羟乙基淀粉沉降法分离脐血过程的深入分析及条件优化.pdf

中国输血杂志2004年4月第17卷第2期 ChinJBloodTransfusion,April,2004,Vol.17,No.2

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论 著

羟乙基淀粉沉降法分离脐血过程的

深入分析及条件优化*

迟占有 姜 华 蔡海波 谭文松 戴干策

(华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237)

摘要:目的 进一步提高HES(羟乙基淀粉)沉降法分离脐血单个核细胞的收率。方法 对比和分析对该沉降过程完成后上下层的白细胞数,并考察HES浓度、HES与脐血体积比、沉降距离对该过程白细胞收率的影响。结果 沉降过程存在因红细胞团向下沉降而推动白细胞向上运动的对流现象,该现象受到细胞占悬浮液总体积的比例和红细胞下降速度的影响,增加沉降距离能增加对流的作用距离,有利于提高白细胞的收率,提高HES与脐血的体积比也有利于提高白细胞收率。悬浮液中HES浓度<0.6%时,细胞不能有效沉降,>3%时,会引起白细胞在红细胞中的夹带而影响收率。用3%HES以2 1与脐血混合,在沉降距离为25cm的沉降管中沉降40min,分离后白细胞收率达94.3%。结论 采用3%HES溶液,并提高HES与脐血的体积比和增加沉降距离,可进一步提高HES沉降法分离脐血单个核细胞的收率。 关键词:脐血

羟乙基淀粉

沉降

分离 白细胞/收率

中图分类号:Q274 R714 56 文献标识码:A 文章编号:1004 549X(2004)02 0071 04

OptimizationofcordbloodseparationprocessbyHydroxyethylStarch(HES)sedimentation CHIzhanyou,JIANGHua,CAIHaibo,etal.TheStateKeyLaboratoryofBioreactorEngineering,EastChinaUniversityofScienceandTechnology,Shanghai200237,China

Abstract:Objective ToimprovethepercentrecoveryofthewhitecellsintheprocessofcordbloodseparationbyHESsedimentation.Methods TheeffectsofHESconcentration,thevolumeratioofHEStocordblood,andsedimenta tionlengthontherecoveryweredeterminedandanalyzed.Results Itwasfoundthattherewasconvectioninthispro cessthatwhitecellsmovedupwardcausedbythefastdownwardsettlingofredcellpellets,andthisconvectionwasrelatedtothevelocityofredcellpelletsandtheratioofcellstosuspensionvolume.Thelongersedimentationdistancehelpedim provetherecoveryofwhitecells,sinceitprolongedthepush upactiondistance.Thewhitecellrecoveryalsocouldbeim provedbyenhancingthevolumeratioofHEStocordblood.Theredcellscouldn tformpelletandsettleefficientlyiftheHESconcentrationinthemixedsuspensionwaslessthan0.6%,andwhitecellswereinvolvedintheredcellpelletsifHESconcentrationexceeded3%.A94.3%recoveryofmononuclearcellcouldbeobtainedaftersedimentationina25cmsettlerfor40min,inwhichthevolumeratioof3%HESsolutiontocordbloodwas2:1.Conclusion AhigherrecoverycanbereachedinalongersettlerafterHESconcentrationandtheratioofHEStocordbloodareoptimized

KeyWords:cordblood,HES,sedimentation,separation

脐血作为新的造血干细胞来源[1],富含CD34+细胞,对异体抗原的反应较弱,具有高增殖潜力和长期造血重建能力,因此具有替代骨髓移植、免疫治疗、基因治疗和各种癌症的辅助治疗等良好的应用前景。脐血中大部分为红细胞,建立脐血库时,为减少冻存体积,需要分离掉大量的红细胞而只保存富含造血干细胞的有核细胞。以羟乙基淀粉(hydroxyethylstarch,HES)为沉降剂将红细胞沉降分离去除,而回收有核细胞的方法目前在脐血分离中被广

