植物组织培养考试重点

第一章

1植物离体培养：通过无菌操作，把植物细胞或其他类型的外植体，接种于人工配置的培养基上，给予人工控制的环境条件，使培养或操作对象表现生长发育等生命活动。 2细胞全能型：细胞具有该有机体的全部遗传信息，并具有形成有机体所有细胞类型的能力。 3园艺植物生物技术的应用领域一在细胞工程的应用；1良种繁育，使繁殖系数大，周年生产，繁殖速度快，苗木整齐一致。2离体种质保存，克服常规保存方法占用大量土地或消耗大量人力物力等缺点，并方便种质资源的地区和国际交换，避免病虫的人为传播。3细胞工程育种，培育园艺新品种，克服远缘杂交育种障碍。4有用物质的生产，大规模的细胞发酵罐培养生产药物，食品，调料香精等日用化工品。二基因工程运用：作为园艺作物改良的有效手段之一。三：分子标记运用，加快育种速度，降低选育种的成本，有效提高品种改良的成效。四：在植物学基础研究上的应用：进行遗传多样性的分析，系谱分析，基因表达及调控的研究等。

4细胞脱分化：指外植体中已分化的细胞，在切割损伤和培养物内外因素作用下，逐渐丧失其原有的分化了的结构和功能，合成代谢变得旺盛，细胞壁由厚变薄，细胞内部结构发生变化，细胞高度液泡化，回复到分生组织状态，形成无组织的细胞团或愈伤组织的过程。 5器官分化：指培养条件下的组织或细胞团分化形成不定根，不定芽等器官的过程。 6胚胎发生：指从合子到成熟胚的发生发育过程，所形成的的胚称为合子胚。

7.离体胚胎发生和器官发生有何异同：自然条件下的器官分化是受植物体本身的自主调节控制，而在离体培养条件下，器官分化则是在人工辅助条件下完成的，有3个生长阶段，第一，外植体经过诱导形成愈伤组织。第二，形成生长中心（也成为拟分生组织）。第三，器官原基及器官形成、体细胞胚是离体培养的产物，体细胞胚起源于非合子细胞，体细胞经历了胚胎发育过程，与器官发生形成个体的途径不同。

第二章

外植体：用于接种培养的各种离体的植物材料，包括胚胎材料，各种器官，组织，细胞，原生质体等。

1.外植体的类型 茎尖（最常用的材料。生长速度快，繁殖率高，不易产生遗传变异。）节间部（新梢节间容易灭菌，脱分化再分化能力较强）叶和叶柄（取材容易，新出叶片杂菌较少，实验操作方便。） 鳞片（水仙、百合、葱、蒜、风信子经常以鳞片为材料。）其他（种子、根、块茎、块根、花球、花粉）

2.外植体的选择原则 1.再生能力强 2.遗传稳定性好 3.外植体来源丰富 4. 外植体灭菌容易

3.外植体的选择依据 1.植物的种类和基因型 2. 外植体来源 3.外植体大小 4.取材季节 5.外植体的生理状态和发育年龄

4.外植体的预处理及消毒 1.减少带菌的处理 （在长期晴朗的天气条件下取材、选择信么萌发的幼芽或嫩梢、选择表面比较光滑的材料、对母株定期喷洒杀菌药剂、用纸袋或薄膜袋将枝条封套保护待其萌发新芽后取材、在室内采用水插粗芽后取材，或是在温室植株上取材等，都可以大大减少处事戴菌量。对一些戴菌量较大的植物，如茎尖，从室外取回经剪截处理后，置于烧杯内，杯口用纱布封好，置于水龙头下流水冲洗过夜） 2. 消毒剂的杀伤力和材料对消毒剂的耐受力 （不同消毒剂种类杀伤力不同，不同的外植体材料对同种消毒剂的耐受力也不同。选择消毒剂时，尽可能选用对微生物消灭作用强烈而对植物材料比较安全的种类。在选择外植体材料时，则应优先考虑体积较大戴菌量较少耐受力较强的类型。对于

