端粒长度检测方法
更新时间:2023-10-03 01:21:01 阅读量: 综合文库 文档下载
端粒长度检测方法:
实时荧光定量PCR分两部分进行,分别测定端粒和内参基因RPLPO(核糖体大亚基PO蛋白基因)的Ct值,每次反应需要设定标准曲线。端粒(T)重复拷贝数与单拷贝基因(S)的比率,即T/S比率可以得出端粒的相对长度,而T/S比率与端粒长度成正比关系。T/S计算公式如下:
T/S= [2CT(telomeres)/2CT(single copy gene)]=2-ΔCT
1基因组DNA的提取
1. 提取人外周血基因组DNA
以试剂盒提取获得人外周血基因组DNA。
2实时荧光定量PCR测定DNA端粒长度
1. 引物序列
端粒 Tel 1:浓度675 nmol/L
序列 5’-GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGT-3’
端粒 Tel 2:浓度1350 nmol/L
序列5’-TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA-3’
RPLPO基因 hRPLPO1:浓度800 nmol/L
序列5’-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA -3’
RPLPO基因 hRPLPO2:浓度800 nmol/L
序列5’-CAGCAAGTGG-GAAGGTGTAATCC -3’
2. 标准曲线制作
选取同一血样基因组DNA为标准品,使用等比稀释,稀释系数为2,浓度范围为:0.25-64ng/μl,即可稀释得9个浓度梯度,分别为64,32,16,8,4,2,1,0.5,0.25 ng/μl,制作的标准曲线R2>0.98。
3. 反应体系 (每个样设置品三个重复)
10μl反应体系
gDNA
Master Mix (quantiTect SyberGreen PCR kit)
10ng Up to 10μl
注:内参及样品反应体系中,Master Mix 除了引物不同外,其余成分均相同
另一文献所述的反应体系
25μl反应体系
SYBR Premix Ex Taq (2X)
gDNA 端粒Tel 1 (内参基因 hRPLPO1) 端粒Tel 2 (内参基因 hRPLPO2)
dH2O
12.5μl
1.0μl (约60ng/μl) 0.625μl (1μl) 2.25μl (1μl)
Up to 25μl
4. PCR反应条件
95℃ 10 min 95℃ 15 sec 54℃ 2 min
54℃检测荧光强度,35个循环 72℃ 10min
参考文献:
[1]Sonia Garc?′a-Calzo′n,Adriana Moleres,Ascensio′ n Marcos et al. Telomere Length as a Biomarker for Adiposity Changesafter a Multidisciplinary Intervention in Overweight/ Obese Adolescents: The EVASYON Study
[2]吕昆,林丹,许淼 等.应用实时荧光定量PCR测定牛体细胞端粒长度 [3]王敏敏,杨浩,刘广义 等.荧光定量PCR测定端粒长度
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