微生物实验教学

微生物实验教学

来源：http://www.jyu.edu.cn/huaxue/kejian/weishengwuxue/syjx.htm

实验一 培养基的制备 一、实验教学目标基本与要求 1、明确培养基的配制原理。

2、掌握配制培养基的一般方法和步骤。 二、实验内容

1、介绍培养基的配制原理和方法步骤 2、动手称量试剂、配制牛肉蛋白胨培养基 三、培养基的制备过程

称量--配置--调节pH值--过滤--分装--灭菌 1.称量

按照培养基配方，准确称量各成份放于烧杯中。对于不是粉状（如肉膏），应用烧杯称量。 2.配调

向上述烧杯中加入所需要的水量（可视情况不同，一次或多次加入水），搅拌，使其溶解（可加热助溶）。如是配制固体培养基，在琼脂的熔化过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水分。

如果配方中含有淀粉，则需先将淀粉用少量冷水调成糊状并在火上加热搅拌，然后加足水分及其他药品，待完全熔化后补足所失水分。 3.调节pH值

一般做法是：培养基溶解均匀并冷却至室温时用pH试纸测pH，然后根据要求加酸或碱（一般用1molHcl和1molNaOH），要缓慢少量且多加搅拌。培养基配方为自然pH时，不用调节。 4.过滤

用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可省去。 5.分装

将制好的培养基分装入试管内或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。固体培养基要趁热装。 分装时要避免培养基粘染管（瓶）口，引起污染。分装量可分为下面几方面：

（1）斜面：装量为管长的1/4-1/5。

（2）液体培养基、高层培养基、半固体培养基：装载量不超过管长的1/3。 （3）三角瓶：装量不超过容积1/2。 6.灭菌

塞棉塞，包扎，灭菌。

高压蒸汽灭菌法：是在密闭的加压容器内进行，加热使器内的水产生蒸汽，由于密闭，增加了器内的压力，使水的沸点升高，从而获得高于100度的蒸汽温度。 四、实验报告

记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。 五、问题和思考

l．配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么? 2．培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理?已灭菌的培养基如何进行无菌检查? 3．试设计实验对饮料进行无菌检查。

实验二 消毒与灭菌

一、实验教学目标与基本要求

了解消毒和灭菌的原理，掌握各种灭菌方法的操作步骤。 二、器材和试剂

培养皿、试管、吸管、电烘箱、牛肉膏蛋白胨培养基，培养皿(6套一包)，手提式高压蒸气灭菌锅、培养基牛肉膏蛋白胨平板、紫外线灯等。溶液或试剂3%~5%石炭酸或2%~3%来苏尔溶液等。 三、实验内容： 1．干热灭菌法 2． 高压蒸汽灭菌 3．紫外线灭菌法 四、实验步骤 （一）干热灭菌法 1、基本原理

干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白蛋凝固就越快，反之含水量越少，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高（160～170℃），时间要长（1～2h），但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。 2、操作步骤 （1）装入待灭菌物品

将包好的待灭菌物品（培养皿、试管，吸管等）放入电烘箱内，关好箱门。物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通，灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。

（2）升温

接通电源，拨动开关，打开电烘箱排气孔，旋动恒温调节器至绿灯亮，让温度逐渐上升。当温度升至100℃时，关闭排气孔。在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温，此时如果还未达到所需的160—170℃温度，则需转动调节器使红灯再亮，如此反复调节，直至达到所需温度。 （3）恒温

当温度升达到160～170℃时，恒温调节器会自动控制调节温度，保持此温度2h。干热火菌过程。严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故。 （4）降温

切断电源、自然降温。 （5）开箱取物

待电烘箱内温度降到70℃以下后，打开箱门，取出灭菌物品。电烘箱内温度末降到70℃，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。 3、思考题：

（l）在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么?

（2）为什么干热火菌比湿热灭菌所需要的温度要高，时间要长?请设计干热灭菌和湿热灭菌效果比较实验方案。

（二）、高压蒸气灭菌 1、基本原理

高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低（表2-1），二是湿热的穿透力比干热大（表2-2），三是湿热的蒸气有潜热存在。1g 水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26kJ(千焦)的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。一般培养基用0.1Mpa（相当于15 Ib/in2 或1.05kg/cm2），121.5℃,15～30min 2、操作步骤

（1）首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。切勿忘记加水，同时水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。

（2）放回内层锅，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与锅壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。

（3）加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

（4）用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加到逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.1Mpa，121.5℃，20min 灭菌。灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。

（5）灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者。

（6）将取出的灭菌培养基，需摆斜面的则摆成斜面，然后放入37℃温箱培养24h，经检查若无杂菌生长，即可待用。 3、实验报告 （l）结果

检查培养基灭菌是否彻底。 4、思考题

(1) 高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽?灭菌完毕后，为什么待压力降低“0”时才能打开排气阀，开盖取物？

（2）在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素? （3）灭菌在微生物实验操作中有何重要意义?

（4）黑曲霉的孢子与芽孢杆菌的孢子对热的抗性哪个最强?为什么?

（三）紫外线灭菌 1、基本原理

紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为200~300nm 的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm 的杀菌力最强。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA 链的交联，从而抑制了DNA 的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成[O]，再使O2 氧化生成臭氧（O3）或使水（H2O）氧化生成过氧化氢（H2O2）。O3 和H2O2 均有杀菌作用。紫外线穿透力不大，所以，只适用于无菌室，接种箱，手术室内的

空气及物体表面的灭菌。紫外线灯距照射物以不超过1.2m 为宜。此外，为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外灯以前；可在无菌室内(或接种箱内)喷洒3%～5%石炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落，另一方面也可以杀死一部分细菌。无菌室内的桌面、凳子可用2%～3%的来苏尔擦洗，然后再开紫外灯照射，即可增强杀菌效果，达到灭菌目的。 2、操作步骤 （l）单用紫外线照射

a 在无菌室内或在接种箱内打开紫外线灯开关，照射30min，将开关关闭。 b 将牛肉膏蛋白胨平板盖打开15min，然后盖上皿盖。置37℃培养24h。共做三套。 c 检查每个平板上生长的菌落数。如果不超过4 个，说明灭菌效果良好，否则，需延长照射时间或同时加强其他措施。 （2）化学消毒剂与紫外线照射结合使用

a 在无菌室内，先喷洒3%～5%的石炭酸溶液，再用紫外线灯照射15imn。 b 无菌室内的桌面，凳子用2%～3%来苏尔擦洗，再打开紫外线灯照射15min。 c 检查灭菌效果:方法同“单用紫外线照射”。

因紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外线灯光下工作。 3、实验报告 （1）结果

记录两种灭菌效果于下表中 :处理方法 平板菌落数 1 2 3 灭菌效果比较 紫外线照射 3%-5% 石炭酸 + 紫外线照射 2%-3% 来苏尔 + 紫外线照射

4、思考题：

（1）细菌营养体细胞和细菌芽孢对紫外线和的抵抗力会一样吗，为什么？ （2）你知道紫外线灯管是用什么玻璃制作的？为什么不用普通灯用玻璃？ （3）在紫外灯下观察实验结果时，为什么要隔一块普通玻璃？

（四）微孔滤膜过滤除菌 1、基本原理

过滤除菌是通过机械作用滤去液体或气体中细菌的方法。根据不同的需要选用不同的滤器和滤板材料。微孔滤膜过滤器是由上下二个分别具有出口和入口连接装置的塑料盖盒组成，出口处可连接针头，人口处可连接针筒，使用时将滤膜装入两塑料盖盒之间，旋紧盖盒，当溶液从针筒注入滤器时，此滤器将各种微生物阻留在微孔滤膜上面，从而达到除菌的目的。根据待除菌溶液量的多少，可选用不同大小的滤器。此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分，但由于滤量有限，所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌。

苏云金芽孢杆菌(示伴胞晶体)、普通变形菌(示鞭毛)、丙酮丁醇梭菌(示芽孢)、褐球固氮菌(示荚膜)等细菌的染色装片，并分别在油镜下绘图。 (三)观察枯草杆菌活菌，常用压滴法观察。

1．将洁净无油腻的载片放于自己右边前方，在中央放一小滴无菌水。 2．将酒精灯放于自己正前方，点燃。

3．用无菌操作方法从枯草芽孢杆菌斜面中沾取少量菌体，与载片上的水滴充分混匀，把接种环上残留的菌体杀灭后，放回试管架。

4．用镊子夹一洁净的盖玻片，使其一边先接触菌液，然后将整个盖玻片慢慢放下，注意不要产生气泡。如菌液过多，可用吸水纸适当吸去一部分。 三、思考题

1．用明视野显微镜观察细菌的形态时，你认为用染色装片好，还是用非染色的活体装片好，为什么?观察活体装片与染色装片，光线调节各有什么不同?

实验七 细菌单染色法及革兰氏染色法

一、实验目的和要求

目的：1、巩固无菌操作技术，掌握细菌的涂片和单染色技术； 2、初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色法步骤 二、实验材料和用具

大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylocosccus aureus)的斜面菌种。苏云金杆菌或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(E.coli)菌液，待测菌菌液1～2 种吕氏美蓝染色液、石炭酸复红染色液、黑色素液或碳素墨水、香柏油、二甲苯、无菌水；革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液等)、香柏油、二甲苯。显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、无菌牙签。 三、实验内容 (一)单染色法

1．涂片 在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约1～1.5cm2(图7-1A、B)。 2．干燥 将涂片于室温中自然干燥。

3．固定 手扶载片一端，使涂菌的一面向上，将载片通过微火2～3 次。在火上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载片在火上烤，否则细菌形态毁坏。 4．染色 将涂片置于水平位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约2min。 5．水洗 倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止（图7—1E）。 6．干燥 自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦掉菌体（图7—1F）。

7．待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再用油镜观察。 （二）革兰氏染色法 1、制片

（1）涂菌 用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约lcm 的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。

（2）干燥 于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过 高)。

（3）固定 目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即

将细菌涂片膜向上，通过火焰3 次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于 染色。 2、染色

（l）初染 于制片上滴加结晶紫染液，染lmin 后，用水洗去剩余染料。 （2）媒染 滴加卢戈氏碘液，lmin 后水洗。

（3）脱色 滴加95%乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止 (根据涂片之厚薄需时30s 至lmin)，水洗。

（4）复染 滴加石炭酸复红液复染lmin，水洗。 （5）滤纸吸干，油镜镜检。 3、结果

革兰氏阳性菌染成蓝紫色，革兰氏阴性菌染成淡红色。 4、检测未知菌

用以上方法对未知菌进行革兰氏染色，并绘图、记录染色结果。

四、注意事项

1、载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，菌膜宜薄。

2、涂片务求均匀，切忌过厚。 3、在染色过程中，不可使染液干涸。

4、脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使阳性菌被染成阴性菌；脱色不够，则会使阴性菌被染成阳性菌。

5、老龄菌因体内核酸减少，会便阳性菌被染成阴性菌，故不能选用。 五、思考题

1．涂片在染色前为什么要先进行固定?固定时应注意什么问题?

2．制备染色装片时应注意哪些事项，为什么?制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察?

3．涂片后为什么要进行固定?固定时应注意什么? 4．什么是革兰氏染色法?染色过程应注意什么?

实验八 放线菌的形态观察

一、实验目的和要求

1、辨认放线菌的营养菌丝、气生菌丝、孢子丝、孢子的形态； 2、学习放线菌的观察方法 二、实验材料和用具

细黄链霉菌(streptomycs micuoflavus) 又称5406的培养平皿； 棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)的玻璃纸培养平皿。 0.1%美蓝染色液、石炭酸复红染色液；

盖玻片、载玻片、镊子、接种环、显微镜、涂布器、玻璃纸、打孔器。 三、操作步骤

(一)观察自然生长状态的放线菌

用镊子小心取出用插片法培养的5406 菌培养皿中的一张盖玻片，将其背面附着的菌丝体擦净。然后将长有菌的一面向上放在洁净的载玻片上，用低倍镜、高倍镜观察。找出3类菌丝及其分生孢子，并绘图。注意放线菌的基内菌丝、气生菌丝的粗细和色泽差异。 (二)水封片观察

取一滴美蓝染色液置于载玻片中央，将用搭片法培养棘孢小单孢菌培养皿中的盖玻片取出，并将有菌面朝下，放在载玻片上，浸在染色液中，制成水封片，用高倍镜观察其单个分生孢子及其基内菌丝，并绘图。 (三)玻璃纸法的镜检观察