坚硬致密的外植体材料，如枣核，可采用渗透力较强的消毒剂，如75%的酒精直接进行表面消毒，或用0.1%氯化汞消毒10分钟或更长时间。）3. 清洗的重要性 （外植体经消毒后，必须用无菌水洗去残存的消毒剂，否则会对外植体造成长期伤害，尤其是氯化汞，应清洗多次，去除表面的汞离子）

5.褐变 外植体接种后，于伤口处发生褐化，产生褐色物质，不仅使培养基变褐，而且可能造成外植体死亡，或严重抑制外植体脱分化再分化。

6.外植体褐变原理 褐变包括酶促褐变和非酶促褐变，目前认为植物组织培养中以酶促褐变为主，多酚氧化酶（PPO)是植物体内普遍存在的一种末端氧化酶，它催化酚类化合物形成醌和水，醌在经非酶促聚合形成深色物质，对外植体材料产生毒害作用，影响其生长分化，严重时导致其死亡。

7.防止褐变的措施 1.选择适宜的外植体 2. 预处理母株和外植体 3. 筛选适宜的培养基和培养条件 4. 添加褐变抑制剂和吸附剂 5. 连续转移

8.培养基的基本成分 1.水 2.无机营养成分 A大量元素（氮 磷 钾 钙镁硫）B微量元素（铁硼锰锌铜钼钴氯）3.有机营养成分（碳水化合物、维生素、肌醇、氨基酸）4.植物生长调节剂 A生长素类（吲哚乙酸IAA 萘乙酸NAA 吲哚丁酸IBA 2，4-D等，活性强度2，4-D>NAA>IBA>IAA）B 细胞分裂素类 C其他类（赤霉素、脱落酸、多效唑）5.琼脂 6.活性炭与硝酸银 7.抗氧化物8.染色剂 9.抗生素

9.培养基的类型 1.高盐型培养基（MS培养基是使用最广泛的培养基。特点是无机盐浓度高，养分齐全，铵态氮和硝态氮含量高，比例合适，不需要添加更多的有机附加物，离子平衡情况较好，使用误差较小，利于愈伤组织的诱导和增值，能满足植物组织对矿物质营养的需求，适用于高需肥量植物或生长迅速的培养材料）2.高硝酸钾型培养基（对于喜钾、喜硝态氮或忌铵态氮的外植体材料而言比较适宜，配方有B5 和N6，前者特点是铵盐浓度较低，盐酸硫胺素浓度较高，对枇杷胚状体诱导效果更佳）3.中盐型培养基 4.低盐型培养基（无机盐浓度低，适用于生根培养，成熟胚胎培养或种质材料的保存）

10.培养基的制备 1.母液的配制和保存 2.培养基的配置（先将储存母液按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿、量筒、烧杯、移液管、玻璃棒、漏斗等放在指定位置。称量好所需的琼脂、蔗糖并加热溶解，然后按母液顺序，根据各种母液的倍数吸取相应的量。加完所有的培养基组分，继续加温并不断搅拌，待琼脂完全融化后定容。）3.PH的调节 4.培养基的分装与灭菌

11.灭菌方法 1.培养基的高压湿热灭菌 2.金属器械的灼烧灭菌 3.玻璃器皿及耐热用具的干热灭菌 4. 不耐热物质的过滤灭菌 5.室内空间的紫外线和熏蒸灭菌 6.一些物体表面的药剂喷雾灭菌 7.外植体的表面消毒

12.紫外线灭菌：利用紫外线的辐射作用，引起细菌蛋白质变性或核酸结构发生变化，导致生物大分子发生严重破坏而造成死亡。

13.熏蒸灭菌：用加热焚烧，氧化等方法，使得化学药剂变为气体状态，扩散到空气中，杀死空气和物体表明的微生物

14.外植体的接种程序 1.接种室的消毒 2. 器皿灭菌 3.材料的分离、切去和接种 （接种具体步骤：操作人员穿戴好洁净的工作服、帽子、口罩后，用70%的酒精擦拭双手双臂，在超净工作台上切取经过消毒的外植体。较大的材料可用肉眼直接观察切离，较小的材料需要在双筒实体显微镜下操作。切取材料通常在无菌培养皿或灭菌纸上进行。将试管或三角瓶瓶口靠近酒精灯火焰，瓶口倾斜，将瓶口外部在火焰上旋转烧灼数秒，然后轻轻取下封口物。将瓶口在火焰上旋转烧灼后，用烧灼后冷却的镊子将外植体均匀接种在培养基上。茎尖、茎段应保持直立、先端向上接种，叶片材料可用插接，也可以平放于培养基表面，但平放时一般将叶背朝下，以利于对培养基的吸收。接种时动作要轻，以防气流中夹带细菌进入培养容

