈＴＮＫｔＰＡ　超声?沉降柱二合一灌流系统?

１　材料与方法

１．１　细胞株

用以生产重组人组织型纤溶酶原激活剂ＴＮＫ突变体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｔｉｓｓｕｅｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ?ＴＮＫｍｕｔａｎｔ，ｒｈＴＨＫｔＰＡ）的ＣＨＯ工程细胞ＭＫ３Ａ２由??

６］

本公司构建［，经亚克隆获得的稳定株，经过２个月的

驯化培养已能适应无血清悬浮培养，表达量为７００８

６ＩＵ／１０／ｄ，倍增时间约为３０～４０ｈ。

１．２　培养基

基础培养基为ＤＭＥＭ与Ｆ１２（１∶１）（Ｇｉｂｃｏ公司产品），通过补充部分氨基酸，如天冬氨酸、谷氨酰氨和苏氨酸等，再添加叶酸、柠檬酸铁和硫酸锌等（以上均为Ｓｉｇｍａ公司产品）构成无血清培养基。１．３　超声沉降柱二合一灌流系统

由荷兰Ａｐｐｌｉｋｏｎ公司的ＢｉｏＳｅｐ超声分离装置中的超声室及其控制系统，与本公司自制的重力沉降柱及

７］

结合在一起所组成。其控制系统［

如图１所示，超声室①为原来的ＢｉｏＳｅｐ超声细胞分离器的一部分，外面有外套使超声室降温，侧面有接

５４

中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＶｏｌ．２８Ｎｏ．４２００８

线与超声功率控制器②连接，用以控制超声波功率，顶部有抽液管与抽液蠕动泵④相连。沉降柱③由玻璃制１５０ｍ大小的作，当连续抽液一天两个反应器体积时，μ细胞团不会被抽出。顶部有小管用以固定在反应罐顶盖。侧面有接口可用软管与超声室下管连接。抽液管连接的蠕动泵由控制器⑤控制，可定时、定向地控制其

正转和反转的速度和时间。

１．５　细胞计数、细胞结团率、结团直径、细胞截留率和

成活率测定

细胞计数采用柠檬酸结晶紫法。细胞团结率＝

细胞总数（个／ｍｌ）－上清细胞数（个／ｍｌ）

×１００％

ｍｌ）细胞总数（个／细胞截留率＝

罐内细胞数（个／ｍｌ）－抽液中细胞数（个／ｍｌ）

×１００％

罐内细胞数（个／ｍｌ）　　结团直径通过显微镜中的目镜测微尺进行测量，图１　超声沉降柱灌流系统示意图Ｆｉｇ．１　ＴｈｅＳｃｈｅｍｅｏｆｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ?

ｓｅｄｉｍｅｎｔｉｏｎｃｏｌｏｍｎｃｏｍｂｉｎｅｄｐｅｒｆｕｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ

１：Ｒｅｓｏｎａｔｏｒｃｈａｍｂｅｒ；２：Ｂｉｏｓｅｐｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ；３：Ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ

ｃｏｌｕｍｎ；４：Ｈａｒｖｅｓｔｐｕｍｐ；５：Ｐｕｍｐｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ

１．４　结团培养方法

在方瓶和转瓶中先用加２％血清的培养基培养，使细胞贴壁生长，待细胞汇合成片后，改用无血清培养，经２～

３次换液后细胞即收束、集中，并开始成团脱离瓶壁。在搅拌瓶中培养直接采用无血清培养基培养，搅拌速度为７０ｒ／ｍｉｎ。瓶内细胞经２～３次离心、扩增后，多数细胞可出现较小的结团，此时即将它与方瓶、转瓶的结团细胞一起转入细胞培养生物反应器。　　在反应器中，开始进行无血清灌流培养。采用德国贝朗公司的细胞培养生物反应器（

ＢｉｏｓｔａｔＢ），工作体积５Ｌ，细胞接种量为６８万细胞／ｍｌ。培养条件控制在温度：３７℃，ｐＨ：７．２，溶氧：４０％，无泡通气，搅拌速度：从５０ｒ／ｍｉｎ逐渐增加至１２０ｒ／ｍｉｎ。灌流采用超声室?沉降柱二合一的灌流系统。根据每天葡萄糖的消耗量，灌流量从０