1、直接玻璃纸观察 分别用5406 和棘孢小单孢菌的玻璃纸制片观察。制片时，于载玻片上放一小滴蒸馏水，将含菌玻璃纸片小心剪下一小块，移至载玻片上，并使有菌面向上。在玻璃纸与载玻片间不能有气泡，以免影响观察。将制片于显微镜下观察，先用低倍镜观察菌的立体生长状况，再用高倍镜仔细观察。注意区分5406 菌的基内菌丝、气生菌丝和弯曲状或螺旋状的孢子丝。观察棘孢小单孢菌时注意把视野调暗，其基内菌丝纤细发亮，其单个分生孢子发暗，直接生长在基内菌丝长出的小梗上。绘图。

2．印片染色法观察 用镊子取洁净载玻片并微微加热，然后用这微热载玻片盖在长有5406 或棘孢小单孢菌的平皿上，轻轻压一下，注意将载玻片垂直放下和取出，

以防载玻片水平移动而破坏放线菌的自然形态。反转有印痕的载玻片微微加热固定．用石炭酸复红染色l min，水洗，晾干。用油镜观察。绘图。注意比较两种菌的形态特征有何不同。 四、注意事项

1．培养放线菌中要注意，放线菌的生长速度较慢，培养期较长，在操作中应特别注意无菌操作，严防杂菌污染。

2．玻璃纸法培养接种时注意玻璃纸与平板琼脂培养基间不宜有气泡，以免影响其表面放线菌的生长，

3．不同观察方法中严格按要求进行，注意菌体的上下位置。 五、实验报告

1．绘图 玻璃纸法、水封片法、印片法及自然生长状态下观察的放线菌形态。 2．试比较5406 菌与棘孢小单孢菌特征的异同。 六、思考题

1．在高倍镜或油镜下如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝?

2．用插片法和搭片法如何制备放线菌标本，其主要优点是什么?可否用此法观察其他微生物?为什么?

3．以玻璃纸覆盖法培养和观察放线菌有何优点?试用此法设计一个观察青霉菌形态的实验。 注：

(一)插片法和搭片法培养放线菌 1．插片法

(1)制平板、接种：用冷却至约50℃的高氏1 号琼脂培养基倒平板(每皿约20mL)，可用两种方法接菌：1、先接种后插片：冷凝后用接种环挑取少量斜面上的5406 菌孢子，用平板培养基的一半面积作来回划线接种(接种量可适当加大)；2、先插片后接种：用平板培养基的另一半面积进行。

(2)插片及培养：用无菌镊子取无菌盖玻片，在已接种平板上以45°角斜插入培养基内，插人深度约占盖玻片1/2 长度(图11-1A)。同时，在另一半未经接种的部位以同样方式插入数块盖玻片，然后接种少量5406 菌孢子至盖玻片一侧的基部，且仅接种于其中央位置约占盖玻片长度的一半左右，以免菌丝蔓延至盖玻片的另一侧。将插片平板倒置于28℃，培养3～7d。 2．搭片法

(1)开槽及接种：用无菌打孔器在凝固后的平板培养基上打洞数个，并将棘孢小单孢菌孢子划线接种至洞内边缘。

(2)搭片及培养：在接种后的洞面上放一无菌盖玻片，平板倒置于28℃，培养3～

7d（图11—1B）。

(二)玻璃纸法固体培养5406 菌和棘孢小单孢菌

1．玻璃纸灭菌 将玻璃纸剪成比培养皿直径略小的片状，将滤纸剪成培养皿大小的圆形纸片并稍润湿，然后把 滤纸和玻璃纸交互重叠地放在培养皿中，借滤纸将玻璃纸隔开。然后进行湿热灭菌，备用。图11—1 放线菌的插片与搭片培养示意图A. 插片法； B. 搭片法

2．制平板及铺玻璃纸 取冷凝后的高氏1 号琼脂培养基，用无菌镊子将预先灭菌的块状玻璃纸平铺至平板培养表面，铺玻璃纸时可用无菌涂布器将玻璃纸与培养基之间的气泡除去。

3．涂布菌液及培养 取0.l mL 的孢子悬液涂布在铺有玻璃纸的平板培养基表面。接种平板倒置于28℃，培养 5～7d。

实验9 细菌鞭毛染色及其运动的观察

一、实验目的和内容

目的：了解细菌鞭毛染色的原理，掌握鞭毛染色法；学习观察细菌运动的方法。 内容：1. 细菌的鞭毛染色法。 2．用压滴法观察细菌的运动。 3．用悬滴法观察细菌的运动。 二、实验材料和用具

普通变形菌(Proteus vulgaris)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。 牛肉膏蛋白胨培养基斜面、鞭毛染色液、0.01%美蓝水溶液、香柏油、二甲苯、无菌水、凡士林；显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、凹载玻片、盖玻片、镊子、细玻棒、吸水纸。 三、操作步骤 (一)细菌鞭毛染色

1．活化菌种 将保存的变形菌在新制备的普通牛肉膏蛋白胨斜面培养基上连续移种2～3 次，每次于30℃培养10～15h。活化后菌种备用。

2．制片 在干净载玻片的一端滴一滴蒸馏水，用无菌操作法，以接种环从活化菌种中取少许菌苔(注意不要带培养基)，在载玻片的水滴中轻沾几下。将载玻片稍倾斜，使菌液随水滴缓缓流到另一端，然后平放，于空气中干燥。 3．染色

(1)滴加鞭毛染色液A 液，染3～5min。 (2)用蒸馏水充分洗净A 液，使背景清洁。 (3)将残水沥干或用B 液冲去残水。

(4)滴加B 液，在微火上加热使微冒蒸汽，并随时补充染料以免干涸，染30～60S。 (5)待冷却后，用蒸馏水轻轻冲洗干净，自然干燥或滤纸吸干。

4．镜检 先用低倍镜和高倍镜找到典型区域，然后用油镜观察。菌体为深褐色，鞭毛为褐色。注意观察鞭毛着生位置(镜检时应多找几个视野，有时只在部分涂片上染出鞭毛)。 (二)细菌运动的观察 1．压滴法

(1)制备菌液：从幼龄菌斜面上，挑数环菌放在装有1～2mL 无菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液。

