异育银鲫非O1_非O139群霍乱弧菌的分离及鉴定

第35卷第2期2013年2月

中国预防兽医学报

ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine

Vol.35，No.2Feb.2013

doi:10.3969/j.issn.1008-0589.2013.02.12

异育银鲫非O1/非O139群霍乱弧菌的分离及鉴定

秦

蕾*，徐

静，张晓君

(淮海工学院海洋学院，江苏连云港222005)

摘要：为鉴定引起异育银鲫发病的疫情的病原，本研究从病鱼体内分离到细菌分离株，经动物回归试验证

明为导致异育银鲫发病的致病原。对病原菌株进行形态学、生理生化测定以及16SrDNA序列分析，显示该菌株与霍乱弧菌(Vibriocholerae)表型特征一致，而且在系统发育树中也是与霍乱弧菌相聚类，两者16SrDNA序列相似性高达99.93%。综合表型特征与基因序列分析的结果表明，该病原菌株应归属于霍乱弧菌。血清型鉴定为非O1/非O139群霍乱弧菌。药物敏感性试验结果显示该株霍乱弧菌对喹诺酮类、头孢类、氨基糖苷类、大环内酯类，四环素类以及β-内酰胺类等药物敏感。

关键词：非O1/非O139群霍乱弧菌；异育银鲫；表型特征；16SrDNA；药敏试验中图分类号：S852.61

文献标识码：A

文章编号：1008-0589(2013)02-0130-04

Isolationandidentificationofnon-O1/non-O139

Vibriocholeraefromgibelcarp

QINLei*,XUJing,ZHANGXiao-jun

(CollegeofMarineScience,HuaihaiInstituteofTechnology,Lianyungang222005,China)

Abstract:Aninfectiousdiseaseoccurredinagibelcarpfarmin2010.Thedominantbacteriawereisolatedfromdiseasedfishandprovedtobecausalagentofthediseasebyexperimentalinfectioningibelcarp.ConventionalphysiologicalandbiochemicaltestsshowedthattheisolateshadphenotypiccharacteristicsinaccordingwithreferencestrainofVibriocholerae.And16SrDNAsequencewasanalyzedrevealingthatitwasmostcloselyrelatedtoV.choleraewith99.93%similarity.Therefore,theisolateswerefinallyidentifiedasV.cholerae.Antibioticsusceptibilitytestingshowedthattheisolatesweresensitivetoquinolones,cephems,aminoglycosides,macrolide,tetracyclinesandβ-lactams.

Keywords:non-O1/non-O139Vibriocholerae;gibelcarp;phenotypiccharacteristics;16SrDNA;antibioticsusceptibilitytesting

近几年随着异育银鲫养殖业的不断发展，各种疾病也日益增多。已鉴定的主要有嗜水气单胞菌[1]，温和气单胞菌[1-2]、类志贺邻单胞菌[3]和鲍曼不动杆菌[4]等病原菌感染所致的细菌性疾病，以及由类疱疹病毒所致的上皮瘤病[5]和粘孢子虫等引发的寄生

*Correspondingauthor

虫病[6]。2010年6月，江苏射阳一家养殖场的异育银鲫发生疾病。病鱼上下颌、鳍基部和鱼体两侧充血；严重者鱼腹部体表有点状出血，肛门红肿。解剖发现，病鱼肝脏颜色变淡、淤血；脾脏肿大呈紫黑色；部分鱼肠壁充血。该病在一个养殖池的月累

收稿日期：2011-12-30

基金项目：江苏省海洋生物技术重点建设实验室开放课题(2008HS018)；淮海工学院博士科研启动基金项目(KQ07051)作者简介：秦蕾(1978-)，女，山东烟台人，副教授，博士，主要从事水产动物疾病的防治研究.*通信作者：E-mail：qinlei1978@

第2期秦蕾，等.异育银鲫非O1/非O139群霍乱弧菌的分离及鉴定131

积死亡率高达45%。目前关于霍乱弧菌(V.cholerae)感染异育银鲫的报道还尚未见到。本实验首次对该病的病原进行了较为详细地研究，为异育银鲫霍乱弧菌病的防治提供实验依据。

