酵母菌DNA

采用3种方法对不同酵母菌的总DNA进行提取，经琼脂糖凝胶电泳、ND-1000型微量紫外分光光度计检测以及酶切、连接、预扩增试验结果的分析，表明采用改良氯化苄法提取酵母菌的总DNA质量最好，基本无DNA碎带，蛋白质污染小。通过对野生酵母菌菌株的验证试验，进一步证明采用改良氯化苄法提取的总DNA产量稳定、重复性好，可以直接用于限制性内切酶酶切试验，完全适于AFLP分析及一些其它分子生物学研究的要求方法三：酵母菌genomics/\基因组DNA的提取

一：仪器：同方法一

二：试剂：SE缓冲液（1M山梨醇，0.1MEDTA pH7.5）；溶菌酶（蛋白酶K缓冲液（10mM Tris pH7.6 0.5% SDS 1mM EDTA）；其余同前

三：操作

1.5ml 对数生长期细菌细胞

离心，12000rpm,1-2min

沉淀

溶于590ulSE缓冲液中混匀+10ul溶菌酶37℃,1hr

离心，12000rpm,8-10min

沉淀

溶于100μL，0.5μl蛋白酶Ｋ，混匀，37℃,1hr

加入1.2ml的CTAB/NaCL,200μl20%PVP 混匀 65

等体积酚/氯仿/异戊醇混合液,混匀,

离心,12000rpm,4-5min

上清,以下操作与方法一中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除

酵母抽提物是一种优良的天然调味料，在食品行业中具有广泛的用途。提物的发展状况做了分析，综述了酵母抽提物应用新进展

50mg/ml ,30min RNA 、复溶等步骤一致。对国内和国外酵母抽20％PVP；）；℃ 酵母DNA的提取

酵母DNA的提取 1. x新鲜的菌体中加入150ul（200ul）bufferiI25(30)ul蜗牛酶（30mg/ml），37度，10Min（可以30min水浴，中间隔5分钟，振荡一次，避免细胞沉到管底。 2. 离心10000rmp，10min，去上清，沉淀中加入

bufferII250ul 3. 加入25ul，10%SDS。65度，30min水浴。 4. 加入25ul 5mol/lKAC，冰浴60分钟（4度冰箱放置就可以） 5. 12000rmp，15min，取上清，在上清中加入2-3倍体积的无水乙醇，混匀放置－20度一小时（可过夜，取出后不要振荡，直接离心） 6. 12000rmp，15min，弃上清。 7. 150ul，bufferIII溶液沉淀，12000rmp，15min 8. 将上清溶液转到干净的离心管中，加入6ul（10ug/ul），ran酶，37度，30min 9. 加入等体积异丙醇，4度静止10min，10000rmp，5min，溶于50ulbufferIII中 10. 如果有蛋白质可以使用酚氯仿抽提 11. bufferI：0.9mol/l 山梨醇，0.1mol/l EDTA 12. bufferII：50mmol/l Tris，20mmol/l EDTA 13. bufferIII：10mmol/l tris，1mol/l EDTA 14. 筛选AD/BD可以直接使用抗生素筛选的方法酵母菌落PCR 1. 酵母质粒和基因组

DNAPCR模版的制备取对数生长期酵母菌株1.5ml，13000r/min，离心15s，去上清，双蒸水洗涤一次，13000r/min 离心15s，沉淀悬浮于200ulTE缓冲液中，在沸水上煮1-10min，冰浴10min，13000r/min，离心5min，将上清液储存于－20度取1ul用于PCR 2. 从平板上调取长势良好的菌落少许，悬浮于含20ul无菌水的0.5ml eppendofff离心管中（离心管中央预先用注射器针头扎一个小孔，放置盖子因受热膨胀）水浴煮沸0.2.5.10min 3. 利用微波炉快速制备酵母治理以及菌落取直径大于3mm的酵母干菌落，至于EP管中盖上盖子，在微波炉中加热，加入30ulTE振荡，13000r/min，离心2-5min，上清储存浴－20度，取1ul来作PCR 真菌DNA的提取方法改良 1. 酵母活化后加入YEPD培养基，25-28度培养16-24小时，收集菌体 2. 取少许新鲜的菌体，加入0.6ml缓冲液I（0.9mol/l 山梨醇，0.1mol/l EDTA）1ml。0.1ml蜗牛酶（30mg/ml），37度温浴60min 3. 3000r/min离心10s，去上清，沉淀加入加入bufferII150mmol/l Tris，20mmol/l EDTA 1ml 10%SDS0.1ml65度，30min水浴。 4. 加入0.3ml ，5mol/lKAC冰浴60分钟 5. 10000rmp，15min，取上清，在上清中加入2-3倍体积的无水乙醇，混匀放置－20度一小时（可过夜，取出后不要振荡，直接离心）在5000-6000r/min离心15s 6. 沉淀用0.6ml缓冲液III10mmol/l tris，1mol/l EDTA溶解1000r/min，离心15min 7. 上清液转移一个干净的离心管中，加入6ul10ug/ul），ran酶，37度，30min 8. 加入等体积异丙醇，4度静止10min，10000rmp，5min，溶于50ulbufferIII中 9. 如果有蛋白质可以使用酚氯仿抽提