(2)取2～3 环稀释菌液于洁净载玻片中央，再加入一环0.01%的美蓝水溶液，混匀。

(3)用镊子夹一洁净的盖玻片，先使其一边接触菌液，然后慢慢地放下盖玻片，这样可防止产生气泡。

(4)镜检：将光线适当调暗，先用低倍镜找到观察部位，再用高倍镜观察。要区分细菌鞭毛运动和布朗运动，后者只是在原处左右摆动，细菌细胞间有明显位移者，才能判定为有运动性。 2．悬滴法

(1)取洁净盖玻片，在四周涂少许凡士林。 (2)在盖玻片中央滴一小滴菌液（图9—1A）

(3)将凹玻片的凹窝向下，使凹窝中心对准盖玻片中央的菌液(图9-1B)，轻轻地盖在盖玻片上，便凹玻片与盖玻片粘在一起(注意液滴不得与凹玻片接触)。 (4)小心将玻片翻转过来，使菌液正好悬在窝的中央。再用火柴棒轻压盖玻片四周使封闭，以防菌液干燥。

（5）镜检：将光线适当调暗，先用低倍镜找到悬滴的边缘后(图9—1D)，再将菌液移至视野中央，换用高倍镜观察，注意细菌是如何运动的，它与分子布朗运动的不同。图9—1 悬滴标本的制备 四、注意事项

1．鞭毛染色液最好当日配置当日用，次日使用则鞭毛染色浅，观察效果差。染色时一定要充分洗净A 液后再加B 液，否则背景不清晰。

2．观察细菌的运动，载玻片和盖玻片都要洁净无油，否则会影响细菌的运动。有些细

菌，温度太低时不能运动。 五、实验报告

1．绘出你所观察到的细菌的形态及鞭毛着生情况。 2．试描述你所观察的细菌有无运动性，是如何运动的?

六、问题和思考

1．鞭毛染色的菌种为什么要先连续传几代，并且要采用幼龄菌种? 2．根据你的实验体会，哪些因素影响鞭毛染色的效果?如何控制?

3．试设计一实验，如何鉴别某种细菌是否能运动，是否有鞭毛，其鞭毛的着生位置。

实验10 细菌芽孢、荚膜的染色及观察

一、实验目的和内容

目的：掌握细菌的芽孢及荚膜染色方法。 内容：1．细菌的芽泡染色。 2．细菌的荚膜染色。

二、实验材料和用具枯草芽孢杆菌、褐球固氮菌的斜面菌种。二甲苯、香柏油、蒸馏水、5%孔雀绿水溶液、0.5%沙黄水溶液(或0.05%碱性复红)、绘图墨水(用滤纸过滤后备用)、95%乙醇、石炭酸复红染液；显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、小试管(l×6.5cm)、烧杯(300mL)、滴管、试管夹、擦镜纸、吸水纸。 三、操作步骤 (一)芽孢染色法 1．方法1

(1)取37℃培养18～24h 的枯草芽孢杆菌作涂片，并干燥，固定(参见“细胞单染色法”)。

(2)于涂片上滴人3～5 滴5%孔雀绿水溶液。

(3)用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约4～5min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。 (4)倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。 (5)用0.5%沙黄水溶液(或0.05%碱性复红)复染lmin，水洗。 (6)制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。 2．方法2

(1)加1～2 滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2～3 环培养18～24h 的枯草芽孢杆菌菌苔于试管中，并充分混匀打散，制成浓稠的菌液。

(2)加5%孔雀绿水溶液2～3 滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。 (3)将此试管浸于沸水浴(烧杯)中，加热15～20min。

(4)用接种环从试管底部挑数环菌于洁净的载玻片上，并涂成薄膜，将涂片通过微火3次固定。

(5)水洗，至流出的水中无孔雀绿颜色为止。

(6)加沙黄水溶液，染2～3min 后，倾去染液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。 (7)干燥后用油镜观察。芽孢绿色，菌体红色。 (二)荚膜染色法 1．石炭酸复红染色

（1）取培养了72h 的褐球固氮菌制成涂片，自然干燥(不可用火焰烘干)。 （2）滴入1～2 滴95%乙醇固定(不可加热固定)。 （3）加石炭酸复红染液染色1～2min，水洗，自然干燥。

(4) 在载玻片一端加一滴墨汁，另取一块边缘光滑的载玻片与墨汁接触，再以匀速推向另一端，涂成均匀的一薄层，自然干燥。

(5)干燥后用油镜观察。菌体红色，荚膜无色，背景黑色。 2．背景染色

(1)先加1 滴墨水于洁净的玻片上，并挑少量褐球固氮菌与之充分混合均匀。 (2)放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸收多余的菌液。

(3)干燥后用油镜观察。背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即荚膜。 四、注意事项

1．荚膜染色涂片不要用加热固定，以免荚膜皱缩变形。

2．供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽孢仍保留在菌体上为宜。 五、实验报告 (一)绘图

1．枯草芽孢杆菌及巨大芽孢杆菌的菌体及芽孢形态，芽孢的着生位置。 2．褐球固氮菌菌体及荚膜的形态。

(二)试制片，但不进行染色，观察是否能看到芽孢和荚膜? 七、问题和思考

1．为什么芽孢染色要加热?为什么芽孢及营养体能染成不同的颜色? 2．组成荚膜的成分是什么?涂片一般用什么固定方法，为什么?

3．试设计实验如何鉴定某一产芽孢菌株的芽孢形态、着生位置及所属分类地位。

实验11 放线菌的形态观察

一、实验目的和内容

目的：辨认放线菌的营养菌丝、气生菌丝、孢子丝、孢子的形态；学习放线菌的观

察方法。

内容：用水封计法、玻璃纸法、印片法观察放线菌的形态特征。 二、实验材料和用具

细黄链霉菌(streptomycs micuoflavus) 又称5406 的培养平皿， 棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)的玻璃纸培养平皿。0.1%美蓝染色液、石炭酸复红染色液；盖玻片、载玻片、镊子、接种环、显微镜、涂布器、玻璃纸、打孔器。 三、操作步骤

(一)观察自然生长状态的放线菌

用镊子小心取出用插片法培养的5406 菌培养皿中的一张盖玻片，将其背面附着的菌丝体擦净。然后将长有菌的一面向上放在洁净的载玻片上，用低倍镜、高倍镜观察。找出3类菌丝及其分生孢子，并绘图。注意放线菌的基内菌丝、气生菌丝的粗细和色泽差异。 (二)水封片观察