．１个培养体积／天逐渐增大至４个培养体积／天，超声波功率也随灌流量的增大从３Ｗ增加至１０Ｗ。

细胞成活率用台盼蓝排斥法。１．６　葡萄糖和产物活性测定

葡萄糖测定采用ＧＯＤ?ＰＡＰ法（试剂盒为北京百泰生化技术公司产品）。ｒｈＴＮＫ?ｔＰＡ活性测定采用本公司建立的气泡裂解法。

２　结　果

２．１　在二合一灌流系统中无血清连续灌流过程中的

细胞结团观察

在上罐初期，细胞结团很小，以３～５个细胞组成的细胞团为主，随着培养时间的延长和灌流速度的提高，细胞团不断增大、增多，培养到１５天左右，约有９０％的细胞都可形成结团（图２，３）。在整个表面通气的培养过程中细胞结团一般稳定在２６０～３８０μｍ。进入无泡通气培养过程，细胞的结团大小长时间稳定在２８５～５７０μｍ，最大的可达到１０４５μｍ。加大搅拌速度会促使大的细胞团散开，转变为小结团。结团培养的细胞平均活力在８５％以上，

后期结团增大对细胞活力无影响。

图２　采用二合一灌流系统进行结团培养中

细胞结团率变化

Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅａｇｇｒｅｇａｔｅｖａｒｉａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｓｄｕｒｉｎｇ

ｃｕｌｔｕｒｅｗｉｔｈｃｏｍｂｉｎｅｄｐｅｒｆｕｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ

２．２　超声?沉降柱二合一灌流系统对细胞的截留效果　　ＢｉｏＳｅｐ超声波细胞截留装置，按其原设计使用要求，

２００８，２８（４）

李　智等：ＣＨＯ细胞无血清结团灌流培养：超声

沉降柱二合一灌流系统

５５

清灌流培养下持续７７天（图５），ＣＨＯ细胞密度可达到

７

２×１０／ｍｌ以上，产物ｒｈＴＮＫｔＰＡ随细胞增长而增长，?

ｒｈＴＮＫｔＰＡ活性平均为３５１３７ＩＵ／ｍｌ，最高达５５２８９ＩＵ／?。ｒｈＴＮＫｔＰＡ生产率平均达８９．２ｍｇ／Ｌ／ｄ，最高达１７５ｍｌ?ｍｇ／Ｌ／ｄ，总产量达３４ｇ。

在这次试验中我们有意地观察了大泡通气对细胞

图３　ＣＨＯ?ＭＫ３Ａ２细胞结团图?

Ｆｉｇ．３　ＡｇｇｒｅｇａｔｅｐｈｏｔｏｓｏｆＣＨＯ?ＭＫ３Ａ２ｃｅｌｌｓ?生长和ｒｈＴＮＫｔＰＡ产量的影响，从图５中的第４４～４５?天和第６９～７１天可见，改用大泡通气后对细胞的生长Ｌｅｆｔ：５０ｄａｙｓ；Ｒｉｇｈｔ：８０ｄａｙｓ；ｅａｃｈｍｉｎｉｍａｌｓｃａｌｅｏｆ

ｔｈｅｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒｉｓ２０μ

ｍ细胞在超声室内结团后，由于蠕动泵的全速反流和细胞的外循环，截留的松散细胞小团会被打散。为此，我们取消了外循环，又改用我们自己设计的能定时、定向控制蠕动泵的控制器，这样就可使松散的小团缓缓地返回反应罐内而不被打散，并进一步增大、增实。一旦这些结团增大增实，由于我们在超声室下面加了重力沉降柱，就不再被抽入超声室，从而减轻了超声室的负载，维持了它高效的细胞截留效率。由图４可见，无论细胞密度从１．５×

１０６／ｍｌ到１２×１０６

／ｍｌ，还是灌流量从１．６Ｌ／ｄ增加到

２０Ｌ／ｄ，细胞的截流率基本都在９５％以上。此外，在培养

的７６天，罐内细胞密度１１７５×１０４／ｍｌ，灌流量是１５Ｌ／ｄ，抽液中的细胞密度是４

．０×１０５

／ｍｌ，截留率高达９７％。此时我们试着关掉超声波，结果抽液中的细胞密度为２

．２×１０６

／ｍｌ，截留率还保持在８０％。说明细胞大量结团后，单

用重力沉降柱就可取得较好的截留效果，也表明沉降柱

可以大大减轻超声室的截留负担。

图４　二合一灌流系统对细胞的截留率变化Ｆｉｇ．４　Ｔｈｅｖａｒｉａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｓｒｅｔｅｎｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｃｕｌｔｕｒｅ

ｗｉｔｈｃｏｍｂｉｎｅｄｐｅｒｆｕｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ

２．３　采用二合一灌流系统，用无血清培养基进行连续

培养的细胞和产物产量结果

现将二次结果列上，第一次采用结团试验，在无血

和ｒｈＴＮＫ?

