发酵生产中杂菌的检查与防治

第一节 发酵生产中杂菌的检查与防治

一 染菌的检查与判断

凡是在发酵液或发酵容器中侵入了非接种的微生物统称为杂菌污染，及早发现杂菌，及早采取相应措施，对减少由杂菌污染造成的损失至关重要。因此检查的方法要求准确、快速。目前发酵生产上常用的检查方法有下列几种： 1．显微镜检查

一般单染色后用油镜观察，凡是从视野中发现有形态与生产菌株不同的菌体都可认为是污染了杂菌。

优点：简便、快速，能及时检查出杂菌。 缺点：（1） 对固形物多的发酵液检查较困难；

（2） 对含杂菌少的样品不易得出正确结论，应多检查几个视野；

（3） 由于菌体较小，本身又处于非同步状态，应注意区别不同生理状态下的生产菌与杂菌，必要时可用进行革蓝氏染色、芽孢染色等辅助方法进行鉴别。 2．平板检查

若怀疑发酵液被细菌污染，可取少量待检发酵液涂布在肉汤平板上，在适宜条件下培养，若出现与生产菌株形态不一的菌落，就表明可能被杂菌污染；若要进一步确证，可配合显微镜形态观察，若个体形态与菌落形态都与生产菌相异，则可确认污染了杂菌。

优点：（1）适于固形物多的发酵液； （2）形象直观，肉眼可辩，不需仪器。 缺点：（1）所需时间较长，至少也需8小时；

（2）无法区分形态（包括细胞形态与菌落形态）与生产菌相似的杂菌，如啤酒生产中污染野生酵母时，由于啤酒酵母与野生酵母很难从形态上加以区分，只能借助生理生化试验进行确认。

（3）检查过程需严格执行无菌操作技术。 3．肉汤培养检查法

此法主要用于空气过滤系统和液体培养基的无菌检查。具体方法是将葡萄糖酚红肉汤培养基（牛肉膏0.3%，蛋白胨0.8%，葡萄糖0.5%，氯化钠0.5%，1%酚红溶液0.4%，pH7.2）装在吸气瓶中，经灭菌后，置37 ℃培养24小时，若培养液未变浑浊，表明吸气瓶中的培养液是无菌的，就可用于空气过滤系统的杂菌检查。把过滤后的空气引入吸气瓶的培养液中，经培养后，若培养液变混，表明过滤后的空气中仍有杂菌，说明过滤系统有问题，若培养液未变混，说明空气无菌。

此法还可用于检查培养基灭菌是否彻底，取少量培养基接入肉汤中，培养后观察肉汤的浑浊情况即可。

4．根据发酵过程中的异常现象来判断是否染菌

（1） 溶解氧水平异常变化显示染菌

每一种生产菌都有其特定的耗氧曲线，当杂菌污染时，如果污染的是好气性杂菌，会使溶解氧在较短的时间内下降，甚至接近零，且长时间不能回升；当污染的是非好气菌，生产菌的代谢由于受污染而遭抑制时，会使耗氧量减少，发酵液中的溶解氧就会升高。如味精生产上受噬菌体污染时，使菌体利用的氧气量减少，DO上升。 （2） 排气中CO2的异常变化显示染菌

对特定的发酵，排气中CO2的含量变化也是有规律的。在染菌后，糖的消耗发生变化，从而引起排气中CO2含量的异常变化。

一般说来污染杂菌后，糖耗加快，CO2含量增加；污染噬菌体，糖耗减慢，CO2含量减少。

（3） 根据pH的变化及菌体酶活力的变化来判断杂菌的有无。

二 杂菌污染的原因分析

1．发酵染菌率

发酵的总染菌率是指一年内发酵染菌的批次与总投料批次数之比。即 总染菌率=发酵染菌批数/总投料批数 ×100%

发酵染菌率是指发酵罐中的染菌率。若种子罐染菌因及早发现未投入发酵罐中就不能计算入内。

2．发酵原因分析及防治措施

要防治杂菌污染，首先要知道造成污染的途径，然后对症下药，堵塞污染源，达到安全生产的目的。造成发酵污染的原因很多，现介绍如下。 根据造成污染的途径看，主要有： （1）种子带菌