取一滴美蓝染色液置于载玻片中央，将用搭片法培养棘孢小单孢菌培养皿中的盖玻片取出，并将有菌面朝下，放在载玻片上，浸在染色液中，制成水封片，用高倍镜观察其单个分生孢子及其基内菌丝，并绘图。 (三)玻璃纸法的镜检观察

l．直接玻璃纸观察 分别用5406 和棘孢小单孢菌的玻璃纸制片观察。制片时，于载玻片上放一小滴蒸馏水，将含菌玻璃纸片小心剪下一小块，移至载玻片上，并使有菌面向上。在玻璃纸与载玻片间不能有气泡，以免影响观察。将制片于显微镜下观察，先用低倍镜观察菌的立体生长状况，再用高倍镜仔细观察。注意区分5406 菌的基内菌丝、气生菌丝和弯曲状或螺旋状的孢子丝。观察棘孢小单孢菌时注意把视野调暗，其基内菌丝纤细发亮，其单个分生孢子发暗，直接生长在基内菌丝长出的小梗上。绘图。

2．印片染色法观察 用镊子取洁净载玻片并微微加热，然后用这微热载玻片盖在长有5406 或棘孢小单孢菌的平皿上，轻轻压一下，注意将载玻片垂直放下和取出，以防载玻片水平移动而破坏放线菌的自然形态。反转有印痕的载玻片微微加热固定．用石炭酸复红染色l min，水洗，晾干。用油镜观察。绘图。注意比较两种菌的形态特征有何不同。 四、注意事项

1．培养放线菌中要注意，放线菌的生长速度较慢，培养期较长，在操作中应特别注意无菌操作，严防杂菌污染。

2．玻璃纸法培养接种时注意玻璃纸与平板琼脂培养基间不宜有气泡，以免影响其表面放线菌的生长，

3．不同观察方法中严格按要求进行，注意菌体的上下位置。 五、实验报告

1．绘图 玻璃纸法、水封片法、印片法及自然生长状态下观察的放线菌形态。 2．试比较5406 菌与棘孢小单孢菌特征的异同。 六、问题和思考

1．在高倍镜或油镜下如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝?

2．用插片法和搭片法如何制备放线菌标本，其主要优点是什么?可否用此法观察其他微生物?为什么?

3．以玻璃纸覆盖法培养和观察放线菌有何优点?试用此法设计一个观察青霉菌形态的实验。注：

(一)插片法和搭片法培养放线菌 1．插片法

(1)制平板、接种：用冷却至约50℃的高氏1 号琼脂培养基倒平板(每皿约20mL)，可用两种方法接菌：1、先接种后插片：冷凝后用接种环挑取少量斜面上的5406 菌孢子，用平板培养基的一半面积作来回划线接种(接种量可适当加大)；2、先插片后接种：用平板培养基的另一半面积进行。

(2)插片及培养：用无菌镊子取无菌盖玻片，在已接种平板上以45°角斜插入培养基内，插人深度约占盖玻片1/2 长度(图11-1A)。同时，在另一半未经接种的部位以同样方式插入数块盖玻片，然后接种少量5406 菌孢子至盖玻片一侧的基部，且仅接种于其中央位置约占盖玻片长度的一半左右，以免菌丝蔓延至盖玻片的另一侧。将插片平板倒置于28℃，培养3～7d。 2．搭片法

(1)开槽及接种：用无菌打孔器在凝固后的平板培养基上打洞数个，并将棘孢小单孢菌孢子划线接种至洞内边缘。

(2)搭片及培养：在接种后的洞面上放一无菌盖玻片，平板倒置于28℃，培养3～7d（图11—1B）。

(二)玻璃纸法固体培养5406 菌和棘孢小单孢菌

1．玻璃纸灭菌 将玻璃纸剪成比培养皿直径略小的片状，将滤纸剪成培养皿大小的圆形纸片并稍润湿，然后把 滤纸和玻璃纸交互重叠地放在培养皿中，借滤纸将玻璃纸隔开。然后进行湿热灭菌，备用。图11—1 放线菌的插片与搭片培养示意图 A. 插片法； B. 搭片法

2．制平板及铺玻璃纸 取冷凝后的高氏1 号琼脂培养基，用无菌镊子将预先灭菌的块状玻璃纸平铺至平板培养表面，铺玻璃纸时可用无菌涂布器将玻璃纸与培养基之间的气泡除去。

3．涂布菌液及培养 取0.l mL 的孢子悬液涂布在铺有玻璃纸的平板培养基表面。接种平板倒置于28℃，培养 5～7d。

实验12 酵母菌的形态观察

一、实验目的和内容

目的：了解自然存在的酵母菌及其形态结构。了解酵母菌产生子囊孢子的条件及其形态。 内容：

1．观察酵母菌个体形态。

2．观察酵母菌的假菌丝和繁殖过程。 3．观察自然状态的酵母菌。 二、实验材料和用具

酿酒酵母(Saccharomyes cerevisiae)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)斜面菌种。

PDA 培养基、麦氏(McCLary)培养基(醋酸钠培养基)、0.05%美蓝染色液(以pH6.0 的0.02mol/L 磷酸缓冲液配制)、碘液、0.04%的中性红染色液%孔雀绿，0.5%沙黄液、95%乙醇；显微镜、载玻片、擦镜纸、盖玻片、接种环、V 形玻璃棒、放置一个三角形玻璃棒支架的培养皿。

三、操作步骤 (一)酵母菌形态观察

1．酵母菌的话体染色观察及死亡率的测定

(1)以无菌水洗下PDA 斜面培养的酿酒酵母菌苔，制成菌悬液。

(2)取0.05%美蓝染色液1 滴，置载玻片中央，并用接种环取酵母菌悬液与染色液混匀，染色2～3min，加盖玻片，在高倍镜下观察酵母菌个体形态，区分其母细胞与芽体，区分死细胞(蓝色)与活细胞(不着色)。

(3)在一个视野里计数死细胞和活细胞，共计数5～6 个视野。酵母菌死亡率一般用百分数来表示，以下式来计算：死亡率=死细胞总数÷死活细胞总数×100% 2．酵母菌液泡系的话体观察 于洁净载玻片中央加一滴中性红染色液，取少许上述酵母菌悬液与之混合，染色5min，加盖玻片在显微镜下观察。细胞无色，液泡呈红色。