乱弧菌多价诊断血清，取少量培养的菌株与血清混匀，然后轻轻摇动玻片。于1min内呈明显凝集者判定为阳性；呈均匀浑浊者为阴性。同时设生理盐水作对照。1.6

药物敏感性测定

采用K-B琼脂法[7]对菌株

SX-1进行药物敏感性测定，试验重复3次，结果判定根据药敏纸片的抑菌范围解释标准进行。

1

1.1

材料和方法

主要试剂

TSB培养基、细菌微量生化鉴定管

购自北京陆桥技术有限责任公司；引物、dNTP和

2

2.1

结果

水浸片观察可见，在所

TaqDNA聚合酶购自上海生工生物工程技术服务有

限公司；脱纤维羊血购自杭州新锐生物工程有限公司；O1群和O139霍乱弧菌多价诊断血清购自宁波天润生物药业有限公司；药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司。1.2

病鱼检查及病原的分离

自江苏射阳一家发病

的异育银鲫养殖场随机采取7条症状明显的病鱼，取其鳃、体表病灶和内脏等器官组织进行水浸片检查。另取4条病鱼做病原分离，鱼体消毒后无菌解剖，从体表病灶和肝脏等组织取样划线接种TSB平板，28℃培养24h，从优势菌落中选取单个菌落，再次平板划线获得纯培养菌株。同时将分离菌株接种TCBS和血琼脂平板进行培养观察。1.3

动物回归试验

试验用健康异育银鲫平均体长

19cm，20尾为一组，每组设一平行，水温28±1℃，循环水饲养，试验前暂养1周。将分离株用麦氏比浊仪制成9×108cfu/mL的新鲜菌悬液。将鱼麻醉(MS-222)后每尾腹腔接种0.3mL的菌液。对照组同时注射同体积无菌生理盐水。试验期间每天早晚各投饵一次，共进行14d。对刚死亡的病鱼立即进行细菌分离。1.4

病原菌的鉴定

0.5%的磷钨酸负染做透射电

镜形态观察。采用手工与细菌微量生化鉴定管鉴定相结合的方式对菌株进行生理生化鉴定，每项测试重复两次。为进一步明确菌株的分类地位，对其进行16SrDNA序列分析。用细菌通用引物27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492r(5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')进行16SrDNA序列的扩增。扩增产物由Invitrogen公司测序。测序结果比对分析，根据比对结果选取相关菌株的序列，用Mega4软件构建系统发育树，Bootstrap1000次循环检验发育树各分支的置信度。1.5

血清型鉴定

在玻片上加1滴O1群、O139霍

病鱼检查及病原分离

有被检病鱼体内均存在有大量运动活泼的细菌，其形状呈弧形；同时在一条病鱼的鳃中发现有少量粘孢子虫寄生。病原分离共得到5株优势细菌(命名为SX)，经TSB培养呈现出相同的菌落形态：圆形、隆起、半透明、边缘整齐和光滑。将5株菌分别接种到TCBS培养，都能形成黄色菌落；经血琼脂培养均发生β溶血。2.2

动物回归试验

将SX分离株人工感染鱼5d

内实验组的鱼死亡率即达100%。感染发病的鱼表现出与自然发病时相似的临床症状，而且从感染发病死亡的鱼体内均可以重新分离到优势单一的菌株SX。在试验进行的14d内，对照组鱼无发病和死亡。2.3

病原菌株的形态和生理生化特性

5株菌具有

一致的表型特性：革兰氏阴性，弧形，端生单鞭毛，无荚膜和芽孢，大小为1.3μm～0.9μm×0.2μm～0.4μm(图1)；运动活泼；氧化酶和接触酶试验阳性；能液化明胶；发酵葡萄糖产酸不产气；发酵半乳糖；不发酵棉籽糖，阿拉伯糖，乳糖，甘露糖，果糖，蔗糖，山梨醇，肌醇，侧金盏花醇，七叶苷和水杨苷；甲基红试验阳性，V-P试验阴性；不产H2S；产吲哚；精氨酸双水解酶和脲酶试验阴性，赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶和DNA酶试验阳性；对O/129敏感；霍乱红试验阳性(表1)。通过形态和生理生化特征鉴定，5株分离菌应为同一种细菌。参照《常见细菌系统鉴定手册》、《伯杰氏鉴定细菌学手册》和《鱼类和其他水生生物实用细菌鉴定手册》，发现该菌株与霍乱弧菌(V.cholerae)表型特性相符。2.4

