cRNA

cRNA间接标记荧光法

RNA纯化（MN公司Nucleospin RNA Clean-up）

（1） 加水至100uL（<100ug）

（2） 等量混合RA1与无水乙醇（300uL＋300uL/每管）

（3） 每管加入600uL RA1与无水乙醇的混合物，至700uL，混合均匀 （4） 转移到柱子，静置1 min （5） 10000rpm 离心 1 min

（6） 将柱子转移到新2ml 管，加RA3 700uL，10000rpm 离心 1 min （7） 弃管内液，柱中加350uL RA3，10000rpm 离心 1 min （8） 弃管内液，10000rpm 离心 2 min甩干

（9） 柱子转移到新管，打开放置2－3 min，将乙醇挥发干净 （10） 加65 预热水30uL，放置1 min，10000rpm 离心1min （11） 重复（10），增加回收率 （12） 取2uL，稀释50倍，测浓度。

DNA纯化（MN公司的Nucleospin Extract Ⅱ）

（1） 加2倍体积的NT液 （2） 转入柱子中，静置1min （3） 10000rpm离心1min

（4） 加600uL NT3，10000rpm离心1min （5） 离心2min 甩干

（6） 加65－70预热水30uL，10000rpm离心1min （7） 重复（6），增加回收率

（8） 吸取2uL，稀释50倍，测浓度。

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1. 第一链cDNA 合成

具体方法参见：大连宝生物工程有限公司的cDNA Synthesis Kit 在0.2ml EP离心管中制备以下体系，总体积20μL； 1st cDNA Synthesis Reaction Components total RNA T7-Oligo(dT)15（1μg/μL） Spike RNA 补充H2O至13μL

65℃ 5min变性，立即置于冰上； 5×1st strand buffer dNTP Mix (10mM each) RNasin (20u/μL) M-MLV (200u/μL) 总体积

4μL 1μL 1μL 1μL 20μL

4μL 1μL 1μL 1μL 20μL

Control Sample 5μg 2μL 1μL（X体系）

Test Sample 5μg 2μL 1μL（Y体系）

吹打混匀，瞬时离心；室温放置10min；42℃ 反应1h。冰浴2min。

2. 第二链cDNA合成

具体方法参见：大连宝生物工程有限公司的cDNA Synthesis Kit a. 在上述反应管中再加入以下试剂，总体积146μL； 2nd cDNA Synthesis Reaction Components 1st cDNA Synthesis Reaction System 5×2nd Synthesis buffer dNTP Mix RNase-free H2O

E.coli DNA Polymerase I（20u/μL）

E.coli RNase H/E.coli DNA Ligase Mixture 总体积

Control Sample 20μL 30μL 3μL 89μL 2μL 2μL 146μL

Test Sample 20μL 30μL 3μL 89μL 2μL 2μL 146μL

吹打混匀，瞬时离心；16℃ 反应2h；70℃加热10min； T4 DNA Polymerase（1u/μL）

吹打混匀，瞬时离心，37℃ 反应10min；

加入15μL的0.25M EDTA和15μL的10％SDS溶液，终止反应。

b. 用MN公司的Nucleospin Extract Ⅱ纯化柱过柱纯化；洗脱体积约为60μL。 c. 样品无需测OD值，取1/2的量进行下一步反应，其余-20℃保存。

4μL

4μL

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3. 体外转录合成cRNA

具体方法参见：Promega公司的T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System a. 于0.2ml EP离心管中制备如下体系，总体积20μL； T7 Reaction Components 2nd cDNA template RiboMAXTM Express T7 2×Buffer T7 Express Enzyme Mix Nuclease-Free Water Final volume

Control Sample Test Sample 1~8μL (取1/2的2nd cDNA) 1~8μL (取1/2的2nd cDNA) 10μL 2μL 0~7μL 20μL

10μL 2μL 0~7μL 20μL

吹打混匀，瞬时离心；37℃反应3h。

b. 用MN公司Nucleospin RNA Clean-up纯化柱过柱纯化，洗脱体积约为60μL。

c. 取纯化后产物直接测OD260、OD280，并计算转录产物量，产物量应>6ug，较珍贵的样品4ug也可以，太低则有偏好性。

4. cRNA产物反转录

具体方法可参见Invitrogen 公司的M-MLV Reverse Transcriptase kit a. 于0.2ml EP离心管中制备如下体系，总体积20μL； Reverse Transcriptase Reaction Components cRNA random primer（1μg/μL） 65℃ 5min变性，立即置于冰上； 5×buffer (M-MLV) 0.1M DTT dNTP(10mM each) M-MLV(200u/μL) 总体积

4μL 2μL 1μL 1.5 μL 20μL

4μL 2μL 1μL 1.5 μL 20μL

Control Sample 2ug 2μL

Test Sample 2ug 2μL

吹打混匀，瞬时离心；25℃ 10min；42℃ 1h（37度1.5h）；70℃ 15min终止反应。可以加入碱裂解液。

b. 用MN公司的Nucleospin Extract Ⅱ纯化柱过柱纯化。洗脱体积约为60μL。

c. 取纯化后产物直接测OD260、OD280，并计算产物量。产物量应为0.7ug－1.5ug，二者相差不超过50％。

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5. KLENOW荧光标记

具体方法可参见：用宝生物工程有限公司的Klenow Fragment a. 于0.2ml EP离心管中制备如下体系，总体积25μL； Reverse Transcriptase Reaction Components cRNA反转录产物 random primer（1μg/μL） 95℃ 3min变性，冰浴5min； 10 ×Klenow buffer