3．酵母菌细胞中肝糖粒的观察 将1 滴碘液置于载玻片中央，接人上述酵母菌悬液，混匀，盖上盖玻片，显微镜观察，细胞内的贮藏物质肝糖颗粒呈深红色。 4．酵母菌子囊孢子的观察

(1)活化酿酒酵母：将酿酒酵母接种至新鲜的麦芽汁培养基上，置28C 培养2～3d，然后再移植2～3 次。

(2)转接产孢培养基：将活化的酿酒酵母转接至醋酸钠培养基上，置30℃恒温培养14d。

(3)观察：挑取少许产孢菌苔于载玻片的水滴上，经涂片、热固定后，加数滴孔雀绿，lmin后水洗，加95%乙醇30S，水洗，最后用0.5%沙黄液复染30S，水洗去染色液，最后用吸水纸吸干。制片干燥后，镜检，子囊孢子呈绿色，子囊为粉红色。注意观察子囊孢子的数目、形状和子囊的形成率。

(4)计算子囊形成的百分率：计数时随机取3 个视野，分别计数产子囊孢子的子囊数和不产孢子的细胞，然后按下列公式计算：子囊形成率（%）=3 个视野中形成子囊的总数÷3 个视野中（形成子囊的总数+不产孢子细胞总数）×100%

5．酵母菌假菌丝的观察 取一无菌载玻片浸于溶化的PDA 培养基中，取出放在温室培养的支架上，待培养基凝固后，进行酵母菌划线接种，然后将无菌盖玻片盖在接菌线上(图12-1)，28℃培养2～3d 后，取出载玻片，擦去载玻片下面的培养基，在显微镜下直接观察。可见到芽殖酵母形成的藕节状假菌丝，裂殖酵母则形成竹节状假菌丝(图12-2)。图12—1 酵母菌假菌丝的培养 图12—2 酵母菌的假菌丝形态A. 藕节状假菌丝； B.竹节状假菌丝

6．自然状态下的酵母菌观察 取一滴美蓝染色液于载玻片中央，春夏秋季取酱油或淹菜上的白膜，冬季取腌酸菜汤上的白膜，将其置于载玻片染色液中，盖上盖玻片，显微镜下仔细观察酵母菌形态，出芽生殖，假菌丝等。 四、注意事项

1．用于活化酵母菌的麦芽汁培养基要新鲜、表面湿润。 2．在产孢培养基上加大移种量，可提高子囊形成率。 3．通过微加热增加酵母的死亡率，易于观察死亡细胞。 五、实验报告 (一)绘图

1．数个酵母菌细胞，示观察到的结构。 2．数个子囊及子囊孢子形态图。

(二)记录并计数酵母菌的死亡率及子囊形成率(原始记录及计算结果)。 六、问题和思考

1．酵母菌的假菌丝是怎样形成的?与霉菌的真菌丝有何区别? 2．如何区别营养细胞和释放出的子囊孢子?

3．试设计一个从子囊中分离子囊孢子的试验方案。注：

酵母菌的简易培养 配2%葡萄糖水(或自糖水)，煮沸，装入三角瓶中(液面高度2～

2cm)，加HCl 调至pH3～5 放入几块葡萄皮（或其他糖分较高的果皮），置5～28℃温箱中培养2～3d，闻到酒香味后，即可取培养液镜检。

实验13 霉菌的形态观察

一、实验目的和内容

目的：了解霉菌形态，掌握微生物载玻片湿室培养方法。 内容：1．霉菌载玻片湿室培养。 2．曲霉、青霉、根霉、毛霉形态观察。 3．根霉假根的观察。 二、实验材料和用具

产黄青霉(Penicfillium chrysogenum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黑根霉(Rhizopus

nigrians)、总状毛霉(Mucor racemosus)等斜面菌种。

半固体PDA 培养基、乳酸苯酚固定液、棉蓝染色液、20%甘油;透明胶带、剪刀、培养皿、载玻片、口形玻棒搁架、盖玻片、圆形滤纸片、细口滴管、镊子、显微镜、接种环。 三、操作步骤

(一)霉菌的载玻片湿室培养

可4 人合作，每人制作一霉菌的载玻片。

1．准备湿室 在培养皿底铺一张圆形滤纸片，其上放一“冂”形载玻片搁架，在搁 梁上放一块载玻片和两块盖玻片，盖上皿盖，外用纸包扎，经12lC 湿热灭菌30min 后，置60℃烘箱中烘干，备用。

2．接种 用接种环挑取少量待观察的霉菌孢子至湿室内的载玻片上，每张载玻片可接同一菌种的孢子两处。接种时只要将带菌的接种环在载玻片上轻轻碰几下即可(务必记住接种的位置)。

3．加培养基 用无菌细口滴管吸取少量融化约60℃的培养基，滴加到载玻片的接种处，培养基应滴得圆而薄，其直径约为0.5cm(滴加量一般以l/2 小滴为宜)。 4．加盖玻片 在培养基未彻底凝固前．用无菌镊子将皿内盖玻片盖在琼脂块薄层上，用镊子轻压，使盖玻片和载玻片间的距离相当接近，但不能压扁，否则不透气。 5．倒保湿剂 每皿倒大约3mL 20%的无菌甘油，使皿内的滤纸完全润湿，以保持皿内湿度，皿盖上注明菌名、组别和接种日期。此为制成的载玻片湿室，置28℃恒温培养3～5d。

(二)黑根霉假根的培养

将融化的PDA 培养基，冷却至50℃倒入无菌平皿，其量约为平皿高度的l/2。冷凝后，用接种环沾取根霉孢子，在平板表面划线接种。然后将平皿倒置，在皿盖内放一无菌载玻片，于28℃培养2～3d 后，可见根霉的气生菌丝倒挂成胡须状，有许多菌丝与载玻片接触，并在载玻片上分化出假根和匍匐菌丝等结构（图13—1）。图13—1 根霉假根的培养 (三)镜检观察

1．湿室培养霉菌镜检载玻片 从培养16～20h 开始，通过连续观察，可了解孢子的萌发、菌丝体的生长分化和子实体的形成过程。将湿室内的载玻片取出，直接置于低倍镜和高倍镜下观察曲霉、青霉、毛霉、根霉等霉菌的形态，重点观察菌丝是否分隔，曲霉和青霉的分生孢子形成特点，曲霉的足细胞，根霉和毛霉的孢子囊和孢囊孢子。绘图。

