细胞冻存和复苏

细胞的冻存

细胞深低温保存的基本原理是：在－70℃以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。细胞低温保存的关键，在于通过0~20℃阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。 总的原则是缓慢冻存！！！ 一 材料：

生长良好之培养细胞，新鲜培养基，DMSO，无菌塑料冷冻保存管，血球计数盘与盖玻片。

二步骤：

2.1 冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形，最好细胞应该处于对数生长期。 2.2. 配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5–10％，混合均匀，置于室温下待用。避免因临时配制产热而伤害细胞。

2.3. 依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞与冻存管内，取少量细胞悬浮液(约0.1 mL)计数细胞浓度。

2.4. 先将冻存管放入4℃冰箱，约40min。

2.5 接着置于–20℃冰箱，约30–60min。20 °C 不可超过1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入–80°C 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 2.6. 置于–80超低温冰箱中放置过夜。 2.7. 置于液氮罐中长期保存。

2.8 同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。 三 注意事项：

3.1. 使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破坏它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。混合DMSO要快，因为DMSO对细胞有毒性，混合之后应尽快冻存，提醒各位注意的是加入冻存液后一定要混匀，防止DMSO沉淀。冻存液比例：培养基7：血清2：DMSO1，也有将血清比例加大的做法，有的甚至将血清提高到90%，具体浓度视经验而定，但是好多人认为小牛血清含量越高越好！

3.2. 不宜将冻存细胞放置在0℃～–60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是―危险温区‖。可以先在泡沫上打孔，把冻存管塞进去。这样降温可以慢一点，当然包上棉花也是不错的主意。

3.3 . 注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。

3.4 –20°C不可超過1小時，以防止冰晶過大而造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟，冷凍管

置於厚保麗龍內，直接放入–80°C冰箱中，但存活率會降低一些。但是大多数人：4度半小时，—20度半小时，—80度过夜，液氮保存。

3.5 冷凍管內細胞數目一般至少為10*6–7/mL以上，冻存细胞健康程度一般要求活细胞在95%以上，细胞活力差的在冻存后的成活机率很小，因此，一定要在细胞旺盛分裂时期冻存。 3.6 细胞冻存管一般有1.5–2mL左右体积，原则上可以存放1.5mL充满均匀悬浮细胞的冻存液，一些人喜欢灌注1–1.5mL冻存液冻存，这实际上并不好。原因如下：冻存液冻存需要一段时间，如果这段时间冻存管倾斜，液体容易流到管口，很容易在后续的操作中造成污染。建议0.5–1mL之间即可。但是还是用1.5mL的话，具体操作时，冻存管直立起来放在–20的冰箱里，这样不容易造成污染。

同时冻存细胞的时候，一定加上封口膜，这样可以避免复苏的时候，水浴箱里的水进入盖

子的缝隙中！冻存管外面用封口膜封上后，最好再用白胶布再封一下。这样可以防止细胞复苏时，封口膜崩裂，水浴箱中的水进入冻存管。

3.7 提醒：细胞冻存在–4度，或－20时就忘了，我干过好几次这样的事（这几次细胞种很好，很心疼），其实可以将冻存细胞时用厚厚的棉花把冻存管包起来，直接放进－70度冰箱，复苏效果也不错。

3.8 注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22 micronFGLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol 亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。

细胞冻存和复苏

细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经

费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。

冻存和复苏的原则：慢冻快融

当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并

在细胞内形成冰晶。

如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。 慢冻程序

标准程序：当温度在-25 ℃以上时，1～2 ℃/min 当温度达-25 ℃以下时， 5～10 ℃/min 当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中

简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2 ℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。

更简单的：也可以在冻存细胞时用厚厚的棉花把冻存管包起来，直接放进－70度冰箱，复苏效果也不错。

在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO，它是一

种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。

细胞冻存步骤

1、预先配制冻存液： 含20%血清培养基、10% DMSO；冷冻保护剂浓度为5 或10% DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。

2、取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ～ 5 ×106细胞/mL)；

3、加入1mL细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。为了保证培养细胞系的完整性，必须进行详细的实验记录，应包括以下内容：细胞系的种类及来源、有无污染（如细菌，病毒，支原体）、细胞代数和倍增时间、以及选择性突变。

4 年后，存活率可达80％～90％。DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细

胞。

细胞复苏方法

1 操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。

2 自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧。

3 将新鲜培养基置于37°C 水槽中回温，回温后喷以70 % 酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。 4 取出冷冻管，立即放入37°C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化，以70 % ethanol 擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。注意水面高度不可接近或高过冷冻管之盖沿，否则易发生污染。

5 用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。取出0.9 mL 解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例1:10～1:15)，混合均匀，放入CO2培养箱培养。另取0.1 mL 解冻细胞悬浮液作存活测试。

6 解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO 或glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10 mL 培养基之离心管内，离心1,000 rpm, 5 分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2 培养箱培养。(一定要用这么多培养基清洗么，其他缓冲溶液是否可以呢？)

细胞计数：细胞浓度以5×105/mL为宜。将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内

继续培养。

7 若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。

8 细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。

细胞欲冷冻保存时，细胞浓度应该多少？ 1. normal human fibroblast: 1~3 ×106 cells/mL

2. hybridoma: 1~3 × 106 cells/ mL，细胞浓度不要太高，某些hybridoma 会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。

3. adherent tumor lines: 5~7 × 106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma 解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1-3 × 106 cells/mL。

4. other suspensions: 5~10 × 106 cells/mL, human lymphocyte 须至少5 × 106 cells/mL。

冷冻管内细胞数目一般为5~10 ×106 cells/mL，融合瘤细胞则以5x106 cells/mL为宜。

Thawing of Cells / Initiation of Culture Process

1. The recommended seeding density for HMVEC-D, HMVEC-dLy, HMVEC-dBl, HMVEC-L, HMVEC-LLy, HMVEC-LBl, HMVEC-Bd, HMVEC-C and UtMVEC-Myo is 5,000 cells/cm2 and the recommended seeding density for HUVEC, HCAEC, HPAEC, HAEC, HIAEC, HUAEC, bAEC, bCAEC, and bPAEC is 2,500 to 5,000 cells/cm2.

2. To set up cultures calculate the number of vessels needed based on the recommended seeding density and the surface area of the vessels being used. Add the appropriate amount of medium to the vessels (1 ml/5 cm2 ) and allow the vessels to equilibrate in a 37°C, 5% CO2, humidified incubator for at least 30 minutes. Do not seed cells into a well plate directly out of cryopreservation.

3. Wipe cryovial with ethanol or isopropanol before opening. In a sterile field, briefly twist the cap a quarter turn to relieve pressure, then retighten. Quickly thaw the cryovial in a 37°C water bath being careful not to submerge the entire vial. Watch your cryovial closely; when the last sliver of ice melts remove it. Do not submerge it completely. Thawing the cells for longer than 2 minutes results in less than optimal results.

4. Resuspend the cells in the cryovial and using a micropipette, dispense cells into the culture vessels set up earlier. Gently rock the culture vessel to evenly distribute the cells and return to the incubator. 5. Centrifugation should not be performed to remove cells from cryoprotectant cocktail. This action is more damaging than the effects of residual DMSO in the culture.

---------Clonetics? Endothelial Cell Systems Instructions for Use

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/iyp2.html