ｔＰＡ

产量有着明显的不利影响。图５　ＣＨＯ?ＭＫ３?

Ａ２细胞在灌流培养下细胞和产物的增长

Ｆｉｇ．５　ＴｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆＣＨＯ?ＭＫ３?

Ａ２ｃｅｌｌｓａｎｄｉｔｓｐｒｏｄｕｃｔｄｕｒｉｎｇｐｅｒｆｕｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅ

第二次采用二合一系统进行结团灌流培养时，在前阶段我们使用了表面通气，将液面降至３．８～４Ｌ。到第４６天，由于ＤＯ值不断下降至１０％以下，于是我们又改回无泡通气，培养共持续１

１０天（图６），ＣＨＯ细胞密度同样可达到２×１０７

细胞／ｍｌ以上，ｒｈＴＮＫ?

ｔＰＡ活性平均为２２１７３Ｕ／ｍｌ，最高达４６２０７ＩＵ／ｍｌ。ｒｈＴＮＫ?ｔＰＡ生产率平均达８２．５ｍｇ／Ｌ／ｄ，最高达２１６．６ｍｇ／Ｌ／ｄ，总产量达４２克。

２．４　二合一系统与ｂｉｏｓｅｐ系统灌流及微载体培养效

果的比较

为了进一步验证二合一灌流系统的优越性，我们单独使用Ｂ

ｉｏＳｅｐ，用同样的细胞，同样的培养条件进行灌流试验。细胞接种量为１．０×１０４

／ｍｌ。培养温度、

ｐＨ、溶氧和搅拌速度同前，无泡通气。按说明书要求，

外循环泵的速度为２０Ｌ／ｄ，收获泵为低速抽液和全速反冲（

８０ｍｌ／ｍｉｎ，一次持续３ｓ）。随着灌流量逐渐提高，抽液速度逐步从２．５ｍｌ／ｍｉｎ提高到８ｍｌ／ｍｉｎ，反冲频率逐渐从１０ｍｉｎ一次提高到２ｍｉｎ一次，超声波功率从３Ｗ增加至１０Ｗ。

结果可见（图７），其结团率明显低于二合一系统，

５６

中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＶｏｌ．２８Ｎｏ．４２００

８

图６　ＣＨＯ?ＭＫ３Ａ２细胞在表面通气和无泡通气灌流?

培养时细胞和产物的增长

Ｆｉｇ．６　ＴｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆＣＨＯ?ＭＫ３Ａ２ｃｅｌｌｓａｎｄｉｔｓ?ｐｒｏｄｕｃｔｄｕｒｉｎｇｐｅｒｆｕｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｗｉｔｈｓｕｒｆａｃｅ

ａｅｒａｔｉｏｎｏｒｂｕｂｂｌｅｆｒｅｅａｅｒａｔｉｏｎ?

Ａ：Ｌｅｖｅｌｃｏｎｔｒｏｌｆａｉｌｉｎｇ；Ｂ：Ｗｉｔｈｄｒａｗ７５％ｏｆｃｕｌｔｕｒｅ；Ｃ：Ｗｉｔｈｄｒａｗ２５％ｏｆｃｕｌｔｕｒｅ；Ｄ：Ｂｕｂｂｌｅｆｒｅｅａｅｒａｔｉｏｎ?

