药理学读书报告

标题：BNC通过ERK1/2 信号通路保护H9c2 免受CardiomyoblastsH2O2-Induced氧化损伤

摘要：Buchang naoxintong胶囊(BNC)是一种中药批准用于治疗脑血管和心血管疾病。然而,人们很少知道特定的保护作用或BNC防止心肌损伤的机制。本研究旨在调查BNC在H2O2 诱导的H9c2鼠cardiomyoblasts的体外模型中的心血管效应。在这项研究中使用的是BNC肠道吸收液，而不是含药血清或提取液。我们的研究显示，BNC预处理通过增加total-antioxygen、total-superoxide歧化酶、过氧化氢酶的活动，和通过减少活性氧和丙二醛的生产能增强抗氧化功能。BNC预处理也能激活细胞外signal-regulated激酶(ERK1/2)和抑制apoptosis-related蛋白质如保利ADP-ribose聚合酶(PARP)和caspase-3。此外，加入BNC的预培养降低细胞内钙离子浓度，改善线粒体膜电位，降低H9c2细胞的凋亡率。这些数据表明,BNC 通过增加抗氧化能力，激活ERK1/2，阻塞Ca2 + -dependent 和mitochondria-mediated凋亡而保护H9c2 cardiomyoblasts免受H2O2-induced氧化损伤。基于我们的研究结果，BNC保护H9c2细胞免受氧化损伤的效力与曲美他嗪相似。

1。介绍：氧化应激在几个主要的心血管疾病如动脉粥样硬化、高血压、心

力衰竭、心肌ischemical再灌注损伤起关键作用。明显的氧化应激导致的活性氧(ROS),过度产生，,这是一个在心血管疾病的发展中重要的事件。活性氧积累可能导致许多心血管疾病。细胞活性氧的来源主要是线粒体电子传递链、黄嘌呤氧化酶、NADPH氧化酶、脂氧合酶/环氧酶、一氧化氮合酶以及各种物质的自氧化尤其是儿茶酚胺类。

增加活性氧对心肌细胞造成重大损害，通过抗氧化分子如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)能拮抗这种损害。这些抗氧化剂分子能对抗氧化，在维持细胞内环境稳定中发挥至关重要的作用。此外，ROS通过产生脂质过氧化作用损害细胞膜。丙二醛(MDA)是一个主要的脂质过氧化作用的产品，能反映出细胞损伤的程度。

据报道，细胞外signal-regulated激酶(ERKs)在一些细胞类型的氧化应激中被激活，在细胞功能的许多方面扮演了一个重要的角色。在心肌细胞中激活ROSERK1/2介导一系列活动包括代谢、迁移、炎症、细胞存活和细胞死亡。事实上,DNA微阵列数据显示,近100个基因参与细胞对氧化应激的反应。事实上，DNA微阵列数据显示,近100个基因参与细胞对氧化应激的反应。

Buchang naoxintong胶囊(BNC)由16个各种中药组成包括黄芪、丹参、当归、赤芍、四川独活草粉末、桃仁、红花,素乳香、没药、Spatholobus suberectus,牛膝根,桂枝,桑树枝,蚯蚓,蝎子,水蛭。它是一个通过批准用于治疗中风和心绞痛的中药。BNC通过减少脂质浓度和抑制树突状细胞的成熟避免小鼠动脉粥样硬化。BNC也能增加CYP2C19酶的催化活性。BNC和氯吡格雷增强CYP2C19?2基因突变患者的抗血小板效应。BNC已被证明对心脏和血管疾病有保护作用。然而，BNC心血管活动的细胞和分子机制尚未阐明。

在这项研究中，通过暴露H9c2细胞到过氧化氢中诱导氧化应激。治疗包括BNC肠道吸收液而不是提取溶液或含药血清。曲美他嗪(TMZ)是一个常见的控制心脏病人,心绞痛的药物。