实验一 酿酒酵母总DNA的提取

【实验目的】

了解酿酒酵母基因组DNA提取的原理，掌握将基因组DNA从细胞各种生物大分子中分离的技术。

【实验原理】

从各种生物材料中提取DNA（包括质粒DNA的提取）是基因工程实验最常见的操作之一。高质量DNA的获得是基因组文库构建、基因克隆、序列测定、PCR及DNA杂交等实验的基础。基因组DNA提取的方法依实验材料和实验目的而略有不同，但总的原则都是首先将细胞破碎，然后用有机溶剂及盐类将DNA与蛋白质、大分子RNA及其它细胞碎片分开，用RNA酶将剩余的RNA降解，最后用乙醇（或异丙醇）将DNA沉淀出来。本实验以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）(1)细胞（图1）为材料提取DNA。酵母具有较厚的细胞壁，所以先用溶壁酶如Zymolyase将细胞壁溶解，然后用SDS将细胞裂解并使蛋白质变性，再用醋酸钾（KAc）溶液将DNA与其它细胞成份分开，最后用乙醇或异丙醇将DNA沉淀。此法的优点是各种操作条件较温和，可获得较完整的基因组DNA。

图1. 酵母细胞。（A）电镜切片横切面；（B）扫描电镜图。

【试剂与器材】

1． 菌种：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae W303a：单倍体菌株。

2． 培养基：YPD （酵母粉 10 g, 蛋白胨20 g， 葡萄糖 20 g, 加水至1000mL，溶解，自然pH值，121℃灭菌20分钟，如果配制固体培养基，则加入2%的琼脂粉溶解灭菌。

3． 试剂： 1mol/L 甘露醇，0.1mol/L Na2EDTA (pH7.5)，10％ SDS，5mol/L 醋酸钾（pH5.5），50mmol/L Tris-Cl (pH7.4)，20mmol/L Na2EDTA (pH7.5)，100% 异丙醇，TE (pH8.0)：10mmol/L Tris-Cl(pH8.0), 1mmol/L Na2EDTA；3M NaAc (pH7.4)，Zymolyase 100,000溶液：配成2.5mg/mL [溶于1mol/L甘露醇，0.1mol/L Na2EDTA (pH7.5)中。] 4． RNase A溶液（备择）：称取一定量RNase A溶于50mmol/L 醋酸钾（pH5.5）中配成1mg/L浓度，煮开10分钟，-20℃保存

（2）

。

【操作方法】

1． 用接种环（或无菌牙签）从YPD平板上刮取新鲜的单菌落，接种在含5mL YPD的大试管中，30℃振荡培养过夜

（3）

；

2． 测培养液在OD600的值，然后将培养液转至10mL离心管中，于室温下以2,000r/min离心5分钟，倒去上清液；

3． 加入0.5mL的1mol/L甘露醇，0.1mol/L Na2EDTA以悬浮细胞，然后用移液枪将悬浮液转至1.5mL的Eppendorf离心管中； 4． 加0.02mL的溶壁酶，37℃水浴反应60分钟

（4）

；

5． 于台式离心机上以10,000r/min 离心30秒；

6． 去上清，将沉淀悬浮在0.5mL的50mmol/L Tris-Cl和20mmol/L的Na2EDTA中； 7． 加0.05mL的10％ SDS，充分混匀；

8． 65℃保温30分钟（以裂解细胞膜和将蛋白质变性）； 9． 加0.2mL的5mol/L醋酸钾，将管置冰上60分钟；

10． 12,000r/min 离心5分钟；小心地将上清转入一新鲜的离心管中（切勿吸到下层沉淀！），加入等体积的异丙醇，轻混匀并置室温5分钟，然后12,000r/min离心10秒，小心吸去上清，将核酸沉淀物晾干（5）； 11． 将沉淀重新悬浮在300μL的TE（pH8.0）中;

12． (12/13/14为选做) 加15μL的1mg/L RNase A 溶液，37℃水浴反应20分钟； 13． 加30μL（1/10体积）的3mol/L醋酸钠，混匀，再加入0.2mL 100％异丙醇沉淀，同步骤10离心，收沉淀，室温晾干。 14． 将沉淀重新溶于0.1-0.3mL的TE中。

15． 琼脂糖凝胶电泳检测纯度和质量（参见本书实验二）。

【注意事项与提示】

(1) 酿酒酵母是一种单细胞的低等真核模式生物，培养简单，遗传背景清楚，基因操作简便，广泛应用于遗传学、细胞及分子生物学各方面的研究。

(2) RNase A来自小牛胰腺，特异性地在C和U位点处降解单链RNA。此酶非常耐热，100℃加热15分钟，也不能将其灭活；而DNase在此温度下已完全失活。 (3) 在此条件下酵母大约每1.5个小时增殖1代，过夜培养后菌液将达到饱和。 (4) 此时可在显微镜下观测酶解的效果。做法是：取数微升菌液加在载玻片上，滴加1滴10%的SDS，放显微镜下观察。消化完全的酵母菌呈透明的圆形。

(5) 切勿晾得过干，否则难于溶在TE缓冲液或水中。以沉淀边缘变透明而中间尚为白色（未完全干燥）为宜。

【实验安排】

第1天配好各种试剂和培养基，下午接酵母菌至试管中培养过夜，第二天完成DNA提取和鉴定实验。

【实验报告要求与思考题】

1. 上交总DNA电泳图；

2. 为什么要在操作步骤2中测培养液OD600的值？ 3. 加0.2mL的5mol/L醋酸钾的作用是什么？

4. 沉淀DNA时加1/10体积的3mol/L醋酸钠，为什么？

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/ipq2.html