载体构建

一、目的基因的a(4.2k) PCR

1、PCR体系（引物ath-a-4.2k-F ath-a-4.2k-R 酶 fusion聚合酶 体积单位 μ l） DNA fusion 5*fusionHF 2.5mM F R ddH2O Buffer dNTP 2 *3 0.25 0.75 4 12 2 6 0.5 1.5 0.5 1.5 10.75 32.75 totle 20 60 98°C 30s 98°C 15s 56°C 30s 72°C 4min30s 72°C10min 16°C∝ 30cycle

（注：聚合酶说明：fusion聚合酶是高保真聚合酶，扩增片段为平末端） 2、跑胶

1％琼脂糖凝胶胶跑20min，观察实验结果。 3、胶回收（试剂盒回收） （1）、在紫外光下将扩增条带用刀切下，要尽量快（紫外会诱导基因突变）放在1.5mL的离心管中；（注意：刀头尽量伸进离心管内部，防止污染离心管外部可接触部位） （2）、在离心管中加入300-400μ l的Buffer DE-A，混合均匀后于75°C水浴锅加热溶解直至透明； （3）、加0.5倍Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。 （4）、吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管（置于2mL离心管）中，12000g离心1min。弃滤液。 （5）、将制备管置回2mL离心管，加500μ l BufferW1；12000g离心30s，弃滤液； （6）、将制备管置回2mL离心管，加700μ l BufferW2；12000g离心30s，弃滤液；以同样的方法再用700μ l BufferW2洗涤一次，12000g离心1min；（注意：加BufferW2之前必须确定其中已经加入无水乙醇） （7）、将制备管置回2mL离心管，12000g离心2min，之后在静止2min（吸附DNA并晾干）； （8）、将制备管置于1.5mL离心管中，在制备膜中央加25-30μ l Eluent或去离子水，室温静置1min，12000g离心1min洗涤DNA。（注意：将去离子水或者Eluent加热到65°C将提高洗脱效率）。

二、加A（注：聚合酶说明：fusion聚合酶是高保真聚合酶，扩增片段为平末端，需加A才能与载体结合）

1、体系：体积单位 μ l 10mM dNAP totle 回收DNA片段 10*taq Buffer Taq酶 18 2 0.5 0.5 21 在PCR仪中72°C 30min，16°C∝ 2、跑胶观察结果并回收获得ath-a-4.2k-addA片段。 三、连接TOPO载体（T载体）

体系：体积单位 μ l Salt Solution ddH2O TOPO载体 胶回收产物 1 1 2 2 totle 6 室温下放一白天（10h左右）获得ath-a-4.2k-TOPO载体。 四、转化：转到大肠杆菌中表达（DH5α） 连接产物中加50μ l感受态DH5α 冰上30min 42°C水浴30s 冰上3 min 加250μ l无抗LB 37°C摇床摇1 12000g离心1min 涂板（Spe抗性，筛选） 37°C培养箱过夜（8h左右）

五、菌落PCR

1、 体系：体积单位 μ l 引物：ath-a-4.2k-5-F ath-a-4.2k-5-R Taq 10*PB2.5mM F R ddH2O （PCR dNTP Buffer） 0.5 2 2 0.5 0.5 14.5 *50 98°C 30s 28 cycle

25 100 98°C 15s 100 56°C 30s 25 25 72°C 4min30s 725 totle 20 1000 72°C10min 16°C∝

2、操作：

（1） 将Mix分装到PCR板中；

（2） 取一个新的Spe板打格并标记；

（3） 用10μ l的枪头挑取筛选到的单克隆，在新的Spe板划线并把枪头一起打到PCR板中； （4） 用排枪吸打取出枪头； （5） 加阳性对照并盖好盖子；

（6） 放入PCR仪设定程序开始扩增。 3、跑胶

1％琼脂糖凝胶胶跑20min，观察实验结果，标记阳性单克隆。 六、摇菌

将标记的阳性单克隆接到Spe LB培养液中在37°C摇床中摇菌。 七、保菌

吸取一点菌液于保菌管中，按1:1的比例加入80％甘油吸打均匀，液氮速冻后放入-80°C冰箱。

八、提质粒（试剂盒）

第一次使用时，将试剂盒携带的RNase A全部加入到Buffer S1 中，混合均匀，4°C贮存。 1. 取1-4 ml在LB培养基中培养过夜的菌液（若使用丰富培养基，菌液体积应减半或更少），12,000×g