2、材料和方法：

（1）成年男性的雄性sd大鼠中称重210g 左右。3

-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)2、5-diphenyltetrazolium溴化(肽),TMZ,过氧化氢溶液、The JC-1 商业设备、2′,7′二乙酸-dichlorofluorescein(DCFH-DA)探针,total-antioxygen容量(T-AOC)工具包,总超氧化物歧化酶(T-SOD)工具包,猫工具包,MDA工具包、 BNCs。

（2）、制备BNC肠道吸收液和治疗大鼠肠道

将100克BNC粉溶解在2000毫升95%的乙醇，加热溶液沸腾回流2小时(h)，然后过滤。在滤液中加水至200毫升，然后将BNC提取液用旋转蒸发器蒸发，直到几乎完全干燥。加入Tyrode缓冲溶液（8.00克氯化钠,氯化钾8.00 g,NaHCO3 8.00 g,NaH2PO4 0.05 g,MgCl2 0.10克,0.20 g、葡萄糖1.00 g,pH值7.4）到BNC提取液中使溶液达到600毫升。老鼠在实验前禁食12 h。麻醉后，,每个大鼠的小肠很快被删除。把洗了Tyrode缓冲溶液(0°C)肠子,切成四14厘米段，每一段被由内而外在一端结扎成一个囊。装满Tyrode缓冲区的囊在马格努斯的浴中孵化5分钟达到平衡。缓冲区是然后用BNC溶液(25毫升)交换，温度维持在37°C，不断注入O2 / CO2(95% / 5%)。2 h后，包含吸收成分(2毫升)的Serosal-side溶液被排放到管道中。BNC肠道吸收液通过microfiltrate膜(0.22μm),过滤，存储在?20°C。最初的BNC肠道吸收液的浓度是1毫克/毫升(药材)。

（3）、液相色谱法：BNC肠道吸收液通过一个带有水域ACQUITY C18柱（2.1mm X150mm,1.7μm)的超高液相色谱(UPLC)分析，流动相由乙腈和

梯度洗脱流速为0.3毫升/分钟的0.5%甲酸组成。检测波长被设定在235、280、324和400nm，注射量是2μL，温度维持在30°C。

（4）、细胞培养和治疗：H9c2细胞系在中国的北京协和医学院的细胞资源中心得到，细胞培养在补充有10%胎牛血清(杭州四季青,中国),

的high-glucose DMEM(美国表达载体)中，37°C湿润5%二氧化碳气氛结合penicillin-streptomycin。近80%的细胞融合，然后用不同浓度的BNC处理24h,然后加入100?μM H2O2 1?h。

（5)、利用MTT测定：过氧化氢的最佳浓度和应用时间，BNC 对H9c2细胞的保护作用由MTT试验确定。被处理之前，细胞被胰蛋白酶化分散和播种在(8000 - 10000)细胞。随后，把20μL肽溶液(5毫克/毫升)添加到每个well,在37°C,下孵化4 h。弃去上层清液，,不溶性甲瓒产品于溶解150μL DMSO溶液。每个培养的well被酶标(分子器件、美国)在波长570 nm下测定。 （6）、H9c2细胞溶解产物的生化分析：胰蛋白酶化后H9c2细胞被调整1×106cell/mL，用phosphate-buffered盐水洗净(PBS)两次，并在1500转/分钟超速离心 10分钟。弃去上清液，用超声波粉碎离心沉淀。酶标测定 T-AOC, T-SOD, CAT, 和 MDA。用BCA布拉德福德蛋白质测定(皮尔斯,美国)测定蛋白质含量。

（7）、检测细胞内ROS：用DCFH-DA探针测量细胞内ROS 。用10μM DCFH-DA孵化消化H9c2细胞悬浊液30分钟，然后用PBS水洗洗三次去除残留的探针。用荧光酶标(美国分子设备)测定细胞荧光强度，激发和发射波长分别设定在488 nm和525 nm,。

结果：在BNC 提取液中发现11种成分

3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑嗅盐[3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromideMTT

BNC在H9c2 损伤细胞通过诱导早ERK1/2早期磷酸化能产生抗氧化的作用。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/iz8x.html