在发酵前期染菌，很可能是种子带菌。种子带菌的原因主要有以下几方面

a 培养基及用具灭菌不彻底，特别是灭菌锅冷空气排放不完全，使温度达不到要求； b 菌种在移接过程中受污染。应严格无菌管理制度，合理设计无菌室，并重视人员培训，严格按无菌操作规程接种；

c 菌种在培养过程或保藏过程中受污染。应注意培养室清洁卫生，规范试管的棉塞，摇瓶的瓶口布等。

（2）无菌空气系统染菌。主要是由过滤介质的效能下降引起，包括

a 过滤介质（棉花、玻璃纤维等）被油水浸湿，失去了过滤效能；

b 突然停电时，由于发酵罐压力高于过滤器的压力，导致培养基倒流入过滤器的介质中，使之成为杂菌生长繁殖的场所。所以在遇停电时，要立即关闭发酵罐上的进气阀，再关闭排气阀；

c 过滤介质铺放松紧不均匀，空气从疏松的部位穿过，造成过滤不完全，过滤后的空气中仍带有杂菌；

d 过滤系统发生渗漏，密封性能差，造成染菌。 （3）培养基灭菌不彻底。主要原因有

a 对淀粉质原料，若搅拌时间不足，没有让淀粉与冷水充分混匀，一经加热，淀粉容易结成块状，蒸汽就不易穿入其内，致使灭菌不彻底而染菌；

b 冷空气未放尽，虽到预定压力，但达不到预定温度，致使灭菌不彻底；

c 对黏度高的培养基，若在灭菌过程中搅动不均匀，会造成受热不均，使一部分培养基灭菌不彻底。

（4） 设备管道灭菌不彻底。主要原因有

a 设备管道存在死角，使蒸汽不能有效地到达，造成染菌；

b 操作不当引起。在管道系统灭菌时，应把所有进气阀门都打开，让蒸汽均匀地进入管道，并维持一段时间。所有放气（料）阀门及进料阀门（如接种阀或加料阀）也应微开，以消除死角。

（5） 设备管道系统渗漏。可能原因有 a、罐体部位腐蚀；

b、罐中冷却用的蛇形管穿孔；

c、管路上的阀门不配套，或阀门连接方式、管路安装方法等不当。

综上所述，发酵染菌的原因很多，我们应根据发酵的现象，合理地分析污染的原因，并提出相应的挽救措施，表2-3-1~表2-3-3是前人在这方面的一些经验总结。

表2-3-1 根据发酵时期来分析原因 染菌的现象 污染的原因分析 挽救措施 发酵早期染菌（接1、种子带菌 1、染菌的种子灭菌后弃之 种后12~24小时） 2、培养基或设备灭菌不彻底 2、加强灭菌，加强设备的检修

3、轻者加大接种量，重者补料后灭菌，再重新接种

发酵后期染菌 1、操作过程中，特别是中间4、轻者照常发酵

补料时带入 5、重者提前放罐 2、设备渗漏或空气过滤系统污染

表2-3-2 根据染菌的类型来分析原因 染菌的现象 芽孢杆菌、霉菌 不耐热的细菌 一些G—菌（在葡萄糖酚红培养基中菌落呈绿色）

表2-3-3 根据染菌的范围来分析原因 污染的原因分析

1、 培养基灭菌不彻底 2、 管道设备灭菌不彻底 1、 种子带菌 2、 设备渗漏 由水带入，一般由设备渗漏或冷却器穿孔引起

挽救措施

1、 加强培养基的灭菌及管道死角的灭

菌工作

2、 加强设备检修 3、 轻者加大接种量，重者补料后灭菌，

再重新接种

染菌的现象

大批发酵罐染同一种菌 部分发酵罐染菌 个别发酵罐染菌

污染的原因分析 空气过滤器除菌不净

菌种带菌或补料时染菌或其它操作不当带入杂菌

一般是设备损坏，如阀门的渗漏、罐体的破损等

挽救措施

1、保持过滤介质干燥 2、介质铺放均匀 严格执行无菌操作 加强设备的检查和维修

根据对多个厂家的综合分析，造成杂菌污染的原因以设备问题为主，如设备的渗漏、管道不严密、设备中存在死角、空气过滤系统失效等；其次是种子（主要是二级种子）染菌，而培养基灭菌不彻底造成的染菌极少发生。