*基金项目:国家 863 计划生物领域项目(编号102 12 08 01);上海市现代生物与医药项目基金资助(编号004319003)

泛采用[2]。一般来说,每份脐血的体积较小,从1份脐血中得到的细胞量过少常常限制其应用,故应尽可能提高该过程的收率。目前脐血库通常采用的HES离心分离法由于离心后上层细胞液占总体积比例较小,导致其收率在88.9%左右。为进一步

提高收率,笔者对脐血HES沉降分离方法作了深入分析,并通过优化该过程的影响因素进一步提高了脐血单个核细胞的收率。1

材料与方法

[6]

1.1 脐血来源 由上海国际和平妇幼保健院采集,

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1.2细胞计数 用血细胞计数器计数白细胞,加

表1悬浮液中HES浓度对沉降的影响(n=4)

2%HES

4%HES

3%醋酸并用结晶紫染色,计有核细胞数。

1.3 沉降实验 用生理盐水将HES(Sigma)配成2%~6%(w/v)的溶液,高压灭菌后备用。将HES溶液与脐血按一定体积比混匀,置于50ml离心管或沉降器(直径与离心管相同、长25cm的圆管)自然静置沉降,沉降完成后,下层(Ld)主要为红细胞团,包含少量白细胞,大部分白细胞集中在上层(Lu)段,沉降至Lu与Ld段的界面清晰后,取Lu段液体,计白细胞和总细胞数,Ld段的液体同样作计数,并由此计算白细胞收率(图1)。

脐血中白细胞数(106/ml)脐血 HES

悬浮液中白细胞数(106/ml)上层体积 下层体积

Cu(上层白细胞数)(106/ml)Cd(下层白细胞数)(106/ml)Cu/Cd

白细胞收率(%)

8.4 4.6

15ml 30ml2.8 1.535ml 10ml

3.2 1.22.6 1.21.5 1.03.5 1.42.12 0.120.74 0.1487.9 9.073.2 7.4

层白细胞密度不仅高于下层且高于混匀后密度的情

况说明,在此沉降过程中,白细胞不是单纯受重力作用而一致向下运动,而是存在向上运动。

2.1.2以悬浮液中浓度为4%的HES沉降分离后,与2%时的结果相反,其下层白细胞高于上层,而且即使悬浮液中白细胞浓度很低(0.87 106/ml),白细胞浓度仍然较高(3.2 106/ml),说明悬浮液中HES浓度过高时,红细胞之间由于桥联作用而结团过程中会夹带白细胞在其中,从而导致白细胞随红细胞团沉入下层,造成上层白细胞的损失,影响了白细胞的收率。

2.2脐血与HES溶液体积比的影响 将脐血和3%HES、6%HES溶液分别以不同比例混合均匀后沉降,考察脐血与HES的体积比对白细胞收率的影响(表2)。

2.2.1随3%HES与脐血体积比的增大,白细胞收率也相应提高,二者体积比为1 4时,红细胞通常需要很长时间(>3h)才能沉降下来,说明在0 6%的HES溶液中,红细胞不能有效地结成细胞团或结成细胞团较小,不能及时沉降实现分离;而3%HES与脐血体积比从1 2增大到5 1时,白细胞收率相应提高,但上层与下层中白细胞浓度之比Cu/Cd逐渐下降,说明随细胞占悬浮液体积比的下降,白细胞向上集中的现象越来越不明显,白细胞向上的运动相对减少。

2.2.26%HES与脐血体积比为1 4时,收率较高,此时Cu/Cd值较大,说明沉降过程中白细胞向上

x s)

6%HES

Cu/Cd1.23 0.032.79 0.462.30 0.342.12 0.121.12 0.07

悬浮液中HES浓度(%)