器造成污染。接种完毕后，将封口物在火焰上旋转数秒后封住瓶口，在封膜上注明接种植物名称，接种日期、处理方法等，以便日后观察比较。） 15.培养条件的影响 1.温度（大多数在20-30摄氏度，通常控制在25摄氏度左右。低于15℃或高于35℃都会抑制细胞、组织的增殖和分化，不利于培养物生长。2.光照（光效应主要表现在光照度、光照时间、光质等方面。一般培养室要求光照12-16h/d，光照度1000-5000lx。一般来说，黑暗条件利于细胞、愈伤组织的增值，但器官分化往往需要一定光照。不同光波长对器官分化也有一定影响）3.氧和其他气体 （接种时避免把整个外植体全部埋入琼脂中，否则会造成窒息。培养基中氧浓度低于临界水平时，促进形成胚状体，氧浓度高于临界水平时，有利于形成根。培养过程中培养物释放的微量乙烯和高浓度二氧化碳，有时利于生长，有时不利于生长。）4.湿度 （组织培养室内一般要保持70%-80%相对湿度以保证培养物正常生长。湿度过低造成培养基失水干枯，湿度过高造成杂菌滋长导致大量污染）5.培养基的PH 在5.4-6.0 之间

第三章

植物细胞培养 是指把植物器官或愈伤组织上分离出的单细胞或细胞团作为材料进行离体无菌培养，使其形成单细胞无性系或再生植株的技术 细胞分离的方法是机械法和酶解法 细胞悬浮培养 是指将游离的植物细胞按一定的细胞密度，悬浮在液体培养基中不断搅动或摇动的培养方法

细胞悬浮培养的方法 1.分批培养，分批培养是指把细胞分散在一定容积的培养基中进行培养，当培养物增值到一定量时，转接继代，建立起单细胞培养物 2.半连续培养，半连续培养是利用培养罐进行细胞大量培养的一种方式 3.连续培养 ，是指利用特质的培养基容器进行大规模细胞培养的一种培养方式（可分为两类，一种为封闭式，一种为开放式） 悬浮培养细胞的同步化 饥饿法，抑制法，采用植物细胞连续培养的发酵器系统诱导同步分裂

单细胞培养的方法 1.平板培养法，指将制备好的单细胞悬浮液按照一定的细胞密度，接种在薄层固体培养基上进行培养的方法 2.看护培养法，是指利用活跃生长的愈伤组织看护单个细胞，使其持续分裂和增殖的培养方法 3.微室培养法，是指人工制造无菌小室，将单细胞培养在微室中的少量培养基中，使其分裂形成单细胞无性系的培养方法 4.条件培养法，是指合成培养基中的细胞或细胞培养物由于开始接种密度太低而不能分裂，可采用条件培养基进行培养的单细胞培养方法 5.纸桥培养法，是植物茎尖分生组织常用的方法，也可用于单细胞培养