第二节 噬菌体的污染和防治

在许多发酵生产中，如氨基酸发酵、丙酮-丁醇发酵和抗生素发酵中常常遇到噬菌体（bacteriaphage）污染，引起溶菌，并随之出现发酵迟缓或停止发酵等异常现象。本节主要介绍噬菌体污染的特征，检查方法及防治措施。

一 噬菌体污染的特征

1 发酵液光密度上升缓慢，甚至下降，肉眼可见发酵液逐渐变清； 2 耗糖速度缓慢或停止，产物生成量少或不增加，发酵液中残糖高； 3产生大量泡末，发酵液呈粘稠状； 4 菌体不规则，甚至出现畸形。

二 噬菌体的检查方法

1．双层琼脂平板法

（1） 双层琼脂平板的制备：先用7~8mL 2%的琼脂培养基作底层，凝固后，加入3~4mL 冷

至45℃的1%琼脂上层培养基（其中含0.2mL发酵菌种悬液和0.1mL待检发酵液），让其平整凝固；

（2） 在发酵菌的适宜温度下培养，若是细菌，一般培养16~20小时。 （3） 检查有无透明的噬菌斑。 2．液体培养检查法

将培养基、发酵菌种及待检发酵液三者混合，培养后观察培养液是否变清。 3．斑点试验法

先制备好涂布有发酵菌种的平板，再用接种环或无菌吸管取少许发酵液在平板上点种，培养后，观察是否有噬菌斑。

4．玻片快速法

将发酵菌种、发酵液和少量琼脂培养基（含0.5~0.8%的琼脂）混匀后涂布于无菌载玻片上，经短期培养后，在低倍镜下观察是否有噬菌斑。

三 噬菌体的防治

发酵液中污染噬菌体，不外乎有两种原因。

1 菌种本身带噬菌体，特别是溶源性噬菌体，对这种菌种，一经发现，应立即弃去。 2 生产的环境中有噬菌体。 因此，可采取相应的预防措施： 1 决不使用可疑菌种；

2 清除周围环境中存在的噬菌体。能灭菌的灭菌，能消毒的消毒，搞好清洁卫生工作； 3 选育抗噬菌体菌株

4 轮换使用菌株。因为一个菌株用的时间一长，就有可能出现该菌种的噬菌体。 5 注意通气质量。取风口应设在30~40米的高空，空气过滤器要保证质量；

四 发酵液污染噬菌体后的抢救措施

如果一旦发现噬菌体污染，应及时采取补救措施

1．若在发酵前期污染了噬菌体，因为此时耗糖还不多，常用以下措施 （1） 补加抗性种子，并根据发酵液中的营养多少，适当补加营养物质； （2） 补加约50%的已培养至对数期的正常的发酵液，再进行发酵；

（3） 若噬菌体轻度污染，菌体仍能较正常地生长，并积累代谢产物，则可照常进行发酵，

若污染严重，则用加热法（70~80℃）灭活噬菌体，放罐后重消毒。

2．若在发酵中后期污染了噬菌体，且比较严重，则应提前放罐，尽快提取产物。发酵罐、管道、洗涤水及用具均应彻底灭菌，防止噬菌体扩散而造成新的污染。并及时改用抗该噬菌体的生产菌株。

3．对某些产品可用药物防治。选择能特异性地抑制噬菌体而对生产菌株及其发酵产物的积累和提取均无影响，又符合卫生要求、对人无毒的药物。尽可能选活性高（用药量少）、价格低的药物。

如在谷氨酸发酵中常选用的药物有：

（1） 螯合剂。如植酸盐（0.05~1%），柠檬酸盐（0.2~0.5%），草酸盐（0.2~0.5%），三聚

磷酸盐（0.5~1%）等可抑制噬菌体的吸附或阻止DNA的注入；

（2） 表面活性剂。0.01~0.2%的聚乙二醇单酯、聚氧乙烯烷基醚、土温20、土温60等。

主要作用于寄主细胞表面，抑制噬菌体在细菌上的吸附。

（3） 抗菌素。如1ug/mL的金霉素、四环素、氯霉素等抑制噬菌体蛋白质的合成； （4） N-脂酰氨基酸。是一类具有16~18个碳原子的衍生物。如20ug/mL的N-棕榈酰-L-

谷氨酸，其作用机制是抑制噬菌体核酸的复制或子代噬菌体的成熟。

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