1.22.03.04.05.0

白细胞收率(%)82.1 4.869.1 2.752.6 6.273.2 7.479.2 10.3

Cu/Cd3.47 0.832.62 0.600.78 0.210.74 0.140.27 0.03

图1 脐血细胞沉降过程示意

1.4

标准化操作 参照纽约脐血库操作规程[2],

取6%HES与脐血以1 4混合,50g离心5min,分离得到上下层细胞液。2

结果

2.1 悬浮液中HES浓度的影响及其沉降过程的分

析 脐血沉降分离中通常采用6%HES,而不考虑其与脐血混和后的实际浓度。理论上讲,影响沉降效果的应该是混和后悬浮液中HES的浓度,因此本研究用3%和6%HES溶液分别以2 1体积与脐血混和,得到悬浮液中HES浓度分别为2%和4%,并由此研究了悬浮液中HES浓度对白细胞收率的影响(表1)。

2.1.1以悬浮液中浓度为2%的HES沉降30min后,其白细胞收率比用4%HES得到的收率高。上

表2

HES溶液与脐血体积比对白细胞回收率的影响(n=4,

3%HES

悬浮液中HES浓度(%)

1 41 21 12 15 1

0.61.01.52.02.5

白细胞收率(%)41.2 6.352.4 8.462.2 6.987.9 9.092.3 7.4

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运动较多;比例增大到1 1时,收率反而较低,此时Cu/Cd值<1,而且比例再增大,Cu/Cd值更小,说明悬浮液中HES浓度>3%时,部分白细胞就会被红细胞夹带到下层;比例为5 1时,Cu/Cd为0.27,但此时白细胞收率比1 1时仍高,这是因为此时沉降后上层液体占了83%左右,所以白细胞在下层的集中不会对收率造成很大影响,影响收率的主要因素倒是上层占总体积的比例。2.3

沉降距离的影响及其与标准操作规程的比较 红细胞团向下沉降而推动白细胞向上运动的过程可以视作一种分离的过程,此过程的作用距离越长,其实现分离的效果应该越好,因此考查了沉降距离对该过程与收率的影响。沉降管的长度为离心管的3倍(25cm),HES与脐血以2 1体积混合均匀后沉降,离心管沉降<30min分层,而沉降管中由于距离较长,沉降40min后分层(表3)。由于增加了沉降分离的距离,沉降管中上层白细胞数高于离心管中,而下层则相反,Cu/Cd值比离心管中的大,说明增加了沉降距离后,白细胞向上层集中的效果更加明显,提高了分离效率,白细胞收率从87.9%提高到了94.3%。

目前脐血库分离脐血中通常采用Rubinstein等提出的标准化操作,本实验中用离心管采取标准化操作与沉降的结果做了比较,表明标准化操作中细胞向上集中的现象更加明显,Cu/Cd值达到了5 42。这是因为标准化操作离心过程中,加快了红细胞团下降的速率,从而更有效地推动白细胞向上运动,但标准化操作时上层占总体积的比例较小,所以其收率不如在沉降管中的收率高。

表3

沉降距离对脐血沉降过程和白细胞收率的影响

(n=7,

离心管

脐血中白细胞密度(106/ml)混匀后白细胞密度(106/ml)上层白细胞密度(106/ml)下层白细胞密度(106/ml)Cu/Cd

白细胞收率(%)