病原菌株的16SrDNA序列分析

菌株SX的

16SrDNA序列扩增长度为1423bp(JN555611)。在GenBank中进行Blast显示该菌株与霍乱弧菌(V.cho-

lerae)相似性较高；经EzTaxonServer2.1进一步比

132中国预防兽医学报2013年

对显示其相似性高达99.93%。结合比对结果所构建的系统发育树表明，菌株SX-1与霍乱弧菌聚类在一起，具有较近的亲缘关系(图2)。

100

100

80

76

100

100

99

100

97

V.harveyiatcc14126T(X74706)V.harveyi(HM008702)V.alginolyticus(X74690)

V.alginolyticusATCC17749T(X56576)V.vulnificusATCC27562T(X76333)V.vulnificus(X74727)V.anguillarum(EF467287)

V.anguillarumATCC19264T(X16895)V.ordalii(EU107976)

V.ordaliiATCC33509T(X74718)V.mimicusATCC33653T(X74713)V.mimicus(DQ068934)V.cholerae(EF684899)SX-1

V.choleraeCECT514T(X76337)

A.hydrophilaATCC7966T(CP000462)

图2根据16SrDNA序列所构建的菌株SX的系统发育树Fig.2Phylogenetictreebasedonthe16SrDNAsequences

2.5

图1菌株SX的电镜照片(Bar=200nm)

Fig.1ElectronmicrographofstrainSX(Bar=200nm)

血清型菌株SX与O1群、O139霍乱弧菌多

价诊断血清不发生凝集，为非O1/非O139群霍乱弧菌。2.6

药物敏感性

菌株SX对氟哌酸，卡那霉素，

萘啶酸，罗红霉素，利福平，美满霉素，菌必治，丙氟哌酸，恩诺沙星，先锋霉素V，头孢他啶，左氟沙星和阿莫西林等抗生素敏感(表2)。

表1分离菌株的生理生化特性

Table1Physiologicalandbiochemicalcharacteristicsof

isolatesfromdiseasedCarassiusauratusgibelio

SX霍乱弧菌*实验项目

(n=5)V.choleraeTest

--革兰氏Gram

++运动性

Motility

++氧化酶

Oxidase

++接触酶

Catalase

--葡萄糖产气Gasfromglucose

++葡萄糖产酸

Acidfromglucose

-nd棉籽糖

Raffinose

--阿拉伯糖Arabinose

--乳糖Lactose

-nd果糖

Fructose

-d甘露糖

Mannose

-d蔗糖

Sucrose

--山梨醇

Sorbitol

++半乳糖

Galactose

--肌醇

Inositol

nd-水杨苷

实验项目Test

七叶苷Aesculin侧金盏花醇AdonitolDNA

硝酸盐还原Nitratereduction吲哚产生

Indoleproduction明胶液化

Gelatineliquefication甲基红试验MRVP试验VPtest

鸟氨酸脱羧酶

Ornithinedecarboxylase精氨酸双水解酶Argininedihydrolase赖氨酸脱羧酶Lysinedecarboxylase脲酶Urease产H2S

