质粒提取、纯化、电泳检测

质粒DNA的提取、纯化和电泳检测

【实验目的】

1、掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用； 2、掌握碱变性法提取质粒DNA的方法；

3、学习并掌握凝胶电泳进行DNA分离纯化的实验原理； 4、学习并掌握凝胶的制备方法；

5、学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法；

6、验证E.coli DH5α与E.coli DH5α（pUC19）在含有氨苄培养基上的生长情况并了解其原理。 【实验原理】

1、携带外源基因并将外源基因导入宿主细胞，使之进行扩增和表达的媒介称为载体。在基因工程操作中载体具有以下性质：A.具有自主复制的起点；B.具有多个限制性核酸内切酶的单一识别位点（多克隆位点）；C.具有可供选择的遗传标记；D.具有高拷贝数。

2、质粒 DNA 是原核生物除类核中的染色体 DNA以外 ,细胞质中含有的一个或多个能独立复制并稳定遗传的小环状双链 DNA 分子 。 除酵母的杀伤质粒为 RNA 外 , 迄今发现的所有质粒均为双链环状DNA 。 多数质粒只有几千个 bp 但也有一些质粒达105bp 以上 ,一般分子量在 ( 4～100) × 106道尔顿范围内 。不同的质粒在细胞内的拷贝数不同。细胞内含有1-3个拷贝的质粒为低拷贝质粒（严紧型复制），当质粒数在10个拷贝以上，为高拷贝质粒（松弛型复制），用于载体构建质粒多为松弛型。

3、pUC19质粒大小约为2.69kb，含有以下构件：来自于E.coli质粒ColE1的松弛型复制起点；氨苄青霉素抗性基因（Ampr）；E.coliβ-半乳糖苷酶基因

（LacZ）的启动子及编码β-半乳糖苷酶的DNA序列；多克隆位点（MCS）区段。

图1.pUC18/pUC19质粒图谱

4、质粒在细胞内以共价闭合环状DNA的形式存在，呈超螺旋状态（cccDNA）。在抽提质粒DNA的过程中，由于各种因素影响，使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA的一条链断裂，变成开环DNA(ocDNA)，若两条链发生断裂则转变为线状DNA（L DNA）。一般情况下，超螺旋型迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的是开环状分子。

5、在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在，细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性和复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用pH值4.6的NaAc高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA,蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心与复性于溶液的质粒DNA分离。

6、溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A 将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提出去，最后获得纯度较高的质粒DNA。

7、凝胶是支持电泳介质，具有分子筛效应。琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径，一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中泳动速度不同。通常凝胶浓度越低，则凝胶孔径越大，DNA电泳迁移速度越快，因此，相对分子质量越大，选用的凝胶浓度应越低。

8、Supercoiled DNA Ladder Marker（浓度：500ng/6μl） 由 8种超螺旋的质粒DNA 构成，DNA Size大小见下表

表1. Supercoiled DNA Ladder Marker DNA size

大小2,087 （bp） DNA量~ 50 （ng） 3,049 50 3,997 5,026 6,122 8,023 10,085 11,849 50 150 50 50 50 50 上样量 直接上样：6μl

图2. Supercoiled DNA Ladder Marker

在本实验中所提取质粒pUC19大小约为2.69kb，在Supercoiled DNA Ladder Marker范围中。但不在λDNA/Hind ⅢMaker（125bp-23130bp）的分离范围中，所以不能选用λDNA/Hind ⅢMaker。 【实验试剂与仪器】

1、实验试剂：LB培养基，麦康凯培养基，抗生素（氨苄青霉素），溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，RNase A母液，TE缓冲液，饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，预冷无水乙醇，1×TAE电泳缓冲液，上样缓冲液（6×loading buffer），琼脂糖，溴化乙锭（EB），Supercoiled DNA Ladder Marker

2、实验仪器：恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，漩涡振荡器，-20℃冰箱，

1.5mL离心管，50mL离心管，不同型号枪头，微量移液器，培养皿，微波炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，电子天平，一次性手套，凝胶成像仪

【操作步骤】

一、 验证E.coli DH5α与E.coli DH5α（pUC19）

1、倒平板：无菌操作倒2个麦康凯培养基平板，其中一个含氨苄青霉素（终浓度100μl/mL）；

2、将每个平板用记号笔一分为二，并做好标记:一侧为DH5α,另一侧为DH5α(pUC19)；

3、划线：取两个菌种，一个为E.coli DH5α受体菌，另一个为已转入

质粒pUC19的E.coli DH5α受体菌，并在标记好的平板内无菌操作划线； 4、将划线完平板放入37℃恒温箱内培养后观察 二、 质粒DNA的提取

1、细胞培养：在含有氨苄青霉素的LB平板上挑取带有质粒pUC19的E.coli 单菌落，接种于5mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃

振荡培养过夜。将过夜培养物以2%接种量接种到50mL含有氨苄青霉素（100μl）的LB液体培养基中，37℃ 160r/min振荡培养至对数生长晚期。 2、质粒DNA提取

A.50mL灭菌离心管称重，记W1（W1=13.96g）。取30mL菌液于离心管中，4℃

6000r/min离心5min，弃去上清液，收集菌体细胞。 B.将菌体沉淀悬浮于5mL 用冰预冷的溶液Ⅰ中，混匀，4℃ 6000r/min离

心5min，弃去上清液，将离心管倒置，使上清液全部流尽，称量重量W2（W2=14.11g）,计算得湿菌体质量W（W=W1-W2=0.15g=150mg）。 C.按湿菌体质量：溶液Ⅰ体积=100mg：1mL的比例加入用冰预冷的溶液Ⅰ

（2mL）,用漩涡振荡器剧烈震荡，使细菌完全分散，将离心管置于冰上5min，此时溶液变得浑浊。 D.以2倍溶液Ⅰ的体积量加入新配置的溶液Ⅱ（4mL），慢慢颠倒使之混匀，

将离心管置于冰上5min，此时溶液变得澄清且粘稠。 E.以1.5倍溶液Ⅰ体积量加入用冰预冷的溶液Ⅲ（3mL），慢慢颠倒数次，

使之在粘稠的细菌裂解物中分散及均匀，然后将离心管置于冰上5min，此时有白色絮状沉淀物出现，溶液出现分层。 F.4℃ 12000r/min离心15min，将上清液转移到另一洁净离心管中，并记

下体积V（V=6mL）。 G．向上清液中加入2倍体积的无水乙醇（12mL）和1/10体积的3mol/L

KAc，混匀，-20℃静置15min，沉淀DNA。 H．4℃ 12000r/min离心15min，小心倒去上清液，将离心管倒置于纸巾上，

使所有液体流出。 I.向沉淀中加入70%冰乙醇5mL，4℃ 12000r/min离心5min，去掉上清液，

将离心管倒置于纸巾上，37℃风干5-10min。 J.将DNA沉淀分次溶于1mL TE缓冲液中，并移入1.5mL离心管中，加入

RNase A(10mg/),终浓度为50μg/mL，37℃保温1-2h。移入-20℃冻存以便进行下一步实验。

三、 质粒DNA的纯化

1、将所得粗提质粒溶液平均分装于2个1.5mL微量离心管中，每管为0.5mL,分别加入等体积饱和酚，漩涡振荡30s，12000r/min离心5min,取上层水相到另一洁净微量离心管中； 2、加入等体积氯仿/异戊醇（V/V=24:1）混合液，漩涡振荡30s，12000r/min离心5min，取上层水相到另一洁净微量离心管中； 3、加入等体积氯仿/异戊醇（V/V=24:1）混合液，漩涡振荡30s，12000r/min离心5min，取上层水相到另一洁净微量离心管中； 4、加入2倍体积的无水乙醇、1/10体积3mol/L NaAc，混合均匀，于 -20℃下沉淀DNA30min；

5、4℃12000r/min离心15min，收集沉淀DNA；

6、在沉淀的DNA中加入70%乙醇500μl，4℃12000r/min离心5min，小心

倒去上清液，将离心管倒置于纸巾上，使所有液体流出，室温干燥；

7、用25μl/管TE溶液重新进行溶解DNA，并将两管合并，放置于-20℃下保存。

四、 凝胶电泳检测

1、称取0.4g琼脂糖于锥形瓶中，加入40mL 1×TAE缓冲液，在微波炉加热至沸腾3-4次，使琼脂糖完全熔化；

2、将制胶槽放入特制模具中，并插入一个合适的梳子形成加样孔；

3、将冷却至55℃的琼脂糖凝胶溶液倒入模具中，等凝胶完全凝固后将梳子轻

轻拔出（约30min），此时凝胶变成乳白色不透明状。

4、将制胶板移入加有1×TAE缓冲液的电泳槽中，并使缓冲液高出凝胶表面1mm左右；

5、取1μl 6×loading buffer和3μl已纯化的质粒样品于洁净的微量离心管中，混合均匀后一并加到凝胶孔中。并在凝胶孔合适位置中加入合适的DNA maker，纯质粒，双酶切质粒及未用RNase消化过的样品作为实验对照；

6、当指示剂接近胶的前端（溴酚蓝达到1/3），切断电源（100V，电泳40min）。 7、用拇指和食指轻移胶板两侧，将胶块移入EB染液中染色10min，再用专用板子将胶块从染液中移出并移入三蒸水中脱色10min；

8、凝胶成像仪观察电泳结果并拍照记录。

【实验结果及分析讨论】

一、E.coli DH5α与E.coli DH5α（pUC19）验证结果

表2.E.coli DH5α与E.coli DH5α（pUC19）验证实验

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