图７　使用标准配置ＢｉｏＳｅｐ时的细胞结团率和截留率Ｆｉｇ．７　Ｔｈｅｃｅｌｌｓａｇｇｒｅｇａｔｅｒａｔｅａｎｄｒｅｔｅｎｔｉｏｎｒａｔｅｏｆ

ｓｔａｎｄａｒｄＢｉｏＳｅｐｓｙｓｔｅ

ｍ

仅仅达到７０％左右，表明强烈反吹不利于细胞结团。而且尽管灌流量都在设计能力内，即不超过１０Ｌ／ｄ，但截留率仍较二合一的低，都在９０％左右。另外更重要．０的是可以看到，用该系统，虽然细胞密度也可达到１

７７×１０／ｍｌ甚至２．０×１０／ｍｌ（图８），但细胞在强烈反吹

图８　使用标准配置ＢｉｏＳｅｐ灌流培养时的

细胞和产物增长

Ｆｉｇ．８　ＴｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｃｅｌｌｓａｎｄｉｔｓｐｒｏｄｕｃｔｄｕｒｉｎｇｐｅｒｆｕｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｗｉｔｈｓｔａｎｄａｒｄＢｉｏＳｅｐｓｙｓｔｅｍ

和不断外循环中流动，细胞的表达水平明显受到影响，

６平均为２７５８ＩＵ／１０／ｄ，罐内平均活性为１２４１２ＩＵ／ｍｌ，

平均ｒｈＴＮＫｔＰＡ生产率仅为４２．７ｍｇ／Ｌ／ｄ，与二合一灌?流系统相比明显较差（表１）

。

表１　三种连续灌流培养对细胞和产物增长的比较

Ｔａｂｌｅ１　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｃｅｌｌｓａｎｄｉｔｓｐｒｏｄｕｃｔｄｕｒｉｎｇｐｅｒｆｕｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅ

Ｗｉｔｈｔｈｒｅｅｋｉｎｄｓｏｆｐｅｒｆｕｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ

Ｃｕｌｔｕｒｅｔｙｐｅ

ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ

ｓｙｓｔｅｍ

ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ

ｖｏｌｕｍｅ（ｍａｘ）Ｌ／ｄ

ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ

ｃｏｍｂｉｎｅｄＢｉｏＳｅｐ

２１９１４．２

ｃｅｌｌ

ｄｅｎｓｉｔｙ（ｍａｘ）

４

／ｍｌ１０２９１０

ｒｈＴＮＫ?

ｔＰＡ（ａｖｅｒａｇｅ）ｍｇ／Ｌ／ｄ８５．９４２．７４４

ｒｈＴＮＫ?

ｔＰＡ（ｍａｘ）ｍｇ／Ｌ／ｄ２１６．６７６．１８１．４

Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ

（ｔｏｔａｌ）

ｍｇ４０２６６５７２９２２４３９

Ａｃｔｉｖｉｔｙ

（ａｖｅｒａｇｅ）ＩＵ／ｍｌ２８３５２１２４１２１６３６５

Ａｃｔｉｖｉｔｙ

（ｍａｘ）ＩＵ／ｍｌ５５２８９２５２５７２６７４２

ＰｅｒｉｏｄＤａｙｓ７７１１０?３２９５

１９６８１１３８

ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｅｒｓｐｉｎｆｉｌｔｅｒ

在此同时，我们用同样的细胞，在同样的培养基和控制条件下，用ｃｙｔｏｐｏｒｅ微载体和旋转滤器灌流系统进行灌流培养，持续９５天，其结果见表１。用二合一灌流系统培养的结果与之相比较，也可见各项指标均优于微载体培养。

培养，有的细胞已培养至６０Ｌ的规模，但由于当时没有

６

良好理想的灌流系统，细胞密度仅在１～２×１０／ｍｌ水９］１０］１１］平。以后Ｌｉｔｗｉｎ等［Ｍｏｒｅｉｒａ等［和Ｙａｍａｍｏｔｏ等［也

都分别用Ｖｅｒｏ细胞、ＢＨＫ细胞和重组的ＣＨＯ工程细胞进行过结团培养试验，由于同样的原因，细胞密度也

６４］

２×１０／ｍｌ左右。直至２００６年我国Ｌｉｕ等［仅为１～

３　讨　论

８］

１９８０年Ｔｏｌｂｅｒｔ等［首先报告了多种细胞的结团

用ＨＥＫ２９３细胞的自然结团培养制备腺病毒时，采用了旋转滤器进行灌流培养，连续１７天，细胞密度达到

２００８，２８（４）

李　智等：ＣＨＯ细胞无血清结团灌流培养：超声沉降柱二合一灌流系统

５７

７了１．２×１０／ｍｌ，才获得了较好的结果。结团培养工艺，已完全可以取代微载体真正用于基因工程药物的规模化生产中了。

结团培养工艺的优点至少有以下三个方面：（１）它保留了用微载体培养的优点，便于细胞和培养基分离２）节省进行灌流培养，提高细胞密度和目标物产量；（３）由于它是三维了微载体的成本和再生处理的麻烦；（培养，有利于细胞生长，更好地发挥细胞的生理功