2．粘片观察 取一滴棉蓝染色液置于载玻片中央，取一段透明胶带，打开霉菌平板培养物，粘取菌体，粘面朝下，放在染液上。镜检。

3．假根观察 将培养根霉假根的平皿打开，取出皿盖内的载玻片标本，在附着菌丝体的一面盖上盖玻片，置显微镜下观察。只要用低倍镜就能观察到假根及从根节上分化出的孢子囊梗、孢子囊、孢囊孢子和两个假根间的匍匐菌丝，观察时注意调节焦距以看清各种构造。

4．制成永久装片 把观察到霉菌形态较清晰，完整的片子，制成标本作较长期保存。制备方法是，轻轻揭去盖玻片，如果载玻片上有琼脂，仔细挑去，然后滴加少量乳酸苯酚固定液，盖上清洁盖玻片，在盖玻片四周滴加树胶封固。 四、注意事项

载玻片湿室培养时，盖玻片不能紧贴载玻片，要彼此有极小缝隙，一是为了通气；二是使各部分结构平行排列，易于观察。 五、实验报告 (一)绘制镜检形态图

1．毛霉和根霉形态图，示各部。 2．青霉和曲霉形态图，示各部 （二）载玻片观察记录

各菌种的载玻片标本观察结果：菌种 菌丝体

（气生菌丝、营养菌丝的粗细、色泽、菌丝有隔或无隔等）无性孢子特征（孢子 梗的分化特征，孢子着生特征等）其他特征结构（有无假根、足细胞匍匐菌丝、囊轴等） 六、问题和思考

1．什么叫载玻片湿室培养?它适用于观察怎样的微生物，有何优点?

2．湿室培养时为何用20%甘油作保湿剂?

3．本实验中观察假根的设计原理是什么?此设计还适合于培养哪类菌。

实验14 细菌大小的测定

一、实验目的和内容

目的：学会测微尺的使用和计算方法及对球菌和杆菌的测量。 内容：1. 认识测微尺，学习目镜测微尺的标定。 2．测定金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌体的大小。 二、实验材料和用具

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的玻片标本。香柏油、二甲苯；显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、擦镜纸。 三、操作步骤

l．测微尺的构造 显微镜测微尺是由目镜测微尺和镜台接物测微尺组成，目镜测微尺是一块圆形玻璃片，其中有精确的等分刻度，在5mm 刻尺上分50 份(图14 一lC)。目镜测微尺每格实际代表的长度随使用接目镜和接物镜的放大倍数而改变，因此在使用前必须用镜台测微尺进行标定。镜台测微尺为一专用中央有精确等分线的载玻片(图14—1A)，一般将长为1mm 的直线等分成100 个小格，每格长0.0lmm 即10μm，是专用于校正目镜测微尺每格长度的。

2．目镜测微尺的标定 把目镜的上透镜旋开，将目镜测微尺轻轻放在目镜的隔板上，使有刻度的一面朝下。将镜台测微尺放在显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上。先用低倍镜观察，调焦距，待看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度相平行，并使两尺左边的一条线重合，向右寻找另外一条两尺相重合的直线(图15—lB)。 3．计算方法

标定公式：目镜测微尺每格长度（μm）=两条重合线间镜台测微尺的格数×10 ÷两条重合线间目镜测微尺的格数例如，目镜测微尺20 个小格等于镜台测微尺3 小格，已知镜台测微尺每格为10μm，则3 小格的长度为3×10=30μm，那么相应地在目镜测微尺上每小格长度为3×10÷20=1.5μm。用以上计算方法分别校正低倍镜、高倍镜及油镜下目镜测微尺每格实际长度。

4．菌体大小的测定 将镜台测微尺取下，分别换上大肠杆菌及金黄色葡萄球菌玻片标本，先在低倍镜和高倍镜下找到目的物，然后在油镜下用目镜测微尺测量菌体的大小。先量出菌体的长和宽占目镜测微尺的格数，再以目镜测微尺每格的长度计算出菌体的长和宽。并详细记录于表15-1 中。例如，目镜测微尺在这架显微镜

5．计数

培养48h 后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算，每毫升中菌落形成单位(cfu)=同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5一般选择每个平板上长有30~300 个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适。同一稀释度的三个重复对照的菌落数不应相差很大，否则表示试验不精确。实际工作中同一稀释度重复对照平板不能少于三个，这样便于数据统计，减少误差。由10-4、10-5、10-6 三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的。一般以三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板培养后所出现的平均菌落数在50 个左右为好，否则要适当增加或减少稀释度加以调整。平板菌落计数法的操作除上述倾注倒平板的方式以外，还可以用涂布平板的方式进行。二者操作基本相同，所不同的是后者先将牛肉膏蛋白胨培养基融化后倒平板，待凝固后编号，并于37℃左右的温箱中烘烤30min，或在超静工作台上适当吹干，然后用无菌吸管吸取稀释好的菌液对号接种于不同稀释度编号的平板上，并尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20～30min，使菌液渗入培养基表层内，然后倒置37℃的恒温箱中培养24～48h。涂布平板用的菌悬液量一般以0.1ml 较为适宜，如果过少菌液不易涂布开，过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落。 五、实验报告 1．结果

2．将培养后菌落计数结果填入下表

稀释度 10-4 10-5 10-6Cfu 数/平板1 2 3 平均1 2 3 平均1 2 3 平均每毫升中的cfu 2．思考题

(1)为什么融化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板? (2)要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键?为什么? (3)试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点及应用。

(4)当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题出在哪里?