8.4 4.62.8 1.53.2 1.21.5 1.02.12 0.1287.9 9.0

沉降管8.4 4.62.8 1.53.4 1.60.8 0.53.95 1.0394.3 6.1

两种颗粒形成相对较纯的两层。这种现象不但在重颗粒比悬浮液密度大,轻颗粒比悬浮液密度小的情况下存在,在轻重颗粒密度都比悬浮液密度大的情况下也存在,并且该现象的发生与颗粒密度和颗粒尺寸有关[4],这是由于重颗粒下沉过程中推动其下方的液体向上流动而引起。本实验表明,脐血沉降过程中,也存在着白细胞的向上层集中运动,这是因为白细胞直径和密度都较小,沉降速度很小,而红细胞结团后,细胞团的直径较大且红细胞密度比白细胞大,因此其沉降速度比白细胞大很多,脐血沉降过程正是利用红细胞团和白细胞的沉降速度的差异来实现分离。红细胞团快速沉降而导致其周围液体的向上运动,带动了白细胞的向上运动,产生了对流现象,这种对流受三个因素的影响: 红细胞团下降的速率,红细胞下降越快,越有利于造成周围液体向上运动,越有利于推动白细胞向上运动,离心操作中的结果正说明了这一点; 细胞浓度或者是细胞占悬浮液的体积比,细胞浓度越大,在微观上来讲其红细胞团和白细胞的距离越近,这有利于对流的发生; 沉降距离越长,对流的作用越能得到充分发展,也有利于白细胞向上层的集中。

白细胞向上层的集中无疑会增加白细胞的收率,由白细胞的收率计算公式:

Recovery=Vu Cu/(Vu Cu+Vd Cd)=Vu Cu/(Vs Cs)

(2)

可知,其还可以表述为公式: Recovery=(Vu/Vs) (Cu/Cs)

(3)

即最终白细胞的收率由上层体积与总体积比(Vu/Vs),和上层与沉降前悬浮液白细胞浓度比(Cu/Cs)两个因素决定。Cu/Cs项与Cu/Cd一致,是白细胞向上运动和集中程度的一个标志,Cu/Cs值越大,白细胞在上层的集中越多,白细胞收率越高。由公式(3)还可知,影响白细胞收率的另外一个因素是沉降后上层占总体积的比例,提高这个比例,有利于提高白细胞收率,而这可由提高HES溶液与脐血的体积比实现。但提高体积比至一定程度后,促进白细胞向上运动的对流受到限制,Cu/Cs或Cu/Cd变小,如HES与脐血体积比为2 1时,Cu/Cd为2 12,而提高到5 1时,Cu/Cd下降为1.12(表2)。可见虽然可以随意加大HES与脐血体积比,但其收率不再有大幅度提高的原因在于体积比过大时,白细胞向上层集中作用逐渐减弱。采用3%的HES,与脐血体积比为2 1混合,在25cm长的沉降管中沉降40min,可得到较理想的白细胞收率。

为提高脐血沉降分离效率,有研究者也采用沉,,

x s)

标准化操作8.4 4.66.7 3.711.6 4.52.2 1.05.42 1.1488.2 7.9

3讨论

细胞和细胞团的沉降运动处于低雷诺数下,沉

[3]

降速度遵循Stokes公式

u=gDp2( p- )/18

:

(1)

在含两种颗粒的悬浮液的沉降过程中,两种颗粒会发生对流,重的颗粒会比没有轻颗粒情况下更

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stemcelltransfusionfromcordbloodandrationalforcordbloodbanking.BMT,1992,9(Suppl):114

2 RubinsteinP,DobrilaL,RosenfieldRE,etal.Processingandcry

opreservationofplacental/umbilicalbordbloodforunrelatedbonemarrowreconstitution.ProcNatlAcadSciUSA,1995,92(22):10119

3 ChenMH,FangTN,CongDZ,etal.Principlesofchemicalengi

neering.2nded,Beijing:ChemicalIndustryPress,1999,46~514 DavisRH,AcrivosA Sedimentationofnoncolloidalparticlesatlow

reynoldnumbers.AnnRevFluidMech,1985,17:91

5 BrunoA,BallatoreG,AdornoG,etal.Redbloodcelldepletion

andcryopreservationofumbilicalcordblood.BMT,1997,20(1):89

6 LiaoC,LiuB,HuangYN,etal.Establishmentofcordbloodcell

bankanditsclinicalapplication.ChinJHematol,2001,22(8):411

(2003 05 08收稿,2004 03 15修回)