１２］能［。但是要使结团培养工艺真正能用于生产实践

参考文献

　［１］ＧａｒｂｅｒＫ．Ｂｉｏｔｅｃｈｉｎｄｕｓｔｒｙｆａｃｅｓｎｅｗｂｏｔｔｌｅｎｅｃｋ．Ｎａｔｕｒｅ

Ｂｉｏｔｅｃｈ，２００１，１９：１８４～１８５

　［２］ＡｙｃａｒｄｉＥ．Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｈｕｍａｎｒａｂｉｅｓｖａｃｃｉｎｅｓａｔｌｏｗｃｏｓｔ．

ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇＮｅｗｓ，２００２，２２（８）：５２

３］ＲｙｕＪＨ，ＫｉｍＭＳ，ＬｅｅＧＭｅｔａｌ．Ｔｈｅｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆ　［

ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙｐｏｌｙｍｅｒｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓｉｎｃｅｌｌ中，关键要解决好结团的方法和结团培养的灌流系统问题。为了促进细胞结团，人们摸索了多种方法，包括：（１）加入一些小颗粒诱导细胞结团［３，１２］

，（２）加入某

些生物或化学物质促进细胞结团［１３～１７］

；（３）利用一些

特殊培养设备促使细胞结团

［１８～２０］

。在灌流系统中细胞

截留设备方面的摸索也较多，包括过滤、重力沉降、离

心、超声和电泳等［

２１］

。但所有这些方法均存在一些不足，如所采用的添加物价格昂贵，如制备的纳米颗

粒［３］

；有的添加物会影响产品的纯化，如植物血凝素［

１５］、刀豆球蛋白Ａ［１４］

等；有的添加物还会影响产量，如ＥｕｇｒａｇｉｔＳ１００［１６］

；美国航天部的微重力细胞培养设备［

１９］

虽然结团很好，但目前规模还很小，要放大还存在不少问题等，上述使得结团培养工艺至今至今未能得以应用。

在上述结团和灌流方法、设备的研究中，超声分离

装置的研究［２０］

引起我们很大的兴趣。它依靠超声波的

空穴原理，细胞不仅可被截留，而且还可形成小团，对细胞的成活也无影响。但正如前面所述，Ａｐｐｌｉｋｏｎ公司生产的ＢｉｏＳｅｐ超声分离装置，按本来的设计和使用说明，由于蠕动泵的全速反流和细胞的外循环，截留的松散的细胞小团会被打散。另外，当细胞密度增大，灌流量提高，其截留率还会下降，因为超声室内细胞量超过了它能截留的能力。特别是由于强烈反吹和不断地外循环，还会影响细胞的表达水平。为此，我们将原来用于重力沉降的专利与ＢｉｏＳｅｐ结合，发明了一种崭新的超声?沉降二合一灌流系统。由于控制的蠕动泵反转速度很慢，细胞团反流时不会被打散，加上沉降柱后，解决了细胞密度提高后超声室不堪负荷使截留率的下降的问题，更有利的是，一旦反应罐内的细胞都已结团，并有一定大小后，我们可以关闭超声波，单独使用沉降柱即可顺利地进行灌流培养。总之，试验的结果证明，这样的结合是合适的，截留率不受灌流量和细胞密度的影响，基本保持在９５％左右，培养周期可长达百天以上，细胞密度可达２×１０７

／ｍｌ，ｒｈＴＮＫ?ｔＰＡ生产率平均为８９ｍｇ／Ｌ·ｄ，最高达２１６ｍｇ／Ｌ·ｄ。表明采用这样的

ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００５，２６：２１７３～２１８１

　［４］ＬｉｕＸＭ，ＬｉｕＨ，ＷｕＢＣｅｔａｌ．Ｓｕｓｐｅｎｄｅｄａｇｇｒｅｇａｔｅｓａｓａｎ

ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｍｏｄｅｔｏｈｉｇｈ?ｄｅｎｓｉｔｙｐｅｒｆｕｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｏｆＨＥＫ２９３ｃｅｌｌｓｉｎａｓｔｉｒｒｅｄｔａｎｋｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ．ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００６，７２：１１４４～１１５１