(5)用倒平板法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不同?为什么要培养较长时间(48h)后观察结果? 三 光电比浊计数法 一、目的要求

1．了解光电比浊计数法的原理。

2．学习、掌握光电比浊计数法的操作方法。 二、基本原理

当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。在一定的范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由光电池精确测出(图15-4)因此，可用一系列已知菌数的菌悬液测定光密度，作出光密度—菌数标准曲线。然后，以样品液所测得的光密度，从标准曲线中查出对应的菌数。制作标准曲线时，菌体计数可采用血细胞计数板计数，平板菌落计数或细胞干重测定等方法。本实验采用血细胞计数板计数。光电比浊计数法的优点是简便、迅速，可以连续测定，适合于自动控制。但是，由于光密度或透光度除了受菌体浓度影响之外，还受细胞大小、形态、培养液成分以及所采用的光波长等因素的影响。因此，对于不同微生物的菌悬液进行光电比浊计数应采用相同的菌株和培养条件制作标准曲线。光波的选择通常在400~700nm 之间，具体到某种微生物采用多少还需要经过最大吸收波长以及稳定性试验来确定。另外，对于颜色太深的样品或在样品中还含有其他干扰物质的悬液不适合用此法进行测定。图15—4 比浊法测定细胞浓度的原理 （三）器材

1．菌种 酿酒酵母培养液

2．仪器或其他用具 721 型分光光度计，血细胞计数板，显微镜，试管，吸水纸，无菌吸管，无菌生理盐水等。 （四）操作步骤 1．标准曲线制作

（1）编号 取无菌试管7 支，分别用记号笔将试管编号为1、2、3、4、5、6、7。 （2）调整菌液浓度 用血细胞计数板计数培养24 小时的酿酒酵母菌悬液，并用无菌生理盐水分别稀释调整为每毫升1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、10×106、12×106 含菌数的细胞悬液。再分别装入已编好号的1 至7 号无菌试管中。

（3）测OD 值 将1 至7 号不同浓度的菌悬液摇均匀后于560nm 波长、1cm 比色皿中测定OD 值。比色测定时，用无菌生理盐水作空白对照，并将OD 值填入下表管号 1 2 3 4 5 6 7 8细胞数106/ml光密度（OD）每管菌悬液在测定OD 值时均必须先摇匀后再倒入比色皿中测定

(4)以光密度(OD)值为纵坐标，以每毫升细胞数为横坐标，绘制标准曲线。 2．样品测定

将待测样品用无菌生理盐水适当稀释，摇均匀后，用560nm 波长、lcm 比色皿测定光密度。测定时用无菌生理盐水作空白对照。各种操作条件必须与制作标准曲

线时的相同，否则，测得值所换算的含菌数就不准确。 3．根据所测得的光密度值，从标准曲线查得每毫升的含菌数。 （五）实验报告 l．结果

每毫升样品原液菌数=从标准曲线查得每毫升的菌数×稀释倍数 2．思考题

(1)光电比浊计数的原理是什么?这种计数法有何优缺点? (2)光电比浊计数在生产实践中有何应用价值?

(3)本实验为什么采用560nm 波长测定酵母菌悬液的光密度?如果你在实验中需要测定大肠杆菌生长的OD 值，你将如何选择波长? 四 大肠杆菌生长曲线的测定 (一)目的要求

1．通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物特征和规律，绘制生长线。 2．复习光电比浊法测量细菌数量的方法。 (二)基本原理

大多数细菌的繁殖速率很快，在合适的条件下，一定时期的大肠杆菌细胞每20min 分裂一次。将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期，对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。测定细菌的生长曲线，了解其生长繁殖规律，这对人们根据不同的需要，有效地利用和控制细菌的生长具有重要意义。用于测定细菌细胞数量的方法已在上述实验作了介绍。本实验用分光光度计(spectrophotometer)进行光电比浊测定不同培养时间细菌悬浮液的OD 值，绘制生长曲线。也可以直接用试管或带有测定管的三角瓶(图15-5)测定“klett units”值的光度计。如图15—6所示，只要接种1 支试管或1 个带测定管的三角瓶，在不同的培养时间(横坐标)取样测定，以测得的klett units 为纵坐标，便可很方便地绘制出细菌的生长曲线。如果需要，可根据公式1 klett units=OD/0.002 换算出所测菌悬液的OD 值。图15—5 带侧臂试管的三角烧瓶 (三)器材 1．菌种 大肠杆菌

2．培养基 LB 液体培养基70ml，分装2 支大试管(5ml/支)，剩余60ml 装入250ml的三角瓶。

3．仪器或其他用具 722 型分光光度计，水浴振荡摇床，无菌试管，无菌吸管等。

图15—6 直接用试管测OD 值 (四)操作步骤 1．标记

取11 支无菌大试管，用记号笔分别标明培养时间，即0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16 和20h。 2．接种

分别用5ml 无菌吸管吸取2.5ml 大肠杆菌过夜培养液(培养10~12h)转入盛有50ml LB液的三角瓶内，混合均匀后分别取5ml 混合液放入上述标记的11 支无菌大试管中。 3．培养

将已接种的试管置摇床37℃振荡培养(振荡频率250r/min)，分别培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16 和20h，将标有相应时间的试管取出，立即放冰箱中贮存，最后一同比 浊测定其光密度值。 4．比浊测定

用未接种的LB 液体培养基作空白对照，选用600nm 波长进行光电比浊测定。从早取出的培养液开始依次测定，对细胞密度大的培养液用LB 液体培养基适当稀释后测定，使其光密度值在0.1~0.65 之内(测定OD 值前，将待测定的培养液振荡，使细胞均匀分布)。本操作步骤也可用简便的方法代替：1．用1ml 无菌吸管取0.25ml 大肠杆菌过夜培养液转入盛有3~5ml LB 液的试管中、混匀后将试管直接插入分光光度计的比色糟中，比色糟上方用自制的暗盒将试管及比色暗室全部罩上，形成一个大的暗环境，另以1 支盛有LB 液但没有接种的试管调零点，测定样品中培养0h 的OD 值。测定完毕后，取出试管置37℃继续振荡培养。

2．分别在培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16 和20h，取出培养物试管按上述方法测定OD 值。该方法准确度高、操作简便。但须注意的是使用的2 支试管要很干净，其透光程度愈接近，测定的准确度愈高。(五)实验报告 1．结果

(1)将测定的OD600 值填入下表：培养时间(h) 对照 0 1.5 3 4 6 8 10 12 14 16 20光密度值OD600

(2)绘制大肠杆菌的生长曲线。 2．思考题

(1)如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有什么不同？两者各有什么优缺点？培养时间/hOD600 值

(2)细菌生长繁殖所经历的四个时期中，哪个时期其代时最短？若细胞密度为

103/ml，培养4.5h 后，其密度高达2×108/ml，计计算出其代时。

(3)次生代谢产物的大量积累在哪个时期？根据细菌生长繁殖的规律，采用哪些措施可使次生代谢产物积累更多？

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