本文编辑:蔡 辉

白细胞收率最终可以达到92%[5]。但由于目前的脐血库建设倾向于采集脐血后在封闭的无菌系统中分离操作,这就需要只分离一次便得到大部分的白细胞,两次沉降法显然无法满足。目前脐血库中通

常采取的方法是在原始血袋中按与脐血4 1的比例加入6%HES后离心去红细胞,再离心去血浆的方法,这可得到较理想的收率(88.9%),优点是能通过离心使大部分白细胞集中到上层中,但由于离心后上层体积占总体积比例过小,导致最终收率并不十分理想,而且这种方法需要两次离心。本方法通过提高3%HES与脐血的体积比和增加沉降距离,可取得94.3%的白细胞收率,高于HES离心分离法,而且避免了重复的离心操作。

参考文献

1 GluckmanE,DevergleA,ThierryD,etal.Clinicalapplicationof

[6]

速率法筛查ALT在街头流动献血车中的应用

朱明亮

关键词:速率法

ALT

+

许守广卢廷山(宝应县中心血库,江苏宝应225800)

筛查

中图分类号:R446 112 文献标识码:B 文章编号:1004 549X(2004)02 0036 02 针对我县目前献血公民的健康状况,本站自2001年3月份以来开展了对献血者献血前现场测定ALT和HBsAg的筛查,在很大程度上降低了因未做ALT筛查而致的血液不合格,现报告如下。1

材料与方法

对筛查合格的1850名献血者采集血液后进行初复检两次检测,ALT不合格数26例,不合格率1 4%。3

讨论

1.1标本来源 街头体检合格的自愿献血者,采集静脉血2ml。

1.2 试剂与方法 ATL筛查时采用半自动生化分析仪速率法,试剂(北京中生生物工程高技术公司),初检复检时采用赖氏法,试剂(上海生物技术公司)。

1.3主要仪器 半自动生化分析仪TraceCB171(镇江市美华医疗器械有限公司提供),7230G分光分度计(上海分析仪器总厂提供)。

1.4ALT异常判定标准[1] 速率法 ALT>40U,赖氏法ALT>25U。2

结果

对2001年3月份以后的2435名无偿献血者经体检合格后作ALT及HBsAg筛查,2001年3月份之前的2165名无偿献血者未作筛查而直接采集血液,留取样本作规定指标的初检及复检。两种模式ALT的检测结果见表1。

表1 两种模式的ALT检测情况

检测人数

筛查初复检

24352165

ALT不合格数

453362

不合格率(%)

18.616.7

根据以上结果不难看出,本地区运用半自动生化分析仪进行速率法筛查献血者ALT,其不合格率达18.6%,与之前未作筛查直接采血作初复检的不合格率16.7%相近。至于前者稍高于后者,原因可能为 与季节有关[2],前者献血多数处于夏季,气温较高,对ALT的影响较大,而后者献血大多处于冬春季,此季节的ALT相对较稳定,故血液报废率要低一些。 与测定方法有关,速率法较赖氏法,可能更灵敏一些,不合格率则要高一些。鉴于如此高的ALT不合格率,在采血前作ALT筛查时很必要的。

笔者认为,应用半自动生化分析仪速率法筛查ALT在街头献血模式中主要有以下优点: 操作快捷简便,准确性较好,可与金标试纸法检测HBsAg,硫酸铜比重法测定Hb形成一个较为理想的采血前 一条龙 筛查模式,献血者只需等待15min即可,大大缩短了献血者的候检时间,较大程度地方便了无偿献血者和组织者。 该半自动生化分析仪,体积较小,携带方便,且结果较稳定,重复性好。

参考文献

1

叶应妩,王毓三 全国临床捡验操作规程(第二版),南京:东南大学出版社,1997,204~206

2 孙海英,范恩勇,等 无偿献血中ALT检测项目探析 中国输

血杂志,2003,16(4):265

(2002 09 10收稿,2004 03 01修回)

本文编辑:王良华

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/it41.html