离心1 min，弃尽上清。

2. 加250 μl Buffer S1 悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。 * 确认Buffer S1中已加入RNase A。 3. 加250 μl Buffer S2，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶

液。此步骤不宜超过5 min。

* Buffer S2使用后立即盖紧瓶盖，以免空气中的CO2中和Buffer S2中的NaOH，降低溶菌效率。

* 避免剧烈摇晃，否则将导致基因组DNA的污染。 * 此步骤不宜超过5 min。

4. 加350 μl Buffer S3，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12,000×g离心10 min。 * 避免剧烈摇晃，否则将导致基因组DNA的污染。 步骤5～7可以选择负压法或离心法纯化质粒DNA。 A. 负压法

5A. 将质粒DNA制备管插到负压装置的接口上。吸取步骤4中的离心上清并转移到制备管中，

开启并调节负压至-20-30英寸汞柱，缓慢吸走管中溶液。

6A. 加500 μl Buffer W1，吸尽管中溶液。

7A. 加700 μl Buffer W2，吸尽管中溶液；以同样的方法再用700 μl Buffer W2 洗涤一次。 * 确认在Buffer W2 concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。 * 两次使用Buffer W2冲洗能确保盐份被完全清除，消除对酶切反应的影响。 8A. 将制备管置于2 ml离心管（试剂盒内提供）中，12,000×g离心1 min。 B. 离心法

5B. 吸取步骤4中的离心上清并转移到制备管（置于2 ml离心管（试剂盒内提供）中），12,000×g

离心1 min，弃滤液。

6B. 将制备管置回离心管，加500 μl Buffer W1，12,000×g离心1 min，弃滤液。

7B. 将制备管置回离心管，加700 μl Buffer W2，12,000×g离心1 min，弃滤液；以同样的方法

再用700 μl Buffer W2 洗涤一次。弃滤液。

* 确认在Buffer W2 concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。 * 两次使用Buffer W2冲洗能确保盐份被完全清除，消除对酶切反应的影响。 8B. 将制备管置回2 ml离心管中，12,000×g离心1 min。 9. 将制备管移入新的1.5 ml离心管（试剂盒内提供）中，在制备管膜中央加60-80 μl Eluent 或去离

子水，室温静置1 min。12,000×g离心1 min。

* 将Eluent或去离子水加热至65℃将提高洗脱效率。 九、测序

选取几个质粒送去测序（因为会有假阳性，所以常送去测序后进行序列比对来进一步确定所转基因正确）

十、LR反应（将测序正确的质粒继续进行LR反应） 体系：体积单位 μ l ath-a-4.2k-TOPO 1.5 PMDC99 1.5 Eluent 1 GatewayLR Clonese Enzyme Mix 1 totle 5 1、25°C 1h(PCR控温或者室温)

2、加0.5μ l蛋白酶K后置于37°C培养箱10min终止反应； 十一、转化

1μ l LR反应产物+50μ l感受态DH5α 冰上30min 42°C水浴30s 冰上3 min 加250 37°C摇床摇1h 涂板（Kan抗性，筛选） 37°C培养箱过夜（8h左右） 十二、菌落PCR 摇菌 保菌 提质粒（试剂盒） 测序 十三、转化（农杆菌GV3101转μ l无抗LB化，电击法） 步骤：

1、 提前半小时照紫外灭菌；

2、 将电击杯放在灭过菌的超净台晾干；

3、 将电击仪与插槽连上，打开电源，选择农杆菌转化； 4、 在电击杯中加1μ l质粒，50μl农杆菌感受态； 5、 按Pulse键电击；

6、 点击后立即拿出电击杯并加250μ l无抗LB培养液；

7、 将电击杯内的菌液转移到EP管中，于28°C摇床摇1h；

8、 涂板（三抗载体Kan Rif G）

注意：整个过程要在冰盒上操作，包括电击杯前放入冰盒。 十四、摇菌（大摇，因为下一步做拟南芥转化需量较多） 十五、转拟南芥

1、 将大摇的转化农杆菌6000g离心15min；

2、 配制转化液（5％的蔗糖—花粉等渗溶液 0.02％的Silwet-7—辅助转化 3、 将转化液倒入大培养皿中浸泡拟南芥花部（可以整体浸入） 4、 盖膜（用黑色塑料膜包上黑暗处理）生长24h; 5、 24h后揭开塑料膜正常生长

注意：所转化的拟南芥花必须是花蕾，快开而未开，避免已经授粉。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/iv28.html