有机磷酸酯类中毒及解救

有机磷酸酯类中毒及解救

Toxication and Detoxication of Organophosphates

【目的和原理】 观察有机磷酸酯类（ organophosphates）中毒的症状，理解解救药阿托品、 解磷定的解救作用及机制。掌握家兔耳缘静脉注射的方法。

Organophosphates通过抑制胆碱酯酶（ cholinesterase，AChE）活性，使乙酰胆碱

（acetylcholine，ACh）在体内堆积，产生中毒症状。抗胆碱药阿托品能解除有机磷酸酯类 中毒的 M样症状，而解磷定可复活 AChE，恢复其水解ACh的能力，对M及N 样症状均有效， 以缓解骨骼肌震颤的效果最快，两药合用可提高解救效果。 【实验动物】家兔，体重2.5～3.0kg。

【实验器材和药品】兔固定箱、测瞳尺、听诊器、注射器（5ml、10ml、20ml）、针头、兔耳 夹、脱脂棉球、台秤、722分光光度计、恒温水浴箱、试管及试管架、加样器、 effendorff 管、滤纸。

10%美曲膦酯[敌百虫( depterex)]、0.05%硫酸阿托品（ atropine sulfate）、2.5%解磷定 （pyridine aldoxime methiodide,PAM）、生理盐水（ saline）。 【实验步骤和观察项目】

1．健康家兔5只 ，称体重，分为5组，分别为空白对照组（甲）、模型组（乙）、给 解救药组：atropine组（丙）、PAM组（丁）、atropine + PAM组（戊），观察并记录各组家兔

的活动情况：呼吸（频率、幅度、肺呼吸音、有无呼吸困难，呼吸道有无分泌物等），瞳孔 大小（ pupillary size），唾液分泌（ salivary secretion），大小便（ urination and defecation），肌

张力（muscular tension）及有无肌肉震颤（muscle tremor）等。 2．将甲、乙、丙、丁、戊、五只家兔分别放于兔固定箱内，甲兔由耳缘静脉给予 saline（1ml/kg）；乙、丙、丁、戊兔分别由耳缘静脉缓慢注入depterex（1ml/kg），给药后密切

观察上述指标的变化并记录。待 M样、N样中毒症状均较明显时，乙兔不予解救药，使其中 毒症状充分表现出来，如果死亡，分析死亡原因；丙兔耳缘静脉注射 atropine（2ml/kg），丁

兔耳缘静脉缓慢注射 PAM（4ml/kg），戊兔耳缘静脉先 atropine（2ml/kg），而后注射 PAM（4ml/kg），观察中毒症状有何变化， atropine和PAM分别改善了哪些症状？ 3. 实验结果记录:

一般 呼吸 心率 瞳孔 唾液 大小便 肌张力 肌震颤 状态 次/min 次/min 大小 分泌

给药前 给敌百虫 给阿托品

给解磷定

阿 + 解

附：胆碱酯酶活性测定（ determination of activity of AChE）

【目的和原理】学习 AChE活性的测定方法 ,观察中毒前后及使用不同解救药后 AChE活性 的变化。

ACh在血液中被 AChE水解，产生醋酸和胆碱。在一定范围，水解的 ACh量与 AChE的 活性成正比。故在反应体系中，加入定量的 ACh使之参加

反应，通过测定剩余的 ACh即可 计算出水解 ACh的量，从而推算出 AChE活性。

ACh的呈色反应

ACh可与羟胺反应生成乙酰羟肟酸，后者在酸性条件下与三价铁离子形成褐色的羟肟 酸铁络合物，其颜色的深浅可反映 ACh含量。反应过程如下： (1)

盐酸羟胺与氢氧化钠作用释放出游离羟胺 NH2OH·HCL+NaOH→NH2OH+NaCL+H2O

(2) 剩余 ACh与游离羟胺作用，生成羟肟酸化合物

（CH3）≡N—(CH2)2OCOCH3+NH2OH→CH3CONHOH +（CH3）3≡N—（CH2）2OH (3)羟肟酸化合物在酸性环境中与三氯化铁生成褐色复合物（羟肟酸铁络合物） 酸性 Fe/3

FeCL3+CH3CONHOH

CH3CONHO+HCL (棕红色) 【实验药品】

(1) 7×10-3mol/L氯化 ACh：取 ACh用蒸馏水配成 2.54％溶液，冰箱保存。用前以蒸 馏水 20倍稀释即成 7×10-3mol/L ACh溶液。 (2) 1mol/L盐酸羟胺（ NH2OH·HCL）：取 25g盐酸羟胺，加蒸馏水 359ml，冰箱保存。 (3) 3.5N NaOH。 (4) 4N HCL。

(5) 3.7×10-1mol/L三氯化铁（FeCL3·6 H2O ）：取 10g三氯化铁，加蒸馏水至 20ml， 浓 HCl 0.84ml，加温溶解，最后加蒸馏水至 100ml制成 3.7×10-1mol/L三氯化铁 （FeCL3 0.1N HCl）溶液。

(6) PH7.2的磷酸缓冲液：取Na2HPO4·12H2O16.72g和KH2PO42.72g加蒸馏水至100ml， 冰箱保存。 【实验步骤】

(1)家兔在给药前、中毒症状明显后、给atropine待症状明显缓解后、给予 PAM解救后 0min、10min、20min、30min等时间点分别由兔耳缘静脉或股静脉取血0.5ml，测定 AChE 活性。具体步骤见表 1。

(2)取 20ml试管若干个，按表加入磷酸缓冲液 0.85~1ml，血样 0~0.15ml，置 37℃±1℃ 恒温水浴中预热 3~5min。

(3)加入 7×10-3mol/L ACh溶液 1.0ml（用加样器），于 37℃±1℃水浴中反应 40min，每 隔 10min摇动一次。

(4)反应 40min后立即加入碱性羟胺（ 1mol/L NH2OH·HCL与 3.5N NaOH溶液在用前 20min等容混合，并不断震荡）4.0ml。

(5)依次加入 4N HCL和 3.7×10-1mol/L FeCL3各 2ml，每加入一种试剂都要充分振荡。 (6)上述反应液均用滤纸过滤，将滤液倒入比色杯中，以 530nm的波长比色。 (7)对照管（标准 ACh值）：为反应体系中全量 ACh对照。 空白管：为无血、无 Ach的其它试剂对照。 对照管与空白管操作步骤同其它样品（见表）。 以上操作顺序见表。 【实验结果】

1.计算酶活性：全血 AChE活性值以 0.15ml全血在 40min内水解 ACh的μmol数表示 （μmol/0.15ml/40min） ①酶活性计算：

OD标准管—OD测定管 全血 AChE活性值 = ×7 OD标准管

②酶活性值百分数计算 样本 AChE活性值

×100%

正常全血 AChE活性值

1．绘制时效曲线

根据给予 PAM解救后几个时间点的 AChE活性值制图。 酶活性（％） 时间

【注意事项】

1.Depterex属于剧毒杀虫

剂，且可从皮肤吸收，如与手等接触后，应立即用清水清洗。 2.给家兔 depterex后，15min仍未出现中毒症状，可再追加 1/3剂量的 depterex溶液。 3.测定 AChE活性时，加入每种试剂时剂量一定要准确。

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