影响细胞培养的因素 培养基、细胞密度、植物生长调节剂和其他附加成分、培养基ph、二氧化碳浓度

第四章

原生质体 指去除了细胞壁的裸露且具有活力的细胞，是一种优越的单细胞体系

原生质体分离的步骤 1.酶解材料准备2.材料预处理3.酶解4.原生质体纯化5.原生质体活力测定

酶解使用的酶 1.纤维素酶 2.果胶酶3.半纤维素酶4.崩溃酶

原生质体活力测定的方法 1.目测法，在显微镜下观察原生质体的形态和流动性，以确定原生质体的活力2.FDA法 3.伊凡蓝法

常用的原生质体培养方法及比较1液体浅层培养 操作要点：将原生质体的液体培养基在培养皿底部铺薄一层，封口后进行培养。优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物；缺点：原生质体分布不均匀，易发生粘连现象，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。2琼脂糖包埋培养 操作要点：常用的固化剂是低熔点琼脂糖，将原生质体悬浮液与液化后冷却到30度的琼脂糖培养基均匀混合，然后将混合后的含有原生质体的培养基铺于培养皿底部，封口后进行培养。包埋不宜过厚，否则束缚细胞分裂且影响通气条件。 优点:可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易于统计原生质体分裂频率，可提高原生质体分裂频率。缺点：混合时的温度掌握必须合适，温度偏高影响原生质体的活力，温度偏低琼脂糖凝固太快，原生质体不易混合均匀。3固液体双层培养基 一般先在培养皿的底部铺一层琼脂糖固体培养基，再将原生质体悬浮液滴于固体培养基表面。优点：固体培养基中的营养物质可以缓慢释放到液体培养基中。缺点：不易观察细胞的发育过程。

原生质体融合：也称细胞融合，指不同种类的原生质体不经过有性阶段，在一定条件下诱导融合并培养再生植株的过程。

第六章

离体繁殖 也称为微型繁殖或快速繁殖，是指通过无菌操作，将分离的植物体的一部分即外植体接种于培养基上，在人工控制的环境条件下进行培养，使其在较短时间周期内快速地再生出大量的完整植株的一套技术与方法 离体繁殖再生途径 1.腋芽萌发，腋芽萌发 又称器官型再生，是指由培养的顶芽或腋芽直接萌发形成小茎后，再诱导小茎生根而形成完整植株的过程。 2.体细胞胚胎发生，是指外植体（含单细胞）脱分化后形成类似于合子胚结构的胚状体或体细胞胚的现象。 3.不定器官的发生，器官发生是指外植体脱分化后形成愈伤组织，再由愈伤组织形成不定器官的现象（包括不定芽、不定根、同步不定根与不定芽形成三种途径）

离体繁殖的特点①繁殖速度快②占用空间小③周年生产④便于种质保存和交换⑤有利于无病菌苗的培育⑥有利于其他的相关科学研究

离体繁殖技术 5个阶段 阶段0：母株的选择和栽培管理1.阶段Ⅰ 无菌培养体系建立。这一阶段的特征是使外植体植入培养基后不受微生物污染并能生存。选择合适的合适的外植体、外植体的消毒和诱导外植体脱分化是本阶段的关键问题 2. 阶段Ⅱ 继代增殖阶段。阶段二的主要目的是通过来自阶段一的增殖体反复继代培养，获得所需数量的胚、芽或其他器官。在这一阶段中，增殖体的细胞发生迅速分裂，原有培养基中的水分及营养多已耗尽，细胞的有害代谢物也已在培养基中积累，因此必须转移至新的培养基中，而且间隔一定时期（一般3至4周）重新转接一次，即继代增殖 （培养基、植物生长调节剂、培养条件和微生物污染是此阶段的主要影响因素） 3阶段Ⅲ 生根成苗阶段。这个阶段的目的是使繁殖体能成功地移植到土壤中，是一种涉及芽苗生根、植株硬化以及从异氧状态到自然状态的启动过程。 4. 阶段 Ⅳ.移栽成活阶段。试管苗的移栽是试管苗从异氧到自养的转变，是试管苗从一个无菌、弱光照、温度恒定和湿度饱和的稳定环境到一个有菌、自然光照、低湿等不稳定环境的过程，也是决定离体繁殖能否在生产实际中应用的最后一关。

人工种子 是指将离体培养产生的繁殖体包埋在含有养分和保护功能的物质中，并在适宜条件下萌发的类似于天然种子的颗粒体

人工种子的结构和特点 1.人工种子的结构 完整的人工种子由繁殖体、人工胚乳和人工种皮3部分组成。体细胞胚（或类似物）相当于天然种子的胚，是具有生命的物质结构。人工胚乳一般由含有维持体细胞胚萌发所需养分和刺激物质的胶囊组成。胶囊之外的包膜成为人工种皮 2.人工种子不仅像天然种子一样可以储存、运输、播种、萌发和长成正常植株，而且