H2SproductionO/129(10μg)SensitivitytoO/129O/129(150μg)SensitivitytoO/129霍乱红反应

SX霍乱弧菌*(n=5)V.cholerae

nd--+++++-+-+--SS+

nd+++++d+-+--SS+

3讨论

霍乱弧菌能引起人类的急性肠道传染病，其中仅O1和O139群能引起霍乱流行，而非O1/非O139群霍乱弧菌则不引起发病或仅引起散发性腹泻病例和肠道外感染[8]。然而近几年来关于非O1群霍乱弧菌感染水产动物的报道却日益增多，引起普遍关注。非O1群霍乱弧菌感染最早是由Muroga等在日本野生的香鱼中发现[9]，此后该病多次发生并造成香鱼大规模的死亡[10]。此外，在中国对虾[11]、南美白对虾[12]、金鱼[13]、暗纹东方鲀[14]和泥鳅[15]等水产动物中也都陆续发现了该菌感染所致的疾病。本实验从患病异育银鲫中分离得到优势菌株，经电镜观察、常规生理生化测试、16SrDNA序列分析以及血清型等测定，综合考虑将其鉴定为非O1/非O139群霍乱弧菌。动物回归试验结果证明该菌株符合Koch法则的要求，因此可以确定霍乱弧菌就是导致此次异育银鲫发病死亡的致病原。异育银鲫霍乱弧菌病的发现，扩大了非O1群霍乱弧菌感染宿主的范围，表明霍乱弧菌感染也会对异育银鲫养殖业造成威胁，应在养殖生产中重视。

非O1/非O139群霍乱弧菌广泛分布于自然界水体中，是一种机会致病菌，感染的发生与养殖水体环境恶化密切相关。

因此，在养殖过程中要注重

Note:+:Positive;-:Negative;nd:Nodata;d:Variableresults;*From

SystematicIdentificationManualofCommonBacteria,Bergey'sManualofDeterminativeBacteriology,BacteriafromFishandOtherAquaticAnimals:apracticalidentificationmanual

第2期秦蕾，等.异育银鲫非O1/非O139群霍乱弧菌的分离及鉴定133

Table2

抗生素Antibiotics

吡哌酸PipemidicAcid麦迪霉素Midecamycin新生霉素Novobiocin氟哌酸Fluperacid卡那霉素Kanamycin萘啶酸Nalidixicacid阿奇霉素Azithromycin新霉素Neomycin

罗红霉素Roxithromycin利福平Rifampicin

乙酰螺旋霉素Acetylspiramycin美满霉素Minocycline庆大霉素Gentamicin

表2菌株SX的药敏试验结果(n=3)

AntibioticsusceptibilitytestingofstrainSX(n=3)

敏感性Sensitivity

IIRSSSIISSRSI

抗生素Antibiotics

菌必治Ceftriaxone丙氟哌酸Ciprofloxacin吉他霉素Kitasamycin洁霉素Jiemycin

恩诺沙星Enrofloxacin先锋IVCefalexin先锋VCephazolin头孢他啶Ceftazidine万古霉素Vancomycin

磺胺甲基异恶唑Sulfafurazole左氟沙星Levofloxacin阿莫西林Amoxicillin链霉素Streptomycin

抑菌环直径Diameteroftheinhibitionzone(mm)

39.2±1.733.3±0.614.0±1.0

031.3±1.216.2±0.931.0±1.732.3±1.5

0046.3±0.622.7±1.211.3±1.5

敏感性Sensitivity

SSIRSISSRRSSI

抑菌环直径Diameteroftheinhibitionzone(mm)

19.3±0.614.3±1.8

034.8±1.223.7±1.540.3±2.114.7±1.212.0±1.741.3±1.527.2±1.1

034.7±1.614.4±0.9

Note:S:susceptible;I:intermediatesusceptible;R:resistant

从减少放养密度、改善水质以及切断病原传播途径等方面着手，建立健康养殖模式，做好疾病的预防工作，从而避免霍乱弧菌感染所带来的损失。

在当前养殖条件下抗生素仍是鱼病防治的主要手段。选择合适的抗生素对症用药不仅可以有效防治疾病，而且能够避免因过度用药和滥用药而造成的耐药菌株产生、鱼体药残以及水环境污染等一系列问题。药物敏感性试验结果显示，该株霍乱弧菌对氟哌酸、卡那霉素、萘啶酸、罗红霉素、利福平、美满霉素、菌必治、丙氟哌酸、恩诺沙星、先锋霉素V、头孢他啶、左氟沙星和阿莫西林等抗生素敏感，为异育银鲫霍乱弧菌病防治过程中抗生素的选择提供了参考。

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(本文编辑：彭永刚)

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