PLFA测定方法2015

PLFA

试剂及配制：

3.1 氯仿 3.2 甲醇 3.3 正己烷

3.4 0.2 mol/L KOH 甲醇溶液：0.34g KOH溶于30ml甲醇；

3.5 1M 冰醋酸：1.74ml冰醋酸溶于30 ml去离子水(现用现配)； 3.6 1：1 = 甲醇：甲苯(现用现配)(30ml)； 3.7 0.15M pH=4.0 柠檬酸缓冲液：准确称取20.66g柠檬酸，柠檬酸钠15.23g，加去离子水定容至1000ml。 3.8 提取液-柠檬酸缓冲液:氯仿:甲醇=0.8:1:2(v/v/v)(约850ml)。

3.9 硅胶柱(0.8克，100-200 目)：于120℃烘干2小时进行活化,并于干燥器中保存； 3.10 Nonadecanoic acid methyl ester (19:0, Sigma)：190ug/ml;

Supelcoe 37 Component FAME Mix： 1000μg/ml;

Supelcoe BAME (Bacterial Acid Methyl Esters) mix:1000μg/ml。

上GC前：取30μl 19:0脂肪酸甲酯 + 150μl 37Componet FAMEs]定量标准。

仪器: 气相色谱一台；高纯N2；N2吹扫系统；真空干燥器；5ml衍生瓶；气谱上样瓶；150ul内插衬管；

90ml带盖玻璃离心管；玻璃吸管；

测定步骤：

步骤1.

所用有的器皿：去离子水和正己烷洗，玻璃管用锡箔纸包好，并编号； 土壤样品冻干后，于干燥器中保存。 步骤2 从全土样品中提取脂肪酸

第一天 (6个样品+1个控制样+1个空白；每个样品三次重复) 1. 准确称取冻干土样5克，倒入50ml玻璃三角瓶

? 土壤样品重量应该准确记录

? 不同样品或处理编号应该一一对应 ，且应防止字迹被有机溶剂溶去。 2. 用防毒面具：于每个样品管中加浸提液20ml; 3. 4. 5. 6. 7. 8.

避光振荡2小时：小心放置以期达到最佳振荡效果。 25℃，2500 rmp离心10分钟。 尽可能于避光!：上清加入50ml具盖离心管中，于离心管外壁与盖上清楚地标记编号； 并于土壤沉淀中再次加入浸提液12ml，充分振荡1小时； 提取液再次离心，将上清合并；

于合并的上清液中加入8.6ml柠檬酸缓冲液，10.6ml 氯仿；

9. 振荡离心管1分钟(盖子盖紧)，定时放气(vent periodically)； 10. 于黑暗(外加铝箔)中静置过夜，使两相分离；远离热源。 第二天

1.用防毒面具：用吸管将上层(约2/3)吸出，尽可能多地将上层吸出。不同土壤样品用不同的吸管，保留下层的氯仿层，在氯仿层中勿留水相(水分子会攻击脂肪酸的双键)。 2.用N2将氯仿层吹干，尽量避免光干扰。可以辅以加热，但温度不宜过30℃ (若中途要停止N2吹干 ，则应保证装有氯仿层的离心管充满N2。因为空气中的氧可以损坏脂肪酸的结构 )。

步骤3. PLFA的硅酸柱的分离 第三天

1. 硅胶的活化：将已经装好硅酸胶(0.8克)的玻璃柱于120℃烘干2小时；冷却后于干燥器内备用。

2. 用防毒面具：用5 ml氯仿预处理柱子；

3. 将提取物以氯仿5ml(至少分5次)转移到柱中；

4. 加8ml氯仿于硅胶柱中。并使其在重力作用下流出。 5. 加16ml丙酮(分两次加入，一次8ml)；不要完全排干硅酸柱 6. 用甲醇清洗柱子出口。

7. 用接收瓶收集PLFA；而氯仿与丙酮洗脱液可以废弃不要。

8. 在硅酸柱中加8ml 甲醇，收集甲醇洗脱液；并于收集管上标明样品编号与日期。 9. 在N2下吹干甲醇。-20℃，黑暗冷藏。 步骤4 酯化

第 4天 (40个样品，约用时3/4天)

1. 用防毒面具：将冻干的脂类样品溶解在1ml甲醇：甲苯(1:1)和1ml 0.2 M KOH 甲醇溶

液；在加入液体时，应直接加入管的底部，并短暂混均； 2. 3. 4. 5. 6.

加热至35℃，15分钟 (水浴时，应避免甲苯等有机溶剂漏出而至污染) ； 冷却至室温!

2 ml 去离子水和0.3ml 1 M HAC，加2ml正己烷，旋涡混匀30S， 提取上层甲基酯化脂肪酸(FAMEs) ； 2500rmp,离心10分钟；

将上层正己烷溶液转移至4ml 具盖的GC衍生瓶中。每个样品用一个吸管，以防止污染。注意编好号。不要将任何下层的物质转移至衍生瓶中!可以为此而损失部分上层正己烷相!

重复步骤4 ～ 6一次。这样可以洗去水相，并将所有的脂类全部转移。

7.

8. 合并正己烷，35℃N2 吹干，- 20 ℃、黑暗中保存。 9. GC分析前，加入适量(150μl)正己烷溶解，加50μl 160μg/ml 19：0甲基酯作内标。取50μl 19:0脂肪酸甲酯 + 150μl 37Componet FAMEs]定量标准。 步骤 5. 转移至GC瓶中

第6天 :将5每个样品分装入两个2ml的GC衍生瓶中(最好内部有衬管)；以便在有对突发事件时，仍然有剩余的样品而有再次重复的余地。

步骤6. GC分析

色谱条件：HP-5柱(30.0m×320um ×0.25um)，进样量1ul，分流比10:1，载气（N2）流速0.8ml/min。 初始温度140℃维持3min，分四个阶段程序性升温：140～190 ℃, 4 ℃/min，保持1min；190～230 ℃，3℃/min，保持1min；230～250 ℃，2℃/min，保持2min；250～300℃,10℃/min，保持1min。火焰离子检测器（FID）检测。 注意事项

1. 所有容器应避免用洗衣粉清洗；在使用前应用正己烷清洗并烘干；

2. 在由土壤样品中提取PLFA之前，应加入未酯化内标物，以便定量测定土壤样品中的PLFA及其回收率。 3. 整个过程应该避光、防水、防热 、氧气。

4. 在用玻璃柱中装硅胶时，要注意检查柱下口是否有渗漏处，以防止脂肪酸的损失或走干；柱下口以玻璃丝封柱，以必防止硅胶漏出。

5. 在用氯仿等有机溶剂时，应小心，以防止中毒!

6. 由于提取液中有甲醇、氯仿等有机溶剂，因此要避免挥发!! 7. 应该至少带两个空白作为对照!!!

8. 注射器、针头、封柱 胶塞等需要用正己烷洗净并事先烘干。 9. 土壤样品克数不宜太多，应根据玻璃离心管大小来确定。

10. 冷热交替变化时，注意湿度稳定后再开启盛有冻干后的脂肪酸样品，否则水汽会在冷凝后结于容器底部而破坏样品。

注意事项 第一天：

第二天：氮气吹干的流速不能过大，否则会使其粘在试管壁上，第三天溶解时不易溶解 第三天：甲醇清洗过之后加一点氯仿，注意氮气流速，另外加氯仿溶解时在漩涡混匀器上充分混匀

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