还有许多独特的优点①可使在自然条件下不结实或种子昂贵的植物得以繁殖②固定杂种优势。人工种子在本质上属于无性繁殖，一旦获得优良基因型，可以保持杂种优势，多年使用而不需三系配套等复杂的制种过程③快捷高效的繁殖方式。人工种子可在实验室常年获得，并可以用生物反应器大规模生产④可认为控制植物的生长发育与抗逆性。人工胚乳除了含有供胚状体发育成植株所必须的营养物质外，还可以在其中加入除草剂、杀菌剂、农药、抑制休眠的物质及对生物生长有益的细菌等，使其具备抗逆性和耐储存性等优良特性，也可添加激素类物质以调节植物的生长发育⑤与试管苗技术比较，人工种子技术在理论上具有成本低、储藏运输方便、无玻璃化的缺陷，减少移栽驯化过程和生产周期短等优点⑥人工种子能大量的从人工授粉杂种和遗传工程植株中筛选出来的优良基因型，并为不育和不稳定的基因型提供一种繁殖方法⑦人工种子技术还可以成为植物抗虫、抗病和抗除草剂等基因工程成果转向生产的桥梁

体细胞胚的诱导及影响因素 体细胞胚胎发生包含两个步骤1外植体在条件培养基上进行胚性细胞的增殖或克隆，诱导或孕育；2胚性细胞在诱导培养基上进行胚的发育。影响因素：1基因型：不同植物基因型在产生胚状体的能力方面有很大差别。2外植体：能够诱导产生体细胞胚的外植体是多种多样的，主要有胚性预决定外植体和胚性重决定外植体。3生长调节物质，诱发不同的外植体产生体细胞胚所需要的植物生长调节剂种类是不同的。4氮素和氨基酸 还原态氮如硝酸铵在诱导体细胞胚的发生中很有效，而氧化态氮效果不太明显。5光照和其他因子，体细胞胚对光暗周期的要求因植物种类而异，缺糖或低糖条件下，体细胞胚不形成，高糖条件下，体细胞胚的分化常不超过原胚时期。此外还有活性炭的有无，矿物盐浓度，以及低温和辐射处理都会影响体细胞胚的发生，单位容器中接种的外植体数目，培养基中可溶性氧含量等也会影响体细胞胚发生的频率。

2人工种子包埋的方法：液胶法 ：将胚状体或小植株悬浮在一种黏滞的流体胶中直接播入土壤。2干燥法：将体细胞胚经干燥后再用聚氧乙烯等聚合物进行包埋的方法。3 水凝胶法：指通过离子交换或温度突变形成的凝胶包裹材料的方法。 3植物脱毒：指通过各种物理或化学方法将植物体内有毒病毒及类似病毒去而获得无病毒植株的过程。

4植物脱毒的方法：1热处理脱毒2茎尖培养脱毒3微体嫁接脱毒4抗病毒剂的应用5其他脱毒方法（花器官培养脱毒和珠心胚培养脱毒）

5获得无病毒苗的途径：1从现有的栽培种质中筛选无病毒的单株2采用一定的措施脱除植株体内的病毒。

6热处理脱毒的原理：热处理利用病毒类病原与植物的耐热性不同，将植物材料在高于正常温度的环境条件下处理一定时间，使植物体内的病原钝化或失去活性，而植物的生长受到较小的影响，或在高温条件下植物生长加快，病毒的增殖速度和扩散速度跟不上植物的生长速度而被抛在其后，植物的新生部分不带病毒。

茎尖培养脱毒的原理：由White提出的“植物体内病毒分布学说”虽然病毒侵入植物体后是全身扩展的，但不同的组织和部位，病毒的分布和浓度有很大差异。一般而言，病毒粒子随着植物组织的成熟而增加，顶端分生组织是不带病毒的。

7脱毒苗的鉴定：一脱毒效果的检测：1生物学检测（草本指示植物检测，木本指示植物检测）2血清学检测（免疫电镜技术，酶联免疫吸附分析技术，组织免疫印迹技术）3分子生物学检测（双链核糖核酸分析，核酸杂交技术，聚合酶链式反应）