　［５］肖成祖，杨琴，李智，等．一种用于动物细胞无血清结团灌流

培养的工艺．中国，申请号２００７１００２８８５４．０，２００７

ＸｉａｏＣＺ，ＹａｎｇＱ，ＬｉＺ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｓｅｒｕｍ?ｆｒｅｅａｇｇｒｅｇａｔｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｆｏｒａｎｉｍａｌｃｅｌｌｓ．Ｃｈｉｎａ，ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｎｕｍｂｅｒ２００７１００２８８５４．０，２００７

　［６］刘龙斌，杨琴，王敏荣，等．生产重组人组织型纤溶酶原激活

剂ＴＮＫ突变体的工艺方法．中国，ＺＬ０２１３４４０４．３，２００５ＬｉｕＬＢ，ＹａｎｇＱ，ＷａｎｇＭＲ．ｅｔａｌ．Ｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｔｉｓｓｕｅ?ｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒＴＮＫｍｕｔａｎｔ．Ｃｈｉｎａ

，ＺＬ０２１３４４０４．３，２００５　［７］肖成祖，周鹤山，黄子才．细胞微载体灌流培养系统中的自

控装置．中国，ＺＬ９１２０８８９３．１，１９９４

ＸｉａｏＣＺ，ＺｈｏｕＨＳ，ＨｕａｎｇＺＣ．Ａｕｔｏ?ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒｆｏｒｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｐｅｒｆｕｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｏｆｃｅｌｌｓ．Ｃｈｉｎａ，ＺＬ９１２０８８９３．１，１９９４

　［８］ＴｏｌｂｅｒｔＷＲ，ＨｉｔｔＭＭ，ＦｅｄｅｒＪ．Ｃｅｌｌａｇｇｒｅｇａｔｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ

ｃｕｌｔｕｒｅｆｏｒｌａｒｇｅ?ｓｃａｌｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．ＩｎＶｉｔｒｅ，１９８０，１６（６）：４８６～４９０

　［９］ＬｉｔｗｉｎＪ．ＴｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆＶｅｒｏｃｅｌｌｓｉｎｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎａｓｃｅｌｌ?

ａｇｇｒｅｇａｔｅｓｉｎｓｅｒｕｍ?ｆｒｅｅｍｅｄｉａ．Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２，１０：１６９～１７４

　［１０］ＭｏｒｅｉｒａＪＬ，ＡｌｖｅｓＰＭ，ＡｕｎｉｎＳ，ｅｔａｌ．Ｃｈａｎｇｅｓｉｎａｎｉｍａｌｃｅｌｌ

ｎａｔｕｒａｌａｇｇｒｅｇａｔｅｓｉｎｓｕｓｐｅｎｄｅｄｂａｔｃｈｃｕｌｔｕｒｅｓ．ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９４，４１：２０３～２０９

　［１１］ＹａｍａｍｏｔｏＳ，ＭａｔｓｕｄａＨ，ＴａｋａｈａｓｈｉＴ，ｅｔａｌ．Ａｇｇｒｅｇａｔｅ

ｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｒＣＨＯｃｅｌｌｓａｎｄｉｔｓｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅｉｎｒｅｐｅａｔｅｄｂａｔｃｈｃｕｌｔｕｒｅｉｎｔｈｅａｂｓｅｎｃｅｏｆａｄｈｅｓｉｏｎｍａｔｅｒｉａｌｓ．ＪＢｉｏｓｃｉＢｉｏｅｎｇ，２０００，８９（６）：５３４～５３８

　［１２］ＰｅｓｈｗａＭＶ，ＫｙｕｎｇＹ?