dNTP(2.4mM dA/G/TTP：1.2mM dCTP ) Cy3/Cy5 （1mM） Klenow Fragment 4u/μL 总体积

2.5μL 1.25μL 1μL 1μL 25μL

2.5μL 1.25μL 1μL 1μL 25μL

Control Sample 浓缩至17.25μL 2μL

Test Sample 浓缩至17.25μL 2μL

吹打混匀，瞬时离心；37℃温育1h。65℃ 5min终止反应。

b. 用MN公司的Nucleospin Extract Ⅱ纯化柱过柱纯化。洗脱体积约为60μL。

c. 荧光定量：测OD260、OD280、OD550和OD650。Cy3在OD550有光吸收，Cy5在OD650有光吸收。

Cy3 消光系数（ex550）＝150，000 MCy5 消光系数（ex650）＝250，000 M

计算Cy3、Cy5的掺入量：

OD 550 × 总探针体积（μL）/0.15＝total pmol of incorporated cy3 OD 650 × 总探针体积（μL）/0.25＝total pmol of incorporated cy5

掺入量应该在100－200pmol之间，80也可以。过低则难以取得较好效果。 c. 将纯化过并已定量的标记样品，放在真空旋转浓缩仪中避光抽干，用于杂交。

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6．芯片杂交前预处理

a. 将芯片点有DNA 的一面在60℃水浴锅上水合10S，芯片距水面距离为2-3cm，在空气中室温自

然干燥，再进行一次水合。

b. 将点有DNA样品的一面朝上，放在紫外交联仪中250mJ 交联。 c. 将芯片放在42℃预热 0.5％SDS清洗10分钟，水平摇床80rpm晃动。

d. 将芯片放在42℃预热蒸馏水中清洗4－5分钟，水平摇床80rpm晃动。 e. 将芯片放在乙醇中清洗2－3分钟，水平摇床80rpm晃动。

f. 把芯片放在50ml 锥形离心管中，2000rpm/min 离心1 分钟，以去除芯片表面的液体，此时的芯片即可用于杂交。

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先预扫一遍，得到一个扫描区域，以便杂交完成后可以直接扫描；同时还需观察片子是否有问题。点样液中掺有cy3，可以在清洗之前看到。清洗之后都会被洗掉，但仍然可以看到几个亮点，这几个亮点是标定了cy3的，可以说明芯片交联没问题。

7. 芯片杂交

a．按下表配制杂交液 Oligo芯片杂交体系 杂交液成分 3×SSC，0.2% SDS，25％Formamide，5×Denhart’s ddH2O Formamide 3.0μL

20×SSC 1.8μL

50×Denhart’s 1.2μL

1％SDS 2.4μL

12μL体系（7×7mm） 3.6μL

Oligo芯片杂交体系 杂交液成分 3×SSC，0.2% SDS，25％Formamide，5×Denhart’s ddH2O Formamide 20μL

20×SSC 12μL

50×Denhart’s 8.0μL

10％SDS 1.6μL

80μL体系（24×60mm） 38.4μL

cDNA芯片杂交体系 杂交液成分 1×Hybridization buffer，50％ Formamide ddH2O Formamide 6μL

4×Hybridization buffer 3μL

12μL体系（7×7mm） 3μL

cDNA芯片杂交体系 杂交液成分 1×Hybridization buffer，50％ Formamide ddH2O Formamide 40μL

4×Hybridization buffer 20μL

80μL体系（24×60mm） 20μL

95度3min变性，冰上冷却2min，暂放在室温，注意观察是否SDS发生沉淀，如果沉淀，使之

溶解。 b. 芯片杂交过程

（1）全基因组芯片杂交操作过程：

将芯片纵向放在实验台上，将杂交液轻轻点在芯片中央。将盖片两侧涂有隔片的一面向下盖在杂交液上，确保杂交液覆盖全部点阵，并避免气泡产生。将有盖玻片的一面向上，快速把芯片放入凹槽内预先加入150μL蒸馏水的杂交盒内，盖紧杂交盒盖，放入42℃水浴中，选择适当摇速，杂交12～16小时。

（2）围栏芯片杂交操作过程： 贴围栏：

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将围栏不干胶面贴纸揭掉，用镊子夹住围栏放在盛放围栏的模具中，有粘性的一面朝上。将芯片点有样品的一面向下,前端顶在模具的内侧，手持芯片Barcode一端缓慢往下压，使芯片与围栏贴紧。 注杂交液：

把贴好围栏的芯片放入杂交盒内,点有样品的一面朝上。将带有凸块的盖玻片卡放在芯片的黑色围栏上，注意有凸块的一面对着芯片；然后从盖玻片的小孔缓慢注入12μL的杂交液后，杂交液会凭借液体表面张力在盖玻片下面的凸面和芯片之间形成一道液膜。不要震动盖玻片或芯片以避免破坏液膜。盖紧杂交盒盖。放入42℃水浴中，静置，杂交12～16小时。

8. 芯片杂交后清洗

a. 将洗液Ⅰ、Ⅱ放在42℃水浴锅中预热。

b. 杂交结束后，快速将盖玻片在洗液Ⅰ中去掉，将芯片转移到清洗盒中（盛放洗液），杂交面朝上，放在水平摇床上缓慢清洗。清洗步骤如下：

洗液I 2 × SSC，0.2% SDS 42℃ 4min 洗液II 0.2 × SSC 42℃ 4min

d. 芯片清洗后，放在芯片盒或者50ml 锥形离心管中，1000rpm离心1分钟，除去玻片表面的

液体，此时的芯片可以进行扫描。

校准信号：

如果是不同处理，整体信号值，大部分点黄色 看家基因的位置

外标，平衡，解决问题，样品标记

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