8实验室的基本结构和功能：1准备室：进行一些常规的实验操作，如组织培养所用器具的清洗干燥和保存，培养基的配置和灭菌，同时摆放常用的仪器和设备2无菌操作室：进行植物材料的消毒，接种以及培养物的继代转移操作。3培养室：接种后的材料放在培养室里培养，使其分化生长。4资料室：存放与实验有关的书籍，资料，实验记录等。

香石竹 茎尖培养 ：1、取材、消毒和接种 从盆栽或温室中选取无病害、生长健壮的植株，

取其侧芽，逐层剥去叶片，留顶部未展开的2~3对嫩叶，用带有洗涤剂的自来水冲洗干净，然后用纱布吸干水分，至于超净工作台上备用。对材料的消毒，首先用70％消毒30~60s,再用0.1％~0.2％的氯化汞溶液（可适当加入吐温—80）消毒8~10分钟，最后用无菌水冲洗8~10次。2、诱导培养 香石竹茎尖剥离下来后，放在有合适生长调节剂的培养中才能成活，添加生长调节剂一般为生长素类和细胞分裂素类，培养基中才能成活，添加生长调节剂一般为生长素类和细胞分裂素类，培养基可以是固体培养基也可以是液体培养基。常用的固体培养基：MS＋BA0.2~0.5mg/L＋IAA0.1~0.2mg/L或MS＋KT0.5~1.5mg/L＋NAA0.2~0.5mg/L,培养条件为温度（24~26度)，光照为12~16h/d,光照强度2000~3000lx。经过10d左右的培养，大部分茎尖开始萌动，逐渐长大，20d左右即可长成一小丛植株，然后转入增殖培养基。3、增殖培养 香石竹是由丛生芽途径快速繁殖的，在茎尖诱导20~30d时从芽基部分分离单株，每株有1~2个茎节和2~3个叶片，增殖用的培养及为MS＋BA0.5~1.0mg/L＋IAA0.1~0.2mg/L ,温度可适当降到22度左右，这样可以防止香石竹试管苗出现玻璃化现象。4、生根培养 待香石竹试管苗继代增殖到一定数量以后，将增殖后的香石竹芽丛分离为单株，即把长2~3cm的嫩茎切下，然后进行生根培养，一般经过7~10d可形成带根系的再生植株。5、驯化移栽 生根培养12~21d后，即可长出3~5条根，株高3~4cm，这时就可以用于移栽。移栽前要先将试管苗连瓶一起放入温室内，2~3d后揭开瓶盖进行炼苗，炼苗时间一般为2~3d ，然后用镊子将生根苗轻轻夹出，用清水洗净根部附着的培养基，并将基部的老叶摘去，该过程中注意不要碰伤根系和折断小苗。用镊子将小苗轻轻放入经高温灭菌的栽培基质中，栽培基质要求质地疏松、透气透水性好，可以选用细粒珍珠岩、蛭石、木屑、草炭等按一定比例混合使用。幼苗栽植深度不宜太深，不宜浇水。

香石竹组织培养脱毒技术 1、热处理脱毒 香石竹的热处理脱毒采用的温度为36~42度，处理时间为5~10周，一般情况下，经过热处理的植株可以脱去病毒，但是由于不同病毒对于热处理的敏感性不同，有的病毒经过热处理可以被钝化，例如香石竹花叶病毒，而有的病毒则较难祛除，例如香石竹条斑病毒，有的病毒用热处理几乎不能去除，例如香石竹蚀环病毒。2、茎尖培养脱毒 很多不能由单独的热处理脱除的病毒，可以通过茎尖培养脱除。茎尖培养最关键是切取茎尖的大小。茎尖的大小不仅对脱毒效果有很大的影响，而且与茎尖培养的成活率有直接关系。3、茎尖培养结合热处理脱毒 单一的热处理或者茎尖培养脱毒方法各有利弊，二者结合使用则效果更好，因此在实际生产中，常常采用茎尖培养结合热处理脱除病毒。4、茎尖培养结合病毒钝化剂脱除 该方法在培养基中添加碱性的孔雀绿、2，4-D以及硫尿嘧啶等病毒抑制剂，可显著提高茎尖培养的脱毒率，但是由于病毒对于病毒抑制剂的反应活性不同，因此，在实际生产中不常用该方法。 香石竹组织培养脱毒苗的检测鉴定 1、直接观察法 2、指示植物鉴定法 3、抗血清鉴定法 4、电镜鉴定法