Ｓ，ＭｃＣｌｕｒｅＤＢ，ｅｔａｌ．Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓａｓａｇｇｒｅｇａｔｅｓｉｎｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ：Ｅｆｆｅｃｔｏｆｃａｌｃｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｓｐａｔｉａｌｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｖｉａｂｉｌｉｔｙ．Ｂｉｏｔｅｃｈ

５８

Ｂｉｏｅｎｇ，１９９３，４１（２）：１７９～１８７

中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＶｏｌ．２８Ｎｏ．４２００８

１８］ＲｏｔｈｅｒｍｅｌＡ，ＢｉｅｄｅｒｍａｎｎＴ，ＷｅｉｇｅｌＷ，ｅｔａｌ．Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｄｅｓｉｇｎ　［

ｏｆｔｈｒｅｅｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｒｅｔｉｎａｌｉｋｅｔｉｓｓｕｅｆｒｏｍｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄｏｆｔｈｅ??ｍａｍｍａｌｉａｎｒｅｔｉｎａｂｙｒｏｔａｔｉｏｎｍｅｄｉａｔｅｄｃｅｌｌａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ．Ｔｉｓｓｕｅ?，２００５，１１（１１／１２）：１７４９～１７５６Ｅｎｇ

　［１９］ＤｕｋｅＪ，ＤａｎｎｅＥ，ＡｒｉｚｐｅＪｅｔａｌ．Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎａｇｇｒｅｇａｔｅｓ

ｏｆｅｍｂｒｙｏｎｉｃｌｉｍｂｃｅｌｌｓｇｒｏｗｎｉｎａｒｏｔａｔｉｎｇｗａｌｌｖｅｓｓｅｌ．ＡｄｖＳｐａｃｅＲｅｓ，１９９６，１７（６／７）：２８９～２９３

　［２０］ＰｕｉＰＷＳ，ＴｒａｍｐｌｅｒＦ，ＳｏｎｄｅｒｈｏｆｆＳＡ，ｅｔａｌ．Ｂａｔｃｈａｎｄ

ｓｅｍｉｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎａｎｄｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｈｙｂｒｉｄｏｍａｃｅｌｌｓｂｙａｃｏｕｓｔｉｃｒｅｓｏｎａｎｃｅｆｉｅｌｄｓ．ＢｉｏｔｅｃｈＰｒｏｇ，１９９５，１１（２）：１４６～１５２

　［２１］ＶｏｉｓａｒｄＤ，ＭｅｕｗｌｙＦ，ＲｕｆｆｉｅｕｘＰＡ，ｅｔａｌ．Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｃｅｌｌ

ｒｅｔｅｎｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｆｏｒｌａｒｇｅｓｃａｌｅｈｉｇｈ?ｄｅｎｓｉｔｙｐｅｒｆｕｓｉｏｎ?，２００３，ｃｕｌｔｕｒｅｏｆｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓ．ＢｉｏｔｅｃｈＢｉｏｅｎｇ８２（７）：７５１～７６５

　［１３］ＧｏｅｔｇｈｅｂｅｕｒＳ，ＨｕＷ?Ｓ．Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｏｆａｎｃｈｏｒａｇｅｄｅｐｅｎｄｅｎｔ?

ａｎｉｍａｌｃｅｌｌｓｉｎｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｉｎｄｕｃｅｄａｇｇｒｅｇａｔｅｃｕｌｔｕｒｅ．Ａｐｐｌ?，１９９１，３４：７３５～７４１ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ

　［１４］ＧｅｓｔｗｉｃｋｉＪＥ，ＳｔｒｏｎｇＬＥ，ＣａｉｒｏＣ，ｅｔａｌ．Ｃｅｌｌａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎｂｙ

，２００２，９：１６３～１６９ｓｃａｆｆｏｌｄｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｃｌｕｓｔｅｒｓ．ＣｈｅｍＢｉｏｌ

　［１５］ＴａｋａｍａｔｓｕＨ，ＫａｗａｊｉｒｉＨ，ＴａｋａｈａｓｈｉＹ，ｅｔａｌ．Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ

ａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ?Ｌ?ａｇｇｒｅｇａｔｅｄｈｙｂｒｉｄｏｍａｃｅｌｌｓ．ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ，１９９９，２２３：１６５～１７０

　［１６］ＹａｍａｄａＫ，ＫａｍｉｈｉｒａＭ，ＩｉｊｉｍａＳ．Ｅｎｈａｎｃｅｄｃｅｌｌａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ

ａｎｄｌｉｖｅｒｆｕｎｃｔｉｏｎｕｓｉｎｇｐｏｌｙｍｅｒｓｍｏｄｉｆｉｅｄｗｉｔｈｃｅｌｌｓｐｅｃｉｆｉｃ?ｌｉｇａｎｄｉｎｐｒｉｍａｒｙｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｃｕｌｔｕｒｅｓ．ＪＢｉｏｓｃｉＢｉｏｅｎｇ，１９９９，８８（５）：５５７～５６２

１７］ＤａｉＷ，ＳａｌｔｚｍａｎＭ．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎｂｙｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｗｉｔｈ　［

（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）ａｎｄＲＧＤ．ＢｉｏｔｅｃｈＢｉｏｅｎｇ，ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓｏｆｐｏｌｙ１９９６，５０（４）：３４９～３５６

Ｓｅｒｕｍ?ｆｒｅｅＡｇｇｒｅｇａｔｅＰｅｒｆｕｓｉｏｎＣｕｌｔｕｒｅｏｆＣＨＯＣｅｌｌｓ：

ａｎＵｌｔｒａｓｏｎｉｃａｎｄＳｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎＣｏｌｕｍｎＣｏｍｂｉｎｅｄＰｅｒｆｕｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍ

ＬＩＺｈｉ　ＸｉａｏＣｈｅｎｇｚｕ　ＹＡＮＧＱｉｎ　ＨＵＡＮＧＸｉａｏｌｅ　ＬＩＡＮＧＱｉａｎｒｕ　ＣＨＥＮＸｉａｏｆｅｉ???

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（ＧｕａｎｇｚｈｏｕＲｅｃｏｍｇｅｎＢｉｏｔｅｃｈＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１０７３２，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ　ＵｓｉｎｇｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｏｆｎａｔｕｒａｌａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎｏｆＣＨＯｃｅｌｌｓ，ａｎｄａｎｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｎｄｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｌｕｍｎｃｏｍｂｉｎｅｄｐｅｒｆｕｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｔｏｐｒｏｍｏｔｅｃｅｌｌｓａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎａｎｄｒｅｔｅｎｔｉｏｎｉｎｔｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＣＨＯｃｅｌｌｓｔｒａｉｎＭＫ３Ａ２ｗａｓｃｕｌｔｕｒｅｄ，ｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｓｅｃｒｅｔｅｒｈＴＮＫｔＰＡ，ｂｙａｓｅｒｕｍｆｒｅｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅ???ｃｕｌｔｕｒｅｐｅｒｉｏｄｓｉｎｔｈｉｓｔｗｏｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｗｅｒｅａｓｌｏｎｇａｓ７７ａｎｄ１１０ｄａｙｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｃｅｌｌｓｄｅｎｓｉｔｙｒｅａｃｈｅｄ２

７

×１０ｃｅｌｌｓ／ｍｌ．ＴｈｅａｖｅｒａｇｅｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｏｆｒｈＴＮＫｔＰＡｗａｓ８９ｍｇ／Ｌ·ｄ，ａｎｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｏｎｅｗａｓ?

２１６ｍｇ／Ｌ·ｄ．Ｔｈｅｃｅｌｌｓａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎｒａｔｅｗａｓａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ９０％，ａｎｄｔｈｅｄｉａｍｅｔｅｒｓｏｆｍｏｓｔｏｆｔｈｅｍｗｅｒｅ２８５～５７０ｍ．Ｄｕｒｉｎｇｔｈｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｔｈｅｃｅｌｌｓｒｅｔｅｎｔｉｏｎｒａｔｅａｌｍｏｓｔｋｅｐｔｉｎ９５％ａｎｄｔｈｅｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｃｅｌｌｓｗａｓμｍｏｒｅｔｈａｎ８５％．Ｔｈｕｓ，ｉｔｍｅａｎｓｔｈａｔａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｗｉｔｈｓｕｃｈｐｅｒｆｕｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄｔｏｓｃａｌｅｕｐｐｒｏｄｕｃｅｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓｉｎｓｔｅａｄｏｆｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｃｕｌｔｕｒｅｓｙｓｔｅｍ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅ　Ｓｅｒｕｍ?ｆｒｅｅｍｅｄｉａ　ＣＨＯｃｅｌｌｓ　ＴＮＫ?ｔＰＡ　Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｎｄｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｌｕｍｎｃｏｍｂｉｎｅｄｐｅｒｆｕｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ

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