香石竹无病毒苗培育过程中存在的问题1、香石竹茎尖脱毒不彻底2、香石竹试管苗玻璃化及其预防3、香石竹试管苗丛生状变异

菊花 一、外植体的选取与消毒接种 1、以茎尖为外植体 以茎尖做外植体时，一般取3cm

左右长的顶稍，去掉展开的叶片后，将选取的材料放入纱布袋中用自来水冲洗5min，在无菌条件下，用70％乙醇消毒30s，用无菌水冲洗两次后，用0.1％的氯化汞溶液消毒十分钟，经无菌水漂洗一次后，再用次氯酸钠处理五分钟，无菌水冲洗6~8次，切取0.3~0.5厘米的 茎尖，垂直接种到培养基上。如果是脱毒，则在超净工作台上借助体视显微镜剥取两个叶原基、不大于0.5mm的茎尖，迅速接种到准备好的 培养基上。2、以茎段为外植体 茎段去叶，留一段叶柄。将材料在自来水下冲洗15min，在无菌条件下，用70％乙醇消毒30s，用无菌

水冲洗2次后，用0.1％的氯化汞溶液消毒8~10min ，在氯化汞溶液中每100ml可滴3~5滴吐温-20，再用无菌水冲洗8~10次，放在超净工作台上待用。3、以花序轴为外植体 以花序轴为外植体时，选取即将开放、健康饱满的花蕾，用自来水冲洗5~10 min，在超净工作台上，用70％乙醇消毒30s，用无菌水冲洗两次后，用0.1％的氯化汞溶液消毒6~8min，再用无菌水冲洗8~10次。吸干花蕾表面的水分，剥去花序轴外层的花被，得到透镜状或半球形的花序轴，视其大小，切成小块儿进行接种。从花蕾上剥下的舌状花，管花，也可切成小块儿小段儿进行接种。4、以花瓣为外植体 取菊花未开放的花蕾，自来水冲洗5min，在洗衣粉上清液中浸泡5min，再用自来水冲洗10min 。在无菌条件下加入75％乙醇灭菌30s，用无菌水冲洗一次后，在次氯酸钙溶液中浸泡8min，无菌水冲洗4~6次，再用 0.1％的氯化汞溶液浸泡5min，无菌水冲洗6~8次。在整个灭菌和清洗过程中，应不停地摇动瓶子，使材料充分与消毒液和清洗液接触。然后将材料放入无菌培养皿中，用解剖刀将花蕾切成4块，剪去花序轴和总苞，将分散未开放的花瓣接入培养基中。

蝴蝶兰离体培养 （同大花惠兰）1、培养基及培养条件 2、原球茎的诱导 蝴蝶兰可以

通过茎尖、茎段、腋芽、叶片、根尖等诱导原球茎3、原球茎的增殖及分化 在原球茎形成后，于无菌条件下取出切成小块儿（>2mm），转接到新的培养基上，在同样的条件下培养，就能产生许多原球茎4、壮苗及生根培养将分化出的芽接入新鲜培养基上，经过三个月的培养，可以发育形成新的小植株。随后移入壮苗及生根培养基上。培养一个月后，一般可发育形成具有4条根，4片叶，生长健壮的植株。5、驯化移栽 试管苗具有3~4条壮根时，可以移栽。先将培养瓶移出实验室，打开瓶塞，在室温下炼苗一周。出瓶时，洗去根部的培养基在0.1％的高锰酸钾溶液中浸泡5min后风干叶面水分，移植于浸湿的水苔、椰子壳等基质中。移栽后应保持较高的空气湿度，半个月后每周施肥一次，冬季适量升温，5个月左右可以上盆，一般培养2